Name: quantifying abdominal pigmentation in drosophila melanogaster
Uploaded: 2017-06-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Bu çalışma National Science Foundation tarafından IOS-1256565 ve AWS için IOS-1557638 tarafından finanse edildi. Patricia Wittkopp&#39;a ve bu yazının daha önceki bir sürümüne ilişkin yararlı yorumları için üç anonim gözden geçirenimize teşekkür ediyoruz.

1. Numune Montajı NOT: Görüntülemeden önce ölü sinekleri% 70 etanol içinde suda saklayın. <ol><li> 60 mm x 15 mm Petri kabında kaynar suda çözünen% 1.25 agara 10 mL koyun ve ayarlanmasına izin verin. </li><li> Bir diseksiyon mikroskopu altında, jelin yüzeyinde ~ 20 mm, 2 mm genişliğinde, 1 mm derin oluk yapmak için bir çift ince noktalı forseps kullanın. İnce forseps kullanarak, sinekin dorsal yüzü jelin üzerine çıkıntı yapacak şekilde yetişkin bir sinekin ventral yüzünü oyuğa gömer. NOT: Jelin gevşemesi, numuneye zarar vermeden kolayca yeniden konumlandırılmasını sağlar. Aynı oluk birden çok numune için kullanılabilir, ancak kirli, parçalanmış ve zamanla kullanılamaz hale gelecektir. Kullanıcı daha sonra aynı jöle içinde bir başka oluk daha yapabilir. Her plaka, ~ 200 sinek çekmek için kullanılabilir. </li><li> Mumu kütikülündeki herhangi bir ışık yansımasını azaltmak ve kanat hasarını önlemek için sudaki% 70 etanol içindeki numuneyi tamamen örtünÖrnek muamelesi. </li></ol> 2. Mikroskop Kurulumu NOT: Görüntüler, diseksiyon kapsamı, aktarılan ışık tabanı, dijital kamera ve gooseneck soğuk ışık kaynağı bilgisayar çalıştıran bir görüntü yakalama kontrol yazılımı kullanılarak eklenir. Yazılım talimatları, ImageJ 45&#39;i içeren açık kaynaklı bir yazılım olan Micro-Manager v1.4.20 44&#39;e özeldir. <ol><li> Mikroskopu, dijital kamerayı, çift gooseneck soğuk ışık kaynağını ve bilgisayarı açın. </li><li> Bir Micro-Manager penceresi ve bir ImageJ penceresi açmak için görüntü yakalama yazılımını çalıştırın. ImageJ penceresinde, tüm görüntüleri 8 bit olarak ayarlamak için &quot;Görüntü&quot;&gt; &quot;Tür&quot;&gt; &quot;8-Bit&quot; seçeneğini tıklayın. Kameradan gerçek zamanlı bir önizleme gösteren bir &quot;Snap / Live&quot; penceresi açmak için Micro-Manager penceresinde &quot;canlı&quot; seçeneğini tıklayın. <ol><li> Ne olursa, &quot;Snap / Live&quot; penceresinin boyutunu en üst düzeye çıkarınyapanlara. Micro-Manager penceresinin &quot;Contrast&quot; sekmesindeki açılan &quot;Display mode&quot; menüsünde &quot;Grayscale&quot; seçin. </li></ol></li><li> Soğuk ışık kaynağını maksimum yoğunluğuna getirin ve her gooseneck ipuçlarını sahneden yaklaşık 120 mm (bir tanesi solda ve bir tanesi sağda) konumlandırın. NOT: Kullanıcılar dairesel bir aydınlatıcı kullanabilir, ancak bu sinek karın çevresinde bir yansıma ışığı halkası oluşturabilir. </li><li> Manuel olarak mikroskop büyütme değerini 60X yapın, böylece sahne alanı sahnede yaklaşık 3 mm çapında bir alan yakalar. </li><li> Sahneye 2 mm&#39;lik bir mikrometre yerleştirin (gerekirse arka planı beyaza çevirin). Canlı önizlemeye bakarken, sahne mikrometresine odaklanın ve &quot;Pozlama&quot; kutusundaki ms cinsinden pozlama süresini girerek Mikro-Yönetici penceresindeki pozlamayı ayarlayın. </li><li> Kamerayı mekansal olarak kalibre etmek için, &quot;düz çizgi&quot; aracını seçin.O ImageJ pencere ve sahne mikrometresi uzunluğu bir çizgi çizin. &quot;Ölçeği Ayarla&quot; penceresini açmak için ImageJ penceresinde &quot;Analiz et&quot;&gt; &quot;Ölçek Yap&quot; ı tıklayın, &quot;Bilinen mesafe&quot; kutusuna mikrometrenin uzunluğunu μm olarak girin ve &quot;Birim uzunluğu&quot; bölümüne &quot;μm&quot; girin. kutu. <ol><li> Bakınız &quot;Ölçeği Ayarla&quot; penceresinde ölçeği &quot;piksel / μm&quot; olarak görüntüler. Ölçeği not edin ve &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. </li></ol></li><li> Sahne mikrometresinin bir görüntüsünü yakalamak için &quot;Snap / Live&quot; penceresinde &quot;Stop&quot; (Durdur) ve ardından &quot;Snap&quot; (Sabitleme) düğmesini tıklayın. </li><li> Gerekirse görüntüleri tekrar mekansal olarak kalibre etme yeteneğinden emin olmak için görüntüyü 8 bitlik gri tonlamalı bir TIFF olarak kaydedin. ImageJ penceresinde &quot;Dosya&quot;&gt; &quot;Farklı Kaydet&quot;&gt; &quot;Tiff ...&quot; seçeneğini tıklayın. Dosyayı tarayıcıda nereye kaydedeceğinizi belirtin, dosyayı adlandırın ve &quot;Kaydet&quot; i tıklayın. </li><li> Sahneyi siyaha çevir ve yerini değiştirSahnede agar içine monte edilmiş bir sinek tutan bir Petri tablası (adım 1.1-1.2). </li><li> Mikroskopta bakınız ve pıgmenti modelini en iyi görmek için dorsal orta hattın düz olduğunu doğrulamak için sinekleri konumlandırın. Karın görünümünün engellenmemesi için herhangi bir kanat ve uzantıları hareket ettirin. Pigmentli kütikül (a2-a5) görünmüyorsa, karnın yanal olarak sıkıştırın (buna rağmen, genellikle sinirlenmek için sineklerin% 70 etanol içinde depolanan sinekler). NOT: Sineği konumlandırırken kullanıcının daha düşük bir büyütme (20X) kullanması gerekebilir. Devam etmeden önce büyütme 60X değerine geri getirilmelidir. </li><li> Sinek karnına elle odaklanın. Dorsal abdomen üzerindeki gölgeleri ve yansımayı en aza indirgemek için ışık kaynağının ipuçlarını elle ayarlayın. </li><li> Bilgisayar ekranındaki canlı önizlemeye bakarken ve Micro-Manager penceresinin &quot;Contrast&quot; sekmesindeki piksel değer histogramını kullanırken,Önizleme görüntüsünün piksel değerlerinin aralığını en yükseğe çıkarmak için adım 2.4&#39;te açıklandığı gibi pozlamayı ayarlayın. </li><li> Sinek ve Petri kabını çıkarın ve sinek gibi aynı pozisyonda görüş alanına ortalanmış bir voltaj ölçerine bağlı bir LED (430-660 nm spektral çıktısı) ile değiştirin. LED ve voltaj ölçeri, ışık ölçer 46 olarak kullanın ve LED&#39;i vuran ışık (~ 125 mV) tarafından üretilen voltajı kaydedin. NOT: LED ve gerilim ölçer, ışık düzeylerinin tek bir denemedeki çoklu görüntüleme oturumlarında sabit kalmasını sağlamak için kullanılır. </li><li> Deney süresince, ışık kaynağının konumunu veya yoğunluğunu, mikroskopun büyütülmesini veya kameranın maruz kalmasını daha fazla değiştirmeyin. </li></ol> 3. Numune Görüntüleme <ol><li> Bir karın (adımları 1.1-1.3) monte edilmiş bir sinek tutan bir Petri kabı siyah mikroskop stage.Adjust konumda böylece sinek üçüncü ve fourt2.9. Adımda tarif edildiği gibi abdominal segmentler görülebilir ve dorsal orta çizgi düzdür. Devam etmeden önce büyütmede 60x olduğundan emin olun. </li><li> Mikroskopu, üçüncü ve dördüncü dorsal abdominal tergitlerin odaklanacağı şekilde elle odaklama. Adım 2.6&#39;da anlatıldığı gibi bir görüntüyü 8-bit gri tonlamalı bir TIFF olarak elde etmek için görüntü yakalama yazılımını kullanın. NOT: Görüntü renkle alınabilir ve daha sonra analiz için gri skala dönüştürülebilir. </li><li> 2. adımda açıklandığı gibi resmi &quot;SESH000_sampleID.tiff&quot; olarak kaydedin. NOT: Burada [SESH] sabittir, oturum numarası [000] ve değişkentir, ancak üç basamaklı olmalı ve [sampleID] kullanıcının isteği ne olursa olsun, ek bir alt çizgi (_) karakteri içermemeli ve Sabit uzunlukta olmalı. [SampleID], pigmentasyon verilerinin ( örn. Sıcaklık veya soy) analizinde kullanılan faktörlerin ayrıntılarını içermelidir; ayırt edici olmayan alfabeCal karakteri, örneğin kısa çizgi (-). Bu, bu faktörlerin standart istatistik yazılımını kullanarak [sampleID] dışında kolayca ayrıştırılmasını sağlar. </li><li> Petri kabını sahneden çıkarın ve sineği bir sonraki numune ile değiştirin. Aydınlatma seviyelerini, büyütme veya pozlamayı daha fazla ayarlamadan tüm numuneler görüntülene kadar adım 3.1-3.3&#39;ü tekrarlayın. </li></ol> 4. Birden Fazla Oturum Arasında Görüntüleme <ol><li> Görüntülerin birden fazla oturumda ele alınması gerekiyorsa, oturum yoğunluğunu, pozlamayı ve büyütmeyi oturumlar boyunca koruyun. Her oturumun başında kameranın mekansal kalibrasyonunu (adım 2.4) ve sahnedeki ışık yoğunluğunu (LED / voltaj ölçeri, adım 2.12 ile ölçülen şekilde) kontrol edin. </li><li> Gerekirse, görüntüleri tekrar mekansal olarak kalibre etme yeteneğinden emin olmak için sahne mikrometresinin bir görüntüsünü yakalayın ve kaydedin (adım 2.5-2.7). </li><li> En az 15 kontrol numunesi kullanın ve her seansda rasgele yeniden görüntü oluşturun.W oturum etkilerinin tespiti ve ortadan kaldırılması için. Oturumlar arasındaki yinelenen kontrol numunelerinin aynı [örnek kimlik] olduğundan farklı [SESH000] olduğundan emin olun. NOT: Kontrol numuneleri, deney numuneleri ile aynı şekilde toplanan, depolanan ve monte edilen sineklerdir, ancak seanslar boyunca yeniden imgelenmektedir. Kontrol numunelerinin kesin sayısı, kullanıcının deney düzeneğine bağlı olacaktır. Daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakın. </li></ol> 5. Görüntü Analizi NOT: Görüntü analizi ImageJ 45&#39;te yapılır ve ek bir dosya olarak verilen &quot;Pigmentation.ijm Ölçümü&quot; makrosunu kullanır. <ol><li> Analiz edilecek tüm görüntüleri aynı klasöre yerleştirin. </li><li> ImageJ&#39;yi başlatın ve dosya tarayıcısında &quot;Pigmentation.ijm Ölçümü&quot; nü seçerek &quot;Eklentiler&quot;&gt; &quot;Makro&quot;&gt; &quot;Çalıştır&quot; ı tıklayarak &quot;Pigmentation.ijm Ölçümü&quot; makrosunu çalıştırın ve &quot;açık.&quot; NOT: Sonraki tüm adımlar makro içinde bulunur. Her adım, ayrı bir makro komuttur. </li><li> &quot;İşlemlerin Zorunlu Oldu&quot; iletişim kutusu açılır ve &quot;Görüntülerin depolandığı klasörü seç&quot; yazısı görüntülenir. &quot;Tamam&quot; a tıklayın ve resimleri içeren klasörü seçmek için dosya tarayıcıyı kullanın ve ardından &quot;seç&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> &quot;Verilerin saklanmasını istediğiniz klasörü seçin&quot; şeklindeki bir &quot;İşlem Gerekli&quot; iletişim kutusu açılır. &quot;Tamam&quot; a tıklayın ve pigmentasyon profillerini kaydetmek için istediğiniz klasörü seçmek için dosya tarayıcısını kullanın. &quot;Seç&quot; i tıklayın. </li><li> &quot;Örnek kimliğinizde kaç tane karakter var?&quot; Sorusuyla ilgili bir iletişim kutusu açılır. Veri girişi kutusuna, adım 3.3&#39;te belirtildiği gibi [SampleID] içindeki karakter sayısını girin ve &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. </li><li> &quot;Yatırım Getiriniz ne kadar geniş?&quot; Sorusu ile bir iletişim kutusu açılır. Veri girişi kutusuna, anterior-(Yeşil dikdörtgen, Şekil 1G , Şekil 2A ve 2A &#39;). &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. Varsayılan 20 pikseldir. NOT: Tüy ve kılların neden olduğu gürültüyü azaltmak için pigmentasyon profili, çizgi yerine kütikül şeridinde okunur. Bu şeridin genişliği resmin çözünürlüğüne bağlı olacaktır, ancak karnın genişliğinin ~ 1 / 20&#39;si piksel olarak olmalıdır. </li><li> Makronun ilk sinek görüntüsünü açacağına ve bir sonraki sinekte (&quot;Hayır&quot; ı tıklayın) devam etmek için mevcut sinek miktarını ölçmek (&quot;Evet&quot; tıklayın), yoksa bir sinek Makroyu tıklayın (&quot;İptal&quot; i tıklayın). </li><li> &quot;Dorsal karın orta çizgisini ANTERIOR&#39;dan POSTERIOR&#39;a tanımlayın&quot; şeklinde bir diyalog kutusunun açılacağını unutmayın. &quot;Düz çizgi&quot; aracı zaten seçilmiş olacaktır. Anteriordan posteriora bir çizgi çizerDorsal karın orta çizgisini tanımlamak için. &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. Bakınız Şekil 2A ve 2A &#39;, sarı çizgi. NOT: Bu, resmin yönünü değiştirmek için, dorsal orta çizginin ekranda yatay olarak uzanması, sol ön kısım ise sonraki adımları kolaylaştırmak için kullanılır. </li><li> Not: &quot;Tergite 4&#39;ün POSTERIOR kenarını pigment bandının hemen arkasında tanımlayın&quot; şeklinde bir iletişim kutusu açılır. &quot;Düz çizgi&quot; aracı zaten seçilmiş olacaktır. Çizginin (beyaz bir kare ile işaretli) merkezinin pigment bandının (kütikül a5) arka kenarına sadece posterior olarak oturacağı şekilde, arka orta çizgiden sağ yanal kenara doğru bir çizgi çizin. &quot;Tamam;&quot; ı tıklayın. Bkz. Şekil 2A ve 2A &#39;, kırmızı çizgi. NOT: R yazısı pigmentleme profilinden pigment bandının arka kenarını otomatik olarak algılar. </li><li> Bir diyalogunKutusu açılır ve &quot;Tergite 4&#39;ün ANTERIOR kenarını pigmentli kütikülün ön kenarında (a2) tanımlayın&quot; şeklinde bir açıklama yapacaktır. &quot;Düz çizgi&quot; aracı zaten seçilmiş olacaktır. Çizginin merkezi (beyaz bir kare ile işaretli), pigmentli kütikülün (kütikül a2) ön kenarına oturacak şekilde, ön orta çizgiden sağ yan kenara bir çizgi çizin. &quot;Tamam;&quot; ı tıklayın. Bakınız Şekil 2A ve 2A &#39; , cam göbeği çizgi. NOT: R yazısı, bu noktayı, tergitin pigmentli manikürinin ön kenarı olarak tanımlayacaktır. Görüntü üzerinde makro, pigmentasyon profilinin okuduğu ilgi bölgesi (ROI) gösterecektir (yeşil dikdörtgen, Şekil 2A ve 2A &#39;, Şekil 2B ve 2B &#39; de büyütülmüştür). Makro, ROI için pigmentasyon profilini gösteren ikinci bir pencere açar (Şekil.<html> E 2C ve 2C &#39;), burada x ekseni, profilin arka kenarından gelen piksel sayısı olarak ifade edilen konumdur ve y ekseni, her konumdaki ortalama piksel değeridir. </li><li> Makro tarafından açılacak pigmentasyon profilinin grafiğini görüntüleyin. Gerektiğinde, pigmentasyon profilini etkileyecek herhangi bir yapı ( örn. Kıllar) içermemesi için ROI&#39;nın konumunu ayarlamak için profil penceresinde &quot;Canlı&quot; yı tıklayın. Profil tatmin edici olduğunda, &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. </li><li> Tergite 3 için 5.8-5.11 adımlarını tekrarlayın. NOT: Makro, pigmentasyon profillerini her biri &quot;SESH000_samplename_TX_profile.csv&quot; adlı iki CSV dosyası olarak dışa aktarır; burada [SESH000_samplename], resim adıdır ve [TX] üçüncü ve dördüncü tergitler için sırasıyla T3 veya T4&#39;tür. </li><li> Makronun bir sonraki resmi açtığına dikkat edin. Tüm görüntüler analiz edilene kadar 5.7-5.13 adımlarını tekrarlayın. </li></ol>Jove_title &quot;&gt; 6. Veri Önişleme, Analiz ve Oturum Düzeltmesi NOT: Tüm veri analizi R 47&#39;de yapılır ve verilen &quot;Pigmentation.R Analizi&quot; komutunu kullanır. Aşağıda, &quot;L ...&quot;, analizin her bir parçası için komut satırının çalıştırılacağını belirtir. Analizin nasıl yapıldığı ile ilgili ek ayrıntılar için Ek Bilgi bölümüne bakın. <ol><li> Çalışma dizini (L6) ayarlamak için R komut dosyasını düzenleyin ve dosya yolunu .csv profillerini (L11) içeren klasöre tanımlayın. </li><li> Profil klasöründe saklanan pigmentasyon profillerinin bir listesini oluşturmak için L13-15&#39;i çalıştırın. </li><li> Profilleri tek bir veri çerçevesine okumak için &quot;okuyucu&quot; ve &quot;addPrimaryKey&quot; işlevlerini (L17-41) yükleyin ve çalıştırın. </li><li> Adım 2.5&#39;te belirlendiği üzere, resimlerin mekansal kalibrasyonunu μm / piksel cinsinden belirtmek için L43&#39;te komut dosyasını düzenleyin. </li><li> Yükle &quot;adjus&quot; u çalıştır(X ekseni, Şekil 2C ve 2C &#39;), ROI&#39;nin piksellerinden-posterior kenarına-ROI&#39;nin anterior-kenarından μm&#39;ye dönüştürmek için &quot;tents&quot; fonksiyonu (L46-58) ve Piksel değerinden (0 = siyah, 255 = beyaz) pigmentasyon değerine (0 = pigment yok, 255 = maksimum pigment) profil profili değeri (y ekseni, Şekil 2C ve 2C &#39;). </li><li> Pigmentasyon profilleri ve birinci ve ikinci türevlerinin kübik eğrisini oluşturmak için &quot;spline.der.er&quot; fonksiyonunu (L60-71) yükleyin ve çalıştırın ( Şekil 2D -2F ve 2D &#39;- 2F &#39;). </li><li> Önce pigment bandının arka (T 3 ) ve anterior (T 2 ) kenarlarının konumunu çıkartmak için &quot;koord&quot; ve &quot;assmbly.coord&quot; fonksiyonlarını (L74-163) yükleyin ve çalıştırın ( Şekil 2D ve 2D &#39;; Ve a2 kütikülün arka kenarı (T1, Şekil 2D ve 2D &#39;) ve daha sonra sırasıyla T3 ve Tl&#39;de alınan maksimum (Pmax) ve minimum (Pmin) pigmentasyon değerlerini çıkarmak için kullanıldı. NOT: a2 manikür kutusunun ön kenarı adım 5.9&#39;da tanımlanmıştır. </li><li> İsteğe bağlı: Rastgele seçilmiş bir pigmentleme profili için &quot;koordinat&quot; fonksiyonunun T 1-3 konumlarını doğru olarak tanımlayıp tanımadığını kontrol etmek için &quot;chek&quot; fonksiyonunu (L165-175) yükleyin ve çalıştırın. </li><li> &quot;Oturum&quot;, &quot;Örnek&quot;, &quot;Tergite&quot;, &quot;id&quot; (Numune ve Tergite&#39;nin bir birleşimi) başlıklar içeren bir veri tablosu oluşturmak için dizin ve ölçüm işlevlerini yükleyin ve çalıştırın (L178-193) &quot;P max &quot; &quot;P min &quot;, &quot;W band &quot; (pigment bandının genişliği , = T3 - T2) ve &quot;W tergite &quot; (pigmentli c genişliğiAletler a2-a5, = T3). </li><li> Oturum etkileri nedeniyle ortaya çıkan sıkıntı faktörleri için P maks ve P min değerlerini düzelten bir veri tablosu oluşturmak için &quot;düzeltme&quot; fonksiyonunu (L196-234) yükleyin ve çalıştırın. Geçici olarak bitişik oturumlar boyunca tekrar görüntülemiş olan kontrol numunelerinden Pmax veya Pmin&#39;deki ortalama artış (veya düşüş) kullanın. </li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu metodoloji, çoklu akışaşağı analizler için uygun niceliksel formda pigmentasyon verilerinin hassas, hızlı ve tekrarlanabilir kazanılmasını sağlar. Yöntem, sineklerin izogenik bir çizgisinde sıcaklığın abdominal pigmentasyon üzerindeki etkileri hakkında veri edinmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, metodoloji bireyler, popülasyonlar veya türler arasındaki pigmentasyon farklılıklarının altında yatan genleri veya belirli genlerin pigmentasyon kalıpları üzerindeki etkilerini keşfetmek için ters genetik çalışmaları belirlemek için ileri genetik çalışmalarında kullanılabilir. Yukarıda tartıştığımız gibi, D. melanogaster pigmentasyonun gelişimini ve gelişimini araştıran çok sayıda çalışma yapılmış olsa da, bu metodolojinin pigmentasyon verilerini niceliksel bir biçimde yakaladığı hassasiyet, daha güçlü istatistiksel yaklaşımlara izin verir. Bu da, araştırmacıların pigmentasyon paternlerini analiz ederken daha az numune kullanmalarına izin veriyor veya daha ince örnekleri aydınlatmalarına izin veriyorPigmentasyon yönleri. Ayrıca, bu yöntem, sinekin diseksiyonu gerektirmemektedir ve numunenin daha sonra morfolojik ölçümler veya genotipleme gibi ilave analizler için kullanılmasına izin verilmektedir. Gerçekten, metodoloji anestezi uygulanmış sinekler üzerinde potansiyel olarak kullanılabilir, bu da daha sonra pigmentasyon özelliklerine göre seçici olarak üretilebilir. Görüntü analiziyle pigmentlemenin ölçülmesinde potansiyel bir sorun, pigmentasyon değerlerinin pigmentasyonun kendisinden ziyade bir görüntünün alındığı maruz kalma ve aydınlatma koşullarını yansıtabilmesidir. Sabit ışık seviyeleri, ışık pozisyonları, büyütme ve pozlama bu sorunları hafifletirken, oturum efektlerini tam olarak kontrol etmek için her oturumda tekrar tekrar kontrol görüntüleri almak gerekecektir. Bu yöntem, her oturumda onbeş kontrol örneğini yeniden görüntülemeyi ve P ma&#39;daki oturumlar arası değişikliklerX ve P min , oturum efektlerini algılamak ve ortadan kaldırmak için kullanılır. Bununla birlikte, tekrar görüntülenecek olan kontrol numunelerinin kesin sayısı, kullanılan görüntüleme donanımı ve yazılımı, kullanıcıya ilgi pigmentasyonu yönü ve tedaviler arasındaki değişkene ve her birinde kaç resim çekildiğine bağlı olacaktır oturum, toplantı, celse. Aynı örneklerin beş seansta yeniden görüntülendiği bir ön deney yürütmek, kullanıcıya oturum efektleri, varyasyon, numune kimliği ve kalan varyansa bağlı olarak varyans hesaplamasına olanak tanır (düzeltme sonrası ölçüm hatasının bir tahmini) Oturum etkileri için) ( Tablo 1 ). Bu değerler, daha sonra, oturum etkileri tespit etmek ve kontrol etmek için her bir oturumda kaç tane kontrol görüntüsü alınması gerektiğini tahmin etmek için kullanılabilir. Basit bir R yazısı basıldı ve oturumlardaki pigmentasyon önlemlerini simüle etmek için böyle bir ön deneyden elde edilen verileri kullanıyor. KullanılabilirOturum başına kontrol görüntülerinin sayısının oturum etkilerini kaldırmak için yeterli olup olmadığını kontrol etmek. Bu betik ek bir dosya olarak sağlanmaktadır. Kullanıcılar, oturumlarda rahatsızlık verici faktörler bulunduğundan endişeleniyorsa, John v.d., 2016 41&#39;de açıklandığı gibi, aynı numuneyi oturum boyunca birden çok kez yeniden görüntüleyebilirler. Bu durumda, tek kontrol numunesi için [sampleID], bir oturumda her görüntülendiğinde değiştirilmelidir ( örneğin, control1, control2, control3, vb. ); Aksi takdirde, görüntüleme yazılımı önceki görüntüyü aynı adlı yeni resimle değiştirecektir. Düzeltme işlevi, düzeltmeyi zamansal olarak bitişik oturumlar arasındaki aynı [örnek kimliği] olan çoğaltılmış görüntülere dayandırır ve aynı örneklerin oturumlar içinde ve oturumlar arasında birden fazla kez görüntülendiği veya oturumlar arasında aynı kontrol örneği setinin görüntülendiği şekilde düzeltilir. Ne olursa olsun nasılE kontrol görüntüleri alınır, oturumlar blok olarak ele alınır ve mümkün olduğunca kullanıcıların rastgele bir blok tasarımı kullanması gerekir; böylece düzeltildikten sonra kalan tüm oturum efektleri istatistiksel olarak kontrol edilebilir. Başarısız olursa, örnekler rasgele oturumlara ayrılmalıdır, böylece oturum etkileri deneysel faktörlerle karıştırılmaz. Protokol, her bir tergite karşı pigmentasyon değişikliğini temsil eden bir pigmentasyon profilinin oluşturulmasına dayanır. Bu profili oluşturmaya yarayan bir husus, karın kütikülünü örten koyu tüyler olup, tergite çapraz geçen herhangi bir ön-arka çizgi tarafından da ikiye bölünmüştür. Protokol, bu tüylerin oluşturduğu gürültüyü, bir kütikül bandında ortalanan pigmentasyon profilini alarak azaltır. Yine de, kullanıcılar, ince bir çizgi çizgisine dayanan profiller oluşturmak istiyorlarsa adım 5.6&#39;da ROI genişliğini 1 piksel olarak ayarlayabilirler. Dahası, kullanıcılar tBir görüntünün içindeki pigment bandının genişliğinde değişiklikleri yakalamak için pigmentasyon profilinin yanal konumunu değiştirerek, aynı görüntüyü defalarca tekrarlar. Ancak bu durumda, kullanıcıların aynı görüntüyü defalarca kopyalamaları ve adım 5&#39;i gerçekleştirmeden önce her kopyaya benzersiz bir ad vermeleri gerekir; çünkü ImageJ makrosu aynı adlı profilin üzerine yazacaktır. Pigmentasyon profilinin oluşturulması sırasında ikinci önemli husus, Pigmentasyon R komut dosyasının analizinde spline.der.er fonksiyonu (L63) içinde tanımlanan kübik spline&#39;in yumuşatma parametresidir. Uygun pürüzsüzleştirme parametresi görüntüleme kurulumuna ve çözünürlüğüne bağlıdır. Bir profilin aşırı pürüzsüzleştirilmesi, T 1 , T 2 ve T 3&#39;ün koordinatlarını hesaplamak için kullanılan spline profilinin özelliklerini kaybedebilir ( Şekil 2D ve 2D &#39;). Tersine, düzgünsüzleştirme,Profilin gürültüsünü ve sonuç olarak koordinat ekstraksiyonlarının doğruluğunu içerir. Çengel işlevi, spline ve türevlerinin grafiksel bir özetini üretir ve uygun bir yumuşatma parametresi seçmek için görsel ipucu olarak kullanılabilir. Burada açıklanan metodoloji, kadın ve erkek D. melanogaster&#39;te üçüncü ve dördüncü abdominal tergitlerin pigmentasyonu üzerine veri toplamaya odaklanmaktadır . Bununla birlikte, temsili sonuçlar kadınların beşinci ve altıncı karın bölümlerinin pigmentasyonunu ölçmek için de kullanılabileceğini göstermektedir. Ayrıca, metodoloji, pigmentasyonunu etkileyen genlerin mutantlarının neden olduğu fenotipteki farklılıkları tespit edebilir. ImageJ makro ve R komut dosyaları, farklı D. melanogaster türlerinin karınlarındaki pigmentlemeyi ölçmek için kolayca değiştirilebilir veya pigmentasyon kalıbının basmakalıp olması koşuluyla başka vücut parçalarının diğer taksonlarda pigmentlenmesine bile kolayca izin verilebilir. Son olarak, metodolojiRGB içindeki görüntüleri yakalayarak ve her bir kanalı ayrı ayrı analiz ederek pigmentasyon renklerinin yönlerini ölçmek için uyarlanabilirler. Genel olarak, bu metodoloji yükselen fenomenoloji alanının bir parçasıdır 51 , 52 . Fenomenolojinin amacı, fenotipi etkileyen genetik ve çevresel etkileşimleri (hastalık dahil) ve bu etkileşimlerin biyolojik çeşitlilik oluşturmak için nasıl geliştiğini daha iyi anlamak için çok boyutlu, çok boyutlu fenotipik veri kümelerini üretmek ve analiz etmektir. Fenomiklerin potansiyelini yerine getirmesi için, fenotipik verilerin elde edilmesine yönelik metodolojiler açık ve kolayca farklı fenotiplere ve serbestçe mevcut hale getirilmiş olmalıdır. Standart ekipman kullanılarak çekilen görüntüleri analiz etmek için açık kaynaklı yazılımlar kullanarak, bu metodoloji bu amaca ulaşmak için yardımcı olur.

Pigmentasyon, türler, popülasyonlar ve bireyler arasında ve hatta ontogeny sırasında bireyler arasında muazzam fenotipik varyasyon gösterir 1,2,3,4,5,6. Çok çeşitli hayvanlarda pigmentasyon üzerine yapılan sayısız araştırmalar olmasına rağmen, pigmentasyon, belki de en iyi Drosophila melanogaster&#39;da incelenmiştir ; burada moleküler genetiğin tam gücünün, pigmentasyonu düzenleyen gelişimsel ve fizyolojik mekanizmaları aydınlattığı ve bu mekanizmaların nasıl geliştiği , 6 . D. melanogaster 7,8&#39;deki pigmentlerin biyokimyasal sentezini düzenleyen genler ve zamansal ve uzamsal di&#39;yi kontrol eden genler hakkında çok şey bilinmektedirBu biyo sentezin mahsulü 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Dahası, genetik haritalama, D. melanogaster&#39;ın pigmentasyonundaki intra-ve spesifik farklılıkların altında yatan genetik lokusları belirledi 14,15,16,17. Pigmentasyon paternleri 15 , 21 , 22&#39;nin uyarlanabilir önemi olduğu gibi, davranış 18 , 19 ve bağışıklık 19 , 20 gibi pigmentasyon ve pleiotropik özellikler arasındaki ilişki de araştırılmıştır. Bu nedenle, D. melanogaster pigmentasyonu güçlü ama basit bir m olarak ortaya çıkmıştırKarmaşık fenotiplerin gelişimi ve evrimi için odel. Yetişkin D. melanogaster pigmentasyon vücudun, özellikle kanat ve dorsal göğüs ve karın üzerinde melanizasyon farklı desenler ile karakterizedir. Bununla birlikte, dorsal karında her kütikül plakasının (tergit) pigmentasyonu en fazla araştırma dikkati çekmiştir. Bu pigmentasyonda ( Şekil 1A -F ) genetik 17 , 23 ve çevresel 24 , 25 faktörlerden dolayı önemli farklılıklar vardır. Karın tergitinin kütikülü, ön ve arka gelişim bölmelerinden oluşur ( Şekil 1G ) ve bunların her biri pigmentasyon ve süsleme temelinde daha da alt bölümlere ayrılabilir 26 . Ön kompartıman altı adet kütikül(A1-a6) ve arka bölüm üç (p1-p3) içerir ( Şekil 1G ). Bunların arasından, p1, p2 ve aluminyum kütikül genellikle gerilmemiş abdomenlerde trolitin altına katlanarak gizli kalırlar. Güvenilir görünür kütikülün özelliği, burada &quot;pigment bandı&quot; olarak adlandırılan ve a4 (kıllı kıllı kıllı) ve beyazlatılmış (büyük kıllı kıllı kütikulak tipleri) grubun arka kenarında Ön kenardan daha yoğun olarak pigmentlenmiştir ( Şekil 1G ). Bu bandın ön kısmı, hafifçe pigmentli kıllı kütikülün, kılların öne arkasında (a2) değil, arka kısmında (a3) ​​bulunduğu bir bölgedir. Sinekler arasındaki pigmentasyon değişikliği hem pigmentasyon yoğunluğunda hem de pigment band genişliğinde gözlemlenir. Genelde varyasyon, en arka segmentlerde (abdominal segment 5, 6 ve 7) en büyük ve daha ön segmentlerde (abdominal seGents 3 ve 4) 24 . Dahası, D. melanogaster pigmentasyonunda cinsel bir dimorfizm vardır, erkekler genellikle tamamen pigmente beşinci ve altıncı karın tergitlerine sahiptir ( Şekil 4C ). D. melanogaster&#39;in karın pigmentasyonunda yapılan birçok çalışmada pigmentasyon kategorik veya sıradan bir nitelik olarak ele alınmıştır; desen kalitatif olarak 27 , 28 , 29 veya yarı kantitatif olarak 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 skalasında ölçülmüştür , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Bu yöntemler kesinlikle kaçınılmaz olarak eksiklik çekmektedir ve pigmentasyonun subjektif değerlendirmesine dayanıyorlar çünkü çalışmalardaki verileri karşılaştırmak zordur. Birkaç yazar, pigmentasyonun mekansal boyutlarını, 38 , 39 belirli bir kütikül tipinin pigmentasyon yoğunluğunu, 23 , 25 , 39 , 40&#39;u veya karın tergiti boyunca pigmentasyonun ortalama yoğunluğunu 41 , 42 , 43 olarak nicelendirdi. Bununla birlikte, bu niceleme yöntemleri abdominal pigmentasyonun yoğunluğunu ve mekansal dağılımını aynı anda ölçmez ve bu nedenle pigmentasyonun abd&#39;de nasıl değiştiği nüanslarını yakalamazOminal tergite. Ayrıca, bu 38 , 41 , 42 , 43 sayım yöntemlerinin birçoğu abdominal kütikülün diseksiyonu ve montajını gerektirir. Bu, hem zaman alıcıdır hem de örnekleri yok eder ve ek morfolojik analizler için kullanılamaz hale getirir. Karın pigmentasyonunun gelişimi ve gelişiminin anlaşılması derinleştikçe, hem mekansal dağılımı hem de pigmentasyon yoğunluğunu hızlı ve titizlikle ölçmek için daha karmaşık araçlar gerekecektir. Bu yöntemin genel amacı, D. melanogaster&#39;ın karın pigmentasyonunun tekrarlanabilir ve daha kesin bir ölçümünü elde etmek için dijital görüntü analizini kullanmaktır . Metodoloji üç aşamayı içermektedir. İlk olarak, yetişkin sineği yıkıcı olmayan bir şekilde monte edilir ve sırt karnının dijital bir görüntüsü alınır. İkinci olarak, bir ImageJ makrosunu kullanarak, kullanıcıA2 kütikülün önünden a5 kütikülün posterioruna (yeşil kutu, Şekil 1G ) uzanan, hem üçüncü hem de dördüncü abdominal segmentler üzerinde uzanan bir ön-arka piksel şeridi tanımlar. Bu şeridin genişliğindeki ortalama piksel değeri daha sonra uzun ekseni boyunca çıkarılarak, tergitin önünden posteriora değiştiği için pigmentasyonun mekansal dağılımını ve yoğunluğunu yakalayan bir profil oluşturur. Üçüncüsü, bir kübik mürekkep püskürtme metodu kullanılarak matematiksel olarak pigmentasyon profilini tarif etmek için bir R yazısı kullanılır. R betiği daha sonra, a2-a5 kütikül genişliğini, pigment bandının genişliğini ve pigmentasyonun maksimum ve minimum seviyelerini çıkarmak için spline&#39;ı ve birinci ve ikinci türevlerini kullanır. Metod, bu nedenle hem mekansal özellikleri hem de abdominal pigmentasyonun derinliğini nicelleştirir. Bu metodoloji, üçüncü ve dördüncü abdominal tergitlerin pigmentasyonunu,1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 numaralı çok sayıda önceki çalışmaların odağı haline geldi. Bu çalışmalar daha özel olarak ya da daha posterior tergitlerle birlikte yapıldı. Beşinci ve altıncı karın tergastan daha az değişken olmasına rağmen, üçüncü ve dördüncü tergitler erkeklerde tamamen pigmente değildir, bu nedenle bu protokol hem erkek hem de kadınlara uygulanabilir. Bununla birlikte, burada gösterildiği gibi, protokol kadınlarda beşinci ve altıncı karın tergitlerinde pigmentasyon ölçmek için kullanılabilir. Ayrıca, pigmentasyon profilinin özelliklerini çıkarmak için kullanılan küçük değişiklikler, metodun pigmentasyondaki değişikliği niceliksel olarak belirlemek için kullanılmasına izin vermelidirorganizmalar.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 Biology Forceps</td><td>FST</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Scope</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>Base</td><td>Leica</td><td>MDG41</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Leica</td><td>DFC280</td><td></td></tr><tr><td>Gooseneck Cold Light Source</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>Image Acquisition Control Software</td><td>Micro-Manager v1.3.20</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>Image Analysis Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Data Analysis Software</td><td>R 3.3.2</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>LED</td><td>Thor Labs</td><td>LEDWE-15</td><td></td></tr><tr><td>Multimeter</td><td>Fluke</td><td>Fluke 75 Series II</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Petri dish</td><td>Celltreat Scientific Products</td><td>229663</td><td></td></tr><tr><td>Stage micrometer</td><td>Klarman Rulings, Inc.</td><td>KR-867</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying abdominal pigmentation in drosophila melanogaster

Pigmentasyon, morfolojik olarak basit ancak oldukça uyarlanabilir nitelikte olan bir özelliktir. Morfolojik fenotiplerin gelişimini ve gelişimini anlamak için kapsamlı bir model olarak hizmet etmiştir. Drosophila melanogaster&#39;teki abdominal pigmentasyon, araştırmacıların morfolojideki inter-ve intraspecifik varyasyonların altında yatan lokusları tanımlamasına imkan tanımak için özellikle yararlı olmuştur. Ancak, D. melanogaster karın pigmentasyonu, niceliksel olarak değil, skorlama yoluyla, pıgmentasyon verilerine uygulanabilen istatistiksel analiz biçimlerini sınırlayan, büyük ölçüde tahlil edilmiştir. Bu çalışma, yetişkin D. melanogaster&#39;in karın pigmentasyon örneğinin çeşitli yönlerinin nicelleştirilmesini sağlayan yeni bir metodoloji tanımlamaktadır . Protokol örnek montaj, görüntü yakalama, veri çıkarma ve analiz içerir. Görüntü yakalama ve analiz özelliği makroları için kullanılan tüm yazılımlarAçık kaynaklı görüntü analizi için yazılmıştır. Bu yaklaşımın avantajı, farklı görüntüleme sistemleri arasında yüksek oranda tekrarlanabilir bir metodoloji kullanarak pigmentasyon özelliklerini tam olarak ölçebilmesidir. Teknik, yetişkin D. melanogaster&#39;in tergal pigmentasyon modellerindeki değişimi ölçmek için kullanılmış olmakla birlikte, metodoloji sayısız farklı organizmalardaki pigmentasyon kalıplarına esnek ve geniş ölçüde uygulanabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Bu çalışma, dijital görüntü analizi kullanarak Drosophila melanogaster&#39;in karın pigmentasyonunu hızlı ve hassas bir şekilde ölçmek için bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, fenotip edinimi ile veri analizi arasındaki usulleri düzene sokar ve numune montajı, görüntü toplama, piksel değeri çıkarımı ve kalitenin ölçülmesini içerir.

Karın Pigmentasyonunun Karaciğer Miktarında Nicelleştirilmesi<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

quantifying-abdominal-pigmentation-in-drosophila-melanogaster

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

8.9K Görüntüleme.  Lake Forest College.  Bu çalışma, dijital görüntü analizi kullanarak Drosophila melanogaster'in karın pigmentasyonunu hızlı ve hassas bir şekilde ölçmek için bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, fenotip edinimi ile veri analizi arasındaki usulleri düzene sokar ve numune montajı, görüntü toplama, piksel değeri çıkarımı ve kalitenin ölçülmesini içerir. 

Video: Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a cost-effective in vivo method to identify heterochromatin-promoting compounds by using Drosophila. The Drosophila&#39;s DX1 strain, having a variegated eye color phenotype that reflects the extents of heterochromatin formation, thereby providing a tool for a heterochromatin-promoting drug screen. In this screening method, eye variegation is quantified based on the surface area of red pigmentation occupying parts of the eye and is scored on a scale from 1 to 5. The screening method is straightforward and sensitive and allows for testing compounds in vivo. Drug screening using this method provides a fast and inexpensive way for identifying heterochromatin-promoting drugs that could have beneficial effects in cancer therapeutics. Identifying compounds that promote the formation of heterochromatin could also lead to the discovery of epigenetic mechanisms of cancer development.

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is a widely used experimental model suitable for screening drugs with potential applications for cancer therapy. Here, we describe the use of Drosophila variegated eye color phenotypes as a method for screening small-molecule compounds that promote heterochromatin formation.

Drosophila Kullanan Heterokromatin-Teşvik Edici İlaçların Tanımlanması nda Bir Tarama Yöntemi

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Genetik

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy and cheap methods to distinguish between individuals in a trial. A standard technique for this is CO2 anaesthesia and then labelling or wing clipping each fly. However, this is invasive and has been shown to affect behavior. Other techniques have used coloration to identify flies. This article presents a simple and non-invasive method for labelling Drosophila that allows them to be individually identified within experiments, using food coloring. This method is used in trials where two males compete to mate with a female. Dyeing allowed quick and easy identification. There was, however, some difference in the strength of the coloration across the three species tested. Data is presented showing the dye has a lower impact on mating behavior than CO2 in Drosophila melanogaster. The impact of CO2 anaesthesia is shown to depend on the species of Drosophila, with D. pseudoobscura and D. subobscura showing no impact, whereas D. melanogaster males had reduced mating success. The dye method presented is applicable to a wide range of experimental designs.

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Davranış Tahliller için Boyama Böcekler: anestezi ve Çiftleşme Davranışı<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

Nörobilim

<meta charset="utf8"></head><body>Drosophila Göz Modellerinde Ommatidia'nın Tarafsız Ölçümü

Quantifying Drosophila melanogaster Eye Phenotypes: A Computational Approach Integrating ilastik and Flynotyper

The Drosophila melanogaster compound eye is a well-structured and comprehensive array of around 800 ommatidia, exhibiting a symmetrical and hexagonal pattern. This regularity and ease of observation make the Drosophila eye system a powerful tool to model various human neurodegenerative diseases. However, ways of quantifying abnormal phenotypes, such as manual ranking of eye severity scores, have limitations, especially when ranking weak alterations in eye morphology. To overcome these limitations, computational approaches have been developed such as Flynotyper. The use of a ring light allows for better qualitative images accessing the intactness of individual ommatidia. However, these images cannot be analyzed by Flynotyper directly due to shadows on ommatidia introduced by the ring light. Here, we describe an unbiased way to quantify rough eye phenotypes observed in Drosophila disease models by combining two software, ilastik and Flynotyper. By preprocessing the images with ilastik, successful quantification of the rough eye phenotype can be achieved with Flynotyper.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Frontotemporal Demans ile Amyotrofik Lateral Skleroz Drosophila Modellerinde Kaba Göz Fenotiplerinin Ölçülmesi

The Drosophila eye system is a useful tool for studying various biological processes, particularly human neurodegenerative diseases. However, manual quantification of rough eye phenotypes can be biased and unreliable. Here we describe a method by which ilastik and Flynotyper are used to quantify eye phenotype in an unbiased way.

Drosophila melanogaster Göz Fenotiplerinin Ölçülmesi: ilastik ve Flynotyper'ı Entegre Eden Hesaplamalı Bir Yaklaşım

The Drosophila melanogaster compound eye is a well-structured and comprehensive array of around 800 ommatidia, exhibiting a symmetrical and hexagonal ...

Gelişim Biyolojisi

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila pupa Karın İmmünohistokimya

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Biyoloji

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Uygulamalarda Kantitatif Karşılaştırılması Cis</emTransgenik>-Regulatory Element (CRE) Etkinlikler Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is initiated by photon absorption-inducing isomerization of the chromophore, promoting conformational changes of the opsin and resulting in a second dark-stable photopigment state (metarhodopsin, M). Investigation of this bi-stable photopigment using random mutagenesis requires simple and robust methods for screening mutant flies. Therefore, several methods for measuring reductions in functional photopigment levels have been designed. One such method exploits the charge displacements within the photopigment following photon absorption and the huge amounts of photopigment molecules expressed in the photoreceptors. This electrical signal, named the early receptor potential (or early receptor current), is measured by a variety of electrophysiological methods (e.g., electroretinogram and whole-cell recordings) and is linearly proportional to functional photopigment levels. The advantages of this method are the high signal-to-noise ratio, direct linear measurement of photopigment levels, and independence of phototransduction mechanisms downstream to rhodopsin or metarhodopsin activation. An additional electrophysiological method called prolonged depolarizing afterpotential (PDA) exploits the bi-stability of Drosophila photopigment and the absorption-spectral differences of fly R and M pigment states. The PDA is induced by intense blue light, converting saturating amounts of rhodopsin to metarhodopsin, resulting in the failure of light-response termination for an extended time in darkness, but it can be terminated by metarhodopsin to rhodopsin conversion using intense orange light. Since the PDA is a robust signal that requires massive photopigment conversion, even small defects in the biogenesis of the photopigment lead to readily detected abnormal PDA. Indeed, defective PDA mutants led to the identification of novel signaling proteins important for phototransduction.

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

We present a protocol to electrophysiologically characterize bi-stable photopigments: (i) exploiting the charge displacements within the photopigment molecules following photon-absorption and their huge amount in the photoreceptors, and (ii) exploiting the absorption-spectra differences of rhodopsin and metarhodopsin photopigment states. These protocols are useful to screen for mutations affecting bi-stable photopigment systems.&#160;

Drosophila Fotoreseptörlerinde Fotopigment Düzeylerini Ölçmek için Elektrofizyolojik Yöntemler

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

Drosophila melanogaster Malpighi tübül epiteli optik Quantification intrasellüler pH floresan genetik olarak kodlanmış pH göstergesi

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary changes. In particular, the adult stage is a rich source of morphological traits for interspecific comparison, including wing pigmentation comparison. To study developmental differences among species, detailed observation and appropriate staging are required for precise comparison. Here we describe protocols for staging of pupal periods and quantification of wing pigmentation in a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera. First, we describe the method for detailed morphological observation and definition of pupal stages based on morphologies. This method includes a technique for removing the puparium, which is the outer chitinous case of the pupa, to enable detailed observation of pupal morphologies. Second, we describe the method for measuring the duration of defined pupal stages. Finally, we describe the method for quantification of wing pigmentation based on image analysis using digital images and ImageJ software. With these methods, we can establish a solid basis for comparing developmental processes of adult traits during pupal stages.

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Protocols for staging pupal periods and measurement of wing pigmentation of Drosophila guttifera are described. Staging and quantification of pigmentation provide a solid basis for studying developmental mechanisms of adult traits and enable interspecific comparison of trait development.

Evreleme pupa dönemi ve ölçüm kanat pigmentasyon Drosophila guttifera yöntemleri

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary ...

Karın Pigmentasyonunun Karaciğer Miktarında Nicelleştirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Drosophila Kullanan Heterokromatin-Teşvik Edici İlaçların Tanımlanması nda Bir Tarama Yöntemi

Davranış Tahliller için Boyama Böcekler: anestezi ve Çiftleşme Davranışı

Drosophila melanogaster Göz Fenotiplerinin Ölçülmesi: ilastik ve Flynotyper'ı Entegre Eden Hesaplamalı Bir Yaklaşım

Drosophila melanogaster Göz Fenotiplerinin Ölçülmesi: ilastik ve Flynotyper'ı Entegre Eden Hesaplamalı Bir Yaklaşım

Drosophila melanogaster Göz Fenotiplerinin Ölçülmesi: ilastik ve Flynotyper'ı Entegre Eden Hesaplamalı Bir Yaklaşım

Drosophila pupa Karın İmmünohistokimya

Uygulamalarda Kantitatif Karşılaştırılması Cis-Regulatory Element (CRE) Etkinlikler Drosophila melanogaster

Drosophila Fotoreseptörlerinde Fotopigment Düzeylerini Ölçmek için Elektrofizyolojik Yöntemler

Drosophila melanogaster Malpighi tübül epiteli optik Quantification intrasellüler pH floresan genetik olarak kodlanmış pH göstergesi

Evreleme pupa dönemi ve ölçüm kanat pigmentasyon Drosophila guttifera yöntemleri