Bu çalışma National Science Foundation tarafından IOS-1256565 ve AWS için IOS-1557638 tarafından finanse edildi. Patricia Wittkopp&#39;a ve bu yazının daha önceki bir sürümüne ilişkin yararlı yorumları için üç anonim gözden geçirenimize teşekkür ediyoruz.

1. Numune Montajı NOT: Görüntülemeden önce ölü sinekleri% 70 etanol içinde suda saklayın. <ol><li> 60 mm x 15 mm Petri kabında kaynar suda çözünen% 1.25 agara 10 mL koyun ve ayarlanmasına izin verin. </li><li> Bir diseksiyon mikroskopu altında, jelin yüzeyinde ~ 20 mm, 2 mm genişliğinde, 1 mm derin oluk yapmak için bir çift ince noktalı forseps kullanın. İnce forseps kullanarak, sinekin dorsal yüzü jelin üzerine çıkıntı yapacak şekilde yetişkin bir sinekin ventral yüzünü oyuğa gömer. NOT: Jelin gevşemesi, numuneye zarar vermeden kolayca yeniden konumlandırılmasını sağlar. Aynı oluk birden çok numune için kullanılabilir, ancak kirli, parçalanmış ve zamanla kullanılamaz hale gelecektir. Kullanıcı daha sonra aynı jöle içinde bir başka oluk daha yapabilir. Her plaka, ~ 200 sinek çekmek için kullanılabilir. </li><li> Mumu kütikülündeki herhangi bir ışık yansımasını azaltmak ve kanat hasarını önlemek için sudaki% 70 etanol içindeki numuneyi tamamen örtünÖrnek muamelesi. </li></ol> 2. Mikroskop Kurulumu NOT: Görüntüler, diseksiyon kapsamı, aktarılan ışık tabanı, dijital kamera ve gooseneck soğuk ışık kaynağı bilgisayar çalıştıran bir görüntü yakalama kontrol yazılımı kullanılarak eklenir. Yazılım talimatları, ImageJ 45&#39;i içeren açık kaynaklı bir yazılım olan Micro-Manager v1.4.20 44&#39;e özeldir. <ol><li> Mikroskopu, dijital kamerayı, çift gooseneck soğuk ışık kaynağını ve bilgisayarı açın. </li><li> Bir Micro-Manager penceresi ve bir ImageJ penceresi açmak için görüntü yakalama yazılımını çalıştırın. ImageJ penceresinde, tüm görüntüleri 8 bit olarak ayarlamak için &quot;Görüntü&quot;&gt; &quot;Tür&quot;&gt; &quot;8-Bit&quot; seçeneğini tıklayın. Kameradan gerçek zamanlı bir önizleme gösteren bir &quot;Snap / Live&quot; penceresi açmak için Micro-Manager penceresinde &quot;canlı&quot; seçeneğini tıklayın. <ol><li> Ne olursa, &quot;Snap / Live&quot; penceresinin boyutunu en üst düzeye çıkarınyapanlara. Micro-Manager penceresinin &quot;Contrast&quot; sekmesindeki açılan &quot;Display mode&quot; menüsünde &quot;Grayscale&quot; seçin. </li></ol></li><li> Soğuk ışık kaynağını maksimum yoğunluğuna getirin ve her gooseneck ipuçlarını sahneden yaklaşık 120 mm (bir tanesi solda ve bir tanesi sağda) konumlandırın. NOT: Kullanıcılar dairesel bir aydınlatıcı kullanabilir, ancak bu sinek karın çevresinde bir yansıma ışığı halkası oluşturabilir. </li><li> Manuel olarak mikroskop büyütme değerini 60X yapın, böylece sahne alanı sahnede yaklaşık 3 mm çapında bir alan yakalar. </li><li> Sahneye 2 mm&#39;lik bir mikrometre yerleştirin (gerekirse arka planı beyaza çevirin). Canlı önizlemeye bakarken, sahne mikrometresine odaklanın ve &quot;Pozlama&quot; kutusundaki ms cinsinden pozlama süresini girerek Mikro-Yönetici penceresindeki pozlamayı ayarlayın. </li><li> Kamerayı mekansal olarak kalibre etmek için, &quot;düz çizgi&quot; aracını seçin.O ImageJ pencere ve sahne mikrometresi uzunluğu bir çizgi çizin. &quot;Ölçeği Ayarla&quot; penceresini açmak için ImageJ penceresinde &quot;Analiz et&quot;&gt; &quot;Ölçek Yap&quot; ı tıklayın, &quot;Bilinen mesafe&quot; kutusuna mikrometrenin uzunluğunu μm olarak girin ve &quot;Birim uzunluğu&quot; bölümüne &quot;μm&quot; girin. kutu. <ol><li> Bakınız &quot;Ölçeği Ayarla&quot; penceresinde ölçeği &quot;piksel / μm&quot; olarak görüntüler. Ölçeği not edin ve &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. </li></ol></li><li> Sahne mikrometresinin bir görüntüsünü yakalamak için &quot;Snap / Live&quot; penceresinde &quot;Stop&quot; (Durdur) ve ardından &quot;Snap&quot; (Sabitleme) düğmesini tıklayın. </li><li> Gerekirse görüntüleri tekrar mekansal olarak kalibre etme yeteneğinden emin olmak için görüntüyü 8 bitlik gri tonlamalı bir TIFF olarak kaydedin. ImageJ penceresinde &quot;Dosya&quot;&gt; &quot;Farklı Kaydet&quot;&gt; &quot;Tiff ...&quot; seçeneğini tıklayın. Dosyayı tarayıcıda nereye kaydedeceğinizi belirtin, dosyayı adlandırın ve &quot;Kaydet&quot; i tıklayın. </li><li> Sahneyi siyaha çevir ve yerini değiştirSahnede agar içine monte edilmiş bir sinek tutan bir Petri tablası (adım 1.1-1.2). </li><li> Mikroskopta bakınız ve pıgmenti modelini en iyi görmek için dorsal orta hattın düz olduğunu doğrulamak için sinekleri konumlandırın. Karın görünümünün engellenmemesi için herhangi bir kanat ve uzantıları hareket ettirin. Pigmentli kütikül (a2-a5) görünmüyorsa, karnın yanal olarak sıkıştırın (buna rağmen, genellikle sinirlenmek için sineklerin% 70 etanol içinde depolanan sinekler). NOT: Sineği konumlandırırken kullanıcının daha düşük bir büyütme (20X) kullanması gerekebilir. Devam etmeden önce büyütme 60X değerine geri getirilmelidir. </li><li> Sinek karnına elle odaklanın. Dorsal abdomen üzerindeki gölgeleri ve yansımayı en aza indirgemek için ışık kaynağının ipuçlarını elle ayarlayın. </li><li> Bilgisayar ekranındaki canlı önizlemeye bakarken ve Micro-Manager penceresinin &quot;Contrast&quot; sekmesindeki piksel değer histogramını kullanırken,Önizleme görüntüsünün piksel değerlerinin aralığını en yükseğe çıkarmak için adım 2.4&#39;te açıklandığı gibi pozlamayı ayarlayın. </li><li> Sinek ve Petri kabını çıkarın ve sinek gibi aynı pozisyonda görüş alanına ortalanmış bir voltaj ölçerine bağlı bir LED (430-660 nm spektral çıktısı) ile değiştirin. LED ve voltaj ölçeri, ışık ölçer 46 olarak kullanın ve LED&#39;i vuran ışık (~ 125 mV) tarafından üretilen voltajı kaydedin. NOT: LED ve gerilim ölçer, ışık düzeylerinin tek bir denemedeki çoklu görüntüleme oturumlarında sabit kalmasını sağlamak için kullanılır. </li><li> Deney süresince, ışık kaynağının konumunu veya yoğunluğunu, mikroskopun büyütülmesini veya kameranın maruz kalmasını daha fazla değiştirmeyin. </li></ol> 3. Numune Görüntüleme <ol><li> Bir karın (adımları 1.1-1.3) monte edilmiş bir sinek tutan bir Petri kabı siyah mikroskop stage.Adjust konumda böylece sinek üçüncü ve fourt2.9. Adımda tarif edildiği gibi abdominal segmentler görülebilir ve dorsal orta çizgi düzdür. Devam etmeden önce büyütmede 60x olduğundan emin olun. </li><li> Mikroskopu, üçüncü ve dördüncü dorsal abdominal tergitlerin odaklanacağı şekilde elle odaklama. Adım 2.6&#39;da anlatıldığı gibi bir görüntüyü 8-bit gri tonlamalı bir TIFF olarak elde etmek için görüntü yakalama yazılımını kullanın. NOT: Görüntü renkle alınabilir ve daha sonra analiz için gri skala dönüştürülebilir. </li><li> 2. adımda açıklandığı gibi resmi &quot;SESH000_sampleID.tiff&quot; olarak kaydedin. NOT: Burada [SESH] sabittir, oturum numarası [000] ve değişkentir, ancak üç basamaklı olmalı ve [sampleID] kullanıcının isteği ne olursa olsun, ek bir alt çizgi (_) karakteri içermemeli ve Sabit uzunlukta olmalı. [SampleID], pigmentasyon verilerinin ( örn. Sıcaklık veya soy) analizinde kullanılan faktörlerin ayrıntılarını içermelidir; ayırt edici olmayan alfabeCal karakteri, örneğin kısa çizgi (-). Bu, bu faktörlerin standart istatistik yazılımını kullanarak [sampleID] dışında kolayca ayrıştırılmasını sağlar. </li><li> Petri kabını sahneden çıkarın ve sineği bir sonraki numune ile değiştirin. Aydınlatma seviyelerini, büyütme veya pozlamayı daha fazla ayarlamadan tüm numuneler görüntülene kadar adım 3.1-3.3&#39;ü tekrarlayın. </li></ol> 4. Birden Fazla Oturum Arasında Görüntüleme <ol><li> Görüntülerin birden fazla oturumda ele alınması gerekiyorsa, oturum yoğunluğunu, pozlamayı ve büyütmeyi oturumlar boyunca koruyun. Her oturumun başında kameranın mekansal kalibrasyonunu (adım 2.4) ve sahnedeki ışık yoğunluğunu (LED / voltaj ölçeri, adım 2.12 ile ölçülen şekilde) kontrol edin. </li><li> Gerekirse, görüntüleri tekrar mekansal olarak kalibre etme yeteneğinden emin olmak için sahne mikrometresinin bir görüntüsünü yakalayın ve kaydedin (adım 2.5-2.7). </li><li> En az 15 kontrol numunesi kullanın ve her seansda rasgele yeniden görüntü oluşturun.W oturum etkilerinin tespiti ve ortadan kaldırılması için. Oturumlar arasındaki yinelenen kontrol numunelerinin aynı [örnek kimlik] olduğundan farklı [SESH000] olduğundan emin olun. NOT: Kontrol numuneleri, deney numuneleri ile aynı şekilde toplanan, depolanan ve monte edilen sineklerdir, ancak seanslar boyunca yeniden imgelenmektedir. Kontrol numunelerinin kesin sayısı, kullanıcının deney düzeneğine bağlı olacaktır. Daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakın. </li></ol> 5. Görüntü Analizi NOT: Görüntü analizi ImageJ 45&#39;te yapılır ve ek bir dosya olarak verilen &quot;Pigmentation.ijm Ölçümü&quot; makrosunu kullanır. <ol><li> Analiz edilecek tüm görüntüleri aynı klasöre yerleştirin. </li><li> ImageJ&#39;yi başlatın ve dosya tarayıcısında &quot;Pigmentation.ijm Ölçümü&quot; nü seçerek &quot;Eklentiler&quot;&gt; &quot;Makro&quot;&gt; &quot;Çalıştır&quot; ı tıklayarak &quot;Pigmentation.ijm Ölçümü&quot; makrosunu çalıştırın ve &quot;açık.&quot; NOT: Sonraki tüm adımlar makro içinde bulunur. Her adım, ayrı bir makro komuttur. </li><li> &quot;İşlemlerin Zorunlu Oldu&quot; iletişim kutusu açılır ve &quot;Görüntülerin depolandığı klasörü seç&quot; yazısı görüntülenir. &quot;Tamam&quot; a tıklayın ve resimleri içeren klasörü seçmek için dosya tarayıcıyı kullanın ve ardından &quot;seç&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> &quot;Verilerin saklanmasını istediğiniz klasörü seçin&quot; şeklindeki bir &quot;İşlem Gerekli&quot; iletişim kutusu açılır. &quot;Tamam&quot; a tıklayın ve pigmentasyon profillerini kaydetmek için istediğiniz klasörü seçmek için dosya tarayıcısını kullanın. &quot;Seç&quot; i tıklayın. </li><li> &quot;Örnek kimliğinizde kaç tane karakter var?&quot; Sorusuyla ilgili bir iletişim kutusu açılır. Veri girişi kutusuna, adım 3.3&#39;te belirtildiği gibi [SampleID] içindeki karakter sayısını girin ve &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. </li><li> &quot;Yatırım Getiriniz ne kadar geniş?&quot; Sorusu ile bir iletişim kutusu açılır. Veri girişi kutusuna, anterior-(Yeşil dikdörtgen, Şekil 1G , Şekil 2A ve 2A &#39;). &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. Varsayılan 20 pikseldir. NOT: Tüy ve kılların neden olduğu gürültüyü azaltmak için pigmentasyon profili, çizgi yerine kütikül şeridinde okunur. Bu şeridin genişliği resmin çözünürlüğüne bağlı olacaktır, ancak karnın genişliğinin ~ 1 / 20&#39;si piksel olarak olmalıdır. </li><li> Makronun ilk sinek görüntüsünü açacağına ve bir sonraki sinekte (&quot;Hayır&quot; ı tıklayın) devam etmek için mevcut sinek miktarını ölçmek (&quot;Evet&quot; tıklayın), yoksa bir sinek Makroyu tıklayın (&quot;İptal&quot; i tıklayın). </li><li> &quot;Dorsal karın orta çizgisini ANTERIOR&#39;dan POSTERIOR&#39;a tanımlayın&quot; şeklinde bir diyalog kutusunun açılacağını unutmayın. &quot;Düz çizgi&quot; aracı zaten seçilmiş olacaktır. Anteriordan posteriora bir çizgi çizerDorsal karın orta çizgisini tanımlamak için. &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. Bakınız Şekil 2A ve 2A &#39;, sarı çizgi. NOT: Bu, resmin yönünü değiştirmek için, dorsal orta çizginin ekranda yatay olarak uzanması, sol ön kısım ise sonraki adımları kolaylaştırmak için kullanılır. </li><li> Not: &quot;Tergite 4&#39;ün POSTERIOR kenarını pigment bandının hemen arkasında tanımlayın&quot; şeklinde bir iletişim kutusu açılır. &quot;Düz çizgi&quot; aracı zaten seçilmiş olacaktır. Çizginin (beyaz bir kare ile işaretli) merkezinin pigment bandının (kütikül a5) arka kenarına sadece posterior olarak oturacağı şekilde, arka orta çizgiden sağ yanal kenara doğru bir çizgi çizin. &quot;Tamam;&quot; ı tıklayın. Bkz. Şekil 2A ve 2A &#39;, kırmızı çizgi. NOT: R yazısı pigmentleme profilinden pigment bandının arka kenarını otomatik olarak algılar. </li><li> Bir diyalogunKutusu açılır ve &quot;Tergite 4&#39;ün ANTERIOR kenarını pigmentli kütikülün ön kenarında (a2) tanımlayın&quot; şeklinde bir açıklama yapacaktır. &quot;Düz çizgi&quot; aracı zaten seçilmiş olacaktır. Çizginin merkezi (beyaz bir kare ile işaretli), pigmentli kütikülün (kütikül a2) ön kenarına oturacak şekilde, ön orta çizgiden sağ yan kenara bir çizgi çizin. &quot;Tamam;&quot; ı tıklayın. Bakınız Şekil 2A ve 2A &#39; , cam göbeği çizgi. NOT: R yazısı, bu noktayı, tergitin pigmentli manikürinin ön kenarı olarak tanımlayacaktır. Görüntü üzerinde makro, pigmentasyon profilinin okuduğu ilgi bölgesi (ROI) gösterecektir (yeşil dikdörtgen, Şekil 2A ve 2A &#39;, Şekil 2B ve 2B &#39; de büyütülmüştür). Makro, ROI için pigmentasyon profilini gösteren ikinci bir pencere açar (Şekil.<html> E 2C ve 2C &#39;), burada x ekseni, profilin arka kenarından gelen piksel sayısı olarak ifade edilen konumdur ve y ekseni, her konumdaki ortalama piksel değeridir. </li><li> Makro tarafından açılacak pigmentasyon profilinin grafiğini görüntüleyin. Gerektiğinde, pigmentasyon profilini etkileyecek herhangi bir yapı ( örn. Kıllar) içermemesi için ROI&#39;nın konumunu ayarlamak için profil penceresinde &quot;Canlı&quot; yı tıklayın. Profil tatmin edici olduğunda, &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. </li><li> Tergite 3 için 5.8-5.11 adımlarını tekrarlayın. NOT: Makro, pigmentasyon profillerini her biri &quot;SESH000_samplename_TX_profile.csv&quot; adlı iki CSV dosyası olarak dışa aktarır; burada [SESH000_samplename], resim adıdır ve [TX] üçüncü ve dördüncü tergitler için sırasıyla T3 veya T4&#39;tür. </li><li> Makronun bir sonraki resmi açtığına dikkat edin. Tüm görüntüler analiz edilene kadar 5.7-5.13 adımlarını tekrarlayın. </li></ol>Jove_title &quot;&gt; 6. Veri Önişleme, Analiz ve Oturum Düzeltmesi NOT: Tüm veri analizi R 47&#39;de yapılır ve verilen &quot;Pigmentation.R Analizi&quot; komutunu kullanır. Aşağıda, &quot;L ...&quot;, analizin her bir parçası için komut satırının çalıştırılacağını belirtir. Analizin nasıl yapıldığı ile ilgili ek ayrıntılar için Ek Bilgi bölümüne bakın. <ol><li> Çalışma dizini (L6) ayarlamak için R komut dosyasını düzenleyin ve dosya yolunu .csv profillerini (L11) içeren klasöre tanımlayın. </li><li> Profil klasöründe saklanan pigmentasyon profillerinin bir listesini oluşturmak için L13-15&#39;i çalıştırın. </li><li> Profilleri tek bir veri çerçevesine okumak için &quot;okuyucu&quot; ve &quot;addPrimaryKey&quot; işlevlerini (L17-41) yükleyin ve çalıştırın. </li><li> Adım 2.5&#39;te belirlendiği üzere, resimlerin mekansal kalibrasyonunu μm / piksel cinsinden belirtmek için L43&#39;te komut dosyasını düzenleyin. </li><li> Yükle &quot;adjus&quot; u çalıştır(X ekseni, Şekil 2C ve 2C &#39;), ROI&#39;nin piksellerinden-posterior kenarına-ROI&#39;nin anterior-kenarından μm&#39;ye dönüştürmek için &quot;tents&quot; fonksiyonu (L46-58) ve Piksel değerinden (0 = siyah, 255 = beyaz) pigmentasyon değerine (0 = pigment yok, 255 = maksimum pigment) profil profili değeri (y ekseni, Şekil 2C ve 2C &#39;). </li><li> Pigmentasyon profilleri ve birinci ve ikinci türevlerinin kübik eğrisini oluşturmak için &quot;spline.der.er&quot; fonksiyonunu (L60-71) yükleyin ve çalıştırın ( Şekil 2D -2F ve 2D &#39;- 2F &#39;). </li><li> Önce pigment bandının arka (T 3 ) ve anterior (T 2 ) kenarlarının konumunu çıkartmak için &quot;koord&quot; ve &quot;assmbly.coord&quot; fonksiyonlarını (L74-163) yükleyin ve çalıştırın ( Şekil 2D ve 2D &#39;; Ve a2 kütikülün arka kenarı (T1, Şekil 2D ve 2D &#39;) ve daha sonra sırasıyla T3 ve Tl&#39;de alınan maksimum (Pmax) ve minimum (Pmin) pigmentasyon değerlerini çıkarmak için kullanıldı. NOT: a2 manikür kutusunun ön kenarı adım 5.9&#39;da tanımlanmıştır. </li><li> İsteğe bağlı: Rastgele seçilmiş bir pigmentleme profili için &quot;koordinat&quot; fonksiyonunun T 1-3 konumlarını doğru olarak tanımlayıp tanımadığını kontrol etmek için &quot;chek&quot; fonksiyonunu (L165-175) yükleyin ve çalıştırın. </li><li> &quot;Oturum&quot;, &quot;Örnek&quot;, &quot;Tergite&quot;, &quot;id&quot; (Numune ve Tergite&#39;nin bir birleşimi) başlıklar içeren bir veri tablosu oluşturmak için dizin ve ölçüm işlevlerini yükleyin ve çalıştırın (L178-193) &quot;P max &quot; &quot;P min &quot;, &quot;W band &quot; (pigment bandının genişliği , = T3 - T2) ve &quot;W tergite &quot; (pigmentli c genişliğiAletler a2-a5, = T3). </li><li> Oturum etkileri nedeniyle ortaya çıkan sıkıntı faktörleri için P maks ve P min değerlerini düzelten bir veri tablosu oluşturmak için &quot;düzeltme&quot; fonksiyonunu (L196-234) yükleyin ve çalıştırın. Geçici olarak bitişik oturumlar boyunca tekrar görüntülemiş olan kontrol numunelerinden Pmax veya Pmin&#39;deki ortalama artış (veya düşüş) kullanın. </li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu metodoloji, çoklu akışaşağı analizler için uygun niceliksel formda pigmentasyon verilerinin hassas, hızlı ve tekrarlanabilir kazanılmasını sağlar. Yöntem, sineklerin izogenik bir çizgisinde sıcaklığın abdominal pigmentasyon üzerindeki etkileri hakkında veri edinmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, metodoloji bireyler, popülasyonlar veya türler arasındaki pigmentasyon farklılıklarının altında yatan genleri veya belirli genlerin pigmentasyon kalıpları üzerindeki etkilerini ke?...

Pigmentasyon, türler, popülasyonlar ve bireyler arasında ve hatta ontogeny sırasında bireyler arasında muazzam fenotipik varyasyon gösterir 1,2,3,4,5,6. Çok çeşitli hayvanlarda pigmentasyon üzerine yapılan sayısız araştırmalar olmasına rağmen, pigmentasyon, belki de en iyi Drosophila melanogaster&#39;da incelenmiştir ; burada moleküler genetiğin tam gücünün, pigmentasyonu düzenleyen gelişimsel ve fizyolojik mekanizmaları aydınlattığı ve bu mekanizmaların nasıl geliştiği , 6 . D. melanogaster 7,8&#39;deki pigmentlerin biyokimyasal sentezini düzenleyen genler ve zamansal ve uzamsal di&#39;yi kontrol eden genler hakkında çok şey bilinmektedirBu biyo sentezin mahsulü 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Dahası, genetik haritalama, D. melanogaster&#39;ın pigmentasyonundaki intra-ve spesifik farklılıkların altında yatan genetik lokusları belirledi 14,15,16,17. Pigmentasyon paternleri 15 , 21 , 22&#39;nin uyarlanabilir önemi olduğu gibi, davranış 18 , 19 ve bağışıklık 19 , 20 gibi pigmentasyon ve pleiotropik özellikler arasındaki ilişki de araştırılmıştır. Bu nedenle, D. melanogaster pigmentasyonu güçlü ama basit bir m olarak ortaya çıkmıştırKarmaşık fenotiplerin gelişimi ve evrimi için odel. Yetişkin D. melanogaster pigmentasyon vücudun, özellikle kanat ve dorsal göğüs ve karın üzerinde melanizasyon farklı desenler ile karakterizedir. Bununla birlikte, dorsal karında her kütikül plakasının (tergit) pigmentasyonu en fazla araştırma dikkati çekmiştir. Bu pigmentasyonda ( Şekil 1A -F ) genetik 17 , 23 ve çevresel 24 , 25 faktörlerden dolayı önemli farklılıklar vardır. Karın tergitinin kütikülü, ön ve arka gelişim bölmelerinden oluşur ( Şekil 1G ) ve bunların her biri pigmentasyon ve süsleme temelinde daha da alt bölümlere ayrılabilir 26 . Ön kompartıman altı adet kütikül(A1-a6) ve arka bölüm üç (p1-p3) içerir ( Şekil 1G ). Bunların arasından, p1, p2 ve aluminyum kütikül genellikle gerilmemiş abdomenlerde trolitin altına katlanarak gizli kalırlar. Güvenilir görünür kütikülün özelliği, burada &quot;pigment bandı&quot; olarak adlandırılan ve a4 (kıllı kıllı kıllı) ve beyazlatılmış (büyük kıllı kıllı kütikulak tipleri) grubun arka kenarında Ön kenardan daha yoğun olarak pigmentlenmiştir ( Şekil 1G ). Bu bandın ön kısmı, hafifçe pigmentli kıllı kütikülün, kılların öne arkasında (a2) değil, arka kısmında (a3) ​​bulunduğu bir bölgedir. Sinekler arasındaki pigmentasyon değişikliği hem pigmentasyon yoğunluğunda hem de pigment band genişliğinde gözlemlenir. Genelde varyasyon, en arka segmentlerde (abdominal segment 5, 6 ve 7) en büyük ve daha ön segmentlerde (abdominal seGents 3 ve 4) 24 . Dahası, D. melanogaster pigmentasyonunda cinsel bir dimorfizm vardır, erkekler genellikle tamamen pigmente beşinci ve altıncı karın tergitlerine sahiptir ( Şekil 4C ). D. melanogaster&#39;in karın pigmentasyonunda yapılan birçok çalışmada pigmentasyon kategorik veya sıradan bir nitelik olarak ele alınmıştır; desen kalitatif olarak 27 , 28 , 29 veya yarı kantitatif olarak 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 skalasında ölçülmüştür , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Bu yöntemler kesinlikle kaçınılmaz olarak eksiklik çekmektedir ve pigmentasyonun subjektif değerlendirmesine dayanıyorlar çünkü çalışmalardaki verileri karşılaştırmak zordur. Birkaç yazar, pigmentasyonun mekansal boyutlarını, 38 , 39 belirli bir kütikül tipinin pigmentasyon yoğunluğunu, 23 , 25 , 39 , 40&#39;u veya karın tergiti boyunca pigmentasyonun ortalama yoğunluğunu 41 , 42 , 43 olarak nicelendirdi. Bununla birlikte, bu niceleme yöntemleri abdominal pigmentasyonun yoğunluğunu ve mekansal dağılımını aynı anda ölçmez ve bu nedenle pigmentasyonun abd&#39;de nasıl değiştiği nüanslarını yakalamazOminal tergite. Ayrıca, bu 38 , 41 , 42 , 43 sayım yöntemlerinin birçoğu abdominal kütikülün diseksiyonu ve montajını gerektirir. Bu, hem zaman alıcıdır hem de örnekleri yok eder ve ek morfolojik analizler için kullanılamaz hale getirir. Karın pigmentasyonunun gelişimi ve gelişiminin anlaşılması derinleştikçe, hem mekansal dağılımı hem de pigmentasyon yoğunluğunu hızlı ve titizlikle ölçmek için daha karmaşık araçlar gerekecektir. Bu yöntemin genel amacı, D. melanogaster&#39;ın karın pigmentasyonunun tekrarlanabilir ve daha kesin bir ölçümünü elde etmek için dijital görüntü analizini kullanmaktır . Metodoloji üç aşamayı içermektedir. İlk olarak, yetişkin sineği yıkıcı olmayan bir şekilde monte edilir ve sırt karnının dijital bir görüntüsü alınır. İkinci olarak, bir ImageJ makrosunu kullanarak, kullanıcıA2 kütikülün önünden a5 kütikülün posterioruna (yeşil kutu, Şekil 1G ) uzanan, hem üçüncü hem de dördüncü abdominal segmentler üzerinde uzanan bir ön-arka piksel şeridi tanımlar. Bu şeridin genişliğindeki ortalama piksel değeri daha sonra uzun ekseni boyunca çıkarılarak, tergitin önünden posteriora değiştiği için pigmentasyonun mekansal dağılımını ve yoğunluğunu yakalayan bir profil oluşturur. Üçüncüsü, bir kübik mürekkep püskürtme metodu kullanılarak matematiksel olarak pigmentasyon profilini tarif etmek için bir R yazısı kullanılır. R betiği daha sonra, a2-a5 kütikül genişliğini, pigment bandının genişliğini ve pigmentasyonun maksimum ve minimum seviyelerini çıkarmak için spline&#39;ı ve birinci ve ikinci türevlerini kullanır. Metod, bu nedenle hem mekansal özellikleri hem de abdominal pigmentasyonun derinliğini nicelleştirir. Bu metodoloji, üçüncü ve dördüncü abdominal tergitlerin pigmentasyonunu,1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 numaralı çok sayıda önceki çalışmaların odağı haline geldi. Bu çalışmalar daha özel olarak ya da daha posterior tergitlerle birlikte yapıldı. Beşinci ve altıncı karın tergastan daha az değişken olmasına rağmen, üçüncü ve dördüncü tergitler erkeklerde tamamen pigmente değildir, bu nedenle bu protokol hem erkek hem de kadınlara uygulanabilir. Bununla birlikte, burada gösterildiği gibi, protokol kadınlarda beşinci ve altıncı karın tergitlerinde pigmentasyon ölçmek için kullanılabilir. Ayrıca, pigmentasyon profilinin özelliklerini çıkarmak için kullanılan küçük değişiklikler, metodun pigmentasyondaki değişikliği niceliksel olarak belirlemek için kullanılmasına izin vermelidirorganizmalar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Biology Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gooseneck Cold Light Source</td>
			<td>Schott</td>
			<td>ACE 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Control Software</td>
			<td>Micro-Manager v1.3.20</td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>R 3.3.2</td>
			<td></td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>LEDWE-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimeter</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>Fluke 75 Series II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Celltreat Scientific Products</td>
			<td>229663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>Klarman Rulings, Inc.</td>
			<td>KR-867</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying abdominal pigmentation in drosophila melanogaster

Pigmentasyon, morfolojik olarak basit ancak oldukça uyarlanabilir nitelikte olan bir özelliktir. Morfolojik fenotiplerin gelişimini ve gelişimini anlamak için kapsamlı bir model olarak hizmet etmiştir. Drosophila melanogaster&#39;teki abdominal pigmentasyon, araştırmacıların morfolojideki inter-ve intraspecifik varyasyonların altında yatan lokusları tanımlamasına imkan tanımak için özellikle yararlı olmuştur. Ancak, D. melanogaster karın pigmentasyonu, niceliksel olarak değil, skorlama yoluyla, pıgmentasyon verilerine uygulanabilen istatistiksel analiz biçimlerini sınırlayan, büyük ölçüde tahlil edilmiştir. Bu çalışma, yetişkin D. melanogaster&#39;in karın pigmentasyon örneğinin çeşitli yönlerinin nicelleştirilmesini sağlayan yeni bir metodoloji tanımlamaktadır . Protokol örnek montaj, görüntü yakalama, veri çıkarma ve analiz içerir. Görüntü yakalama ve analiz özelliği makroları için kullanılan tüm yazılımlarAçık kaynaklı görüntü analizi için yazılmıştır. Bu yaklaşımın avantajı, farklı görüntüleme sistemleri arasında yüksek oranda tekrarlanabilir bir metodoloji kullanarak pigmentasyon özelliklerini tam olarak ölçebilmesidir. Teknik, yetişkin D. melanogaster&#39;in tergal pigmentasyon modellerindeki değişimi ölçmek için kullanılmış olmakla birlikte, metodoloji sayısız farklı organizmalardaki pigmentasyon kalıplarına esnek ve geniş ölçüde uygulanabilir.

Protokol, yetiştirme sıcaklığının abdominal pigmentasyon üzerine etkisini araştırmak için kullanılmıştır. Önceki çalışmalar , D. melanogaster 30 , 32 dahil olmak üzere, gelişim sıcaklığında bir artışın Drosophila&#39;nın çeşitli türlerinde abdominal pigmentasyon yayılımında bir azalmaya neden olduğunu göstermiştir . Özellikle abdominal tergitler 3 ve 4&#39;te pigmen...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Bu çalışma, dijital görüntü analizi kullanarak Drosophila melanogaster&#39;in karın pigmentasyonunu hızlı ve hassas bir şekilde ölçmek için bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, fenotip edinimi ile veri analizi arasındaki usulleri düzene sokar ve numune montajı, görüntü toplama, piksel değeri çıkarımı ve kalitenin ölçülmesini içerir.

Karın Pigmentasyonunun Karaciğer Miktarında Nicelleştirilmesi<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

quantifying-abdominal-pigmentation-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Genetics

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

8.9K Görüntüleme.  Lake Forest College.  Bu çalışma, dijital görüntü analizi kullanarak Drosophila melanogaster'in karın pigmentasyonunu hızlı ve hassas bir şekilde ölçmek için bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, fenotip edinimi ile veri analizi arasındaki usulleri düzene sokar ve numune montajı, görüntü toplama, piksel değeri çıkarımı ve kalitenin ölçülmesini içerir. 

Video: Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

Edu Boyama tarafından Drosophila Yetişkin Yumurtalıkların Mitokondriyal DNA replikasyonu Yerinde Etiketlenmesi içinde

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Genetik

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

Yüksek yağlı diyet beslenme ve yüksek işlem hacmi Triacylglyceride tahlil Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel have been described. However, a method to measure the amount of additional animal activity induced through the exercise treatment has been lacking. The Rotating Exercise Quantification System (REQS) fills this need, providing a measure of animal activity for animals experiencing rotational exercise. This protocol details how to use the REQS to assess animal activity during rotational exercise and illustrates the type of data that can be generated. Here, we demonstrate how the REQS is used to measure sex- and strain-specific differences in exercise induced activity. The REQS can also be used to evaluate the impact of various other experimental parameters such as age, diet, or population size on exercise induced activity. In addition, it can be used to compare the efficacy of different exercise training protocols. Importantly, it provides an opportunity to standardize exercise treatments between strains, allowing the researcher to achieve equal amounts of activity between groups if needed. Thus, the REQS is a notable new resource for exercise biologists working with the Drosophila model system and complements existing exercise systems.

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

The Rotating Exercise Quantification System (REQS) can induce exercise in Drosophila melanogaster through rotation while simultaneously measuring the amount of activity performed by the animals. Here, we present a point-by-point protocol detailing how to measure activity levels of animals experiencing rotational exercise treatments using the REQS.

Drosophila melanogaster dönen egzersiz miktar sistem (istekler) kullanarak ölçüm egzersiz seviyelerinde

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and lowered activity levels. These multifactorial diseases arise from a combination of genetic, environmental, and behavioral factors. One such complex disease is Metabolic Syndrome (MetS), which is a cluster of metabolic disorders, including hypertension, hyperglycemia, and abdominal obesity. Exercise and dietary intervention are the primary treatments recommended by doctors to mitigate obesity and its subsequent metabolic diseases. Exercise intervention, in particular aerobic interval training, stimulates favorable changes in the common risk factors for Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM), Cardiovascular Disease (CVD), and other conditions. With the influx of evidence describing the therapeutic effect exercise has on metabolic health, establishing a system that models exercise in a controlled setting provides a valuable tool for assessing the effects of exercise in an experimental context. Drosophila melanogaster is a great tool for investigating the physiological and molecular changes that result from exercise intervention. The flies have short lifespans and similar mechanisms of metabolizing nutrients when compared to humans. To induce exercise in Drosophila, we developed a machine called the TreadWheel, which utilizes the fly&#39;s innate, negative geotaxis tendency to gently induce climbing. This enables researchers to perform experiments on large cohorts of genetically diverse flies to better understand the genotype-by-environment interactions underlying the effects of exercise on metabolic health.

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel uses rotational motion to gently induce exercise in adult Drosophila melanogaster by exploiting flies&#39; innate, negative geotaxis. It allows for analysis of the interactions between exercise and factors, such as genotype, sex, and diet, and their effect on physiological and molecular assays to assess metabolic health.

TreadWheel: Aralığı eğitim protokolü yavaşça indüklenen egzersiz Drosophila melanogaster için

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small numbers of cells. Utilizing this technology to study development in the Drosophila visual system, which boasts a wealth of cell type-specific genetic tools, provides a powerful approach for addressing the molecular basis of development with precise cellular resolution. For such an approach to be feasible, it is crucial to have the capacity to reliably and efficiently purify cells present at low abundance within the brain. Here, we present a method that allows efficient purification of single cell clones in genetic mosaic experiments. With this protocol, we consistently achieve a high cellular yield after purification using fluorescence activated cell sorting (FACS) (~25% of all labeled cells), and successfully performed transcriptomics analyses on single cell clones generated through mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM). This protocol is ideal for applying transcriptomic and genomic analyses to specific cell types in the visual system, across different stages of development and in the context of different genetic manipulations.

Here, we present a cell dissociation protocol for efficiently isolating cells present at low abundance within the Drosophila visual system through fluorescence activated cell sorting (FACS).

Drosophila görsel sistem düşük bol hücrelerinin arıtma

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

Drosophila Kullanarak Hastalıkla İlişkili Nadir İnsan Varyantlarının Vivo Fonksiyonel Çalışmasında

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

In vivo Ileri genetik ekran Drosophila melanogaster yeni Nörokoruyucu genler tanımlamak için

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Omics Yaklaşımlar için Drosophila melanogaster Uçuş Kasları Diseksiyon

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, the mechanisms underlying TAD formation and boundaries are still under investigation. The application of the in-nucleus Hi-C method described here helped to dissect the function of architectural protein (AP)-binding sites at TAD boundaries isolating the Notch gene. Genetic modification of domain boundaries that cause loss of APs results in TAD fusion, transcriptional defects, and long-range topological alterations. These results provided evidence demonstrating the contribution of genetic elements to domain boundary formation and gene expression control in Drosophila. Here, the in-nucleus Hi-C method has been described in detail, which provides important checkpoints to assess the quality of the experiment along with the protocol. Also shown are the required numbers of sequencing reads and valid Hi-C pairs to analyze genomic interactions at different genomic scales. CRISPR/Cas9-mediated genetic editing of regulatory elements and high-resolution profiling of genomic interactions using this in-nucleus Hi-C protocol could be a powerful combination for the investigation of the structural function of genetic elements.

The genome is organized in the nuclear space into different structures that can be revealed through chromosome conformation capture technologies. The in-nucleus Hi-C method provides a genome-wide collection of chromatin interactions in Drosophila cell lines, which generates contact maps that can be explored at megabase resolution at restriction fragment level.

Drosophila Hücrelerinde Çekirdek içi Hi-C

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...