Bu yöntem, farklı hücre türlerinin nasıl oluşturulduğu ve belirli işlevlere sahip daha yüksek sıra yapılarhalinde nasıl organize edilebildiği gibi biyolojideki önemli soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, transkripsiyonel ve genomik analiz için Drosophila görme sisteminde düşük bir bollukta bulunan hücrelerin etkin bir şekilde arınmasını kolaylaştırmasıdır. Protokolün altıncı haftası Salı günü, diseksiyondan 45 dakika önce, dört santigrat dereceden bir şişe papain tozu alın ve oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, komple Schneider's Medium veya CSM'i oda sıcaklığında bir Eppendorf tüpünde bir kenara koyun ve daha sonra papain tozuna ekleyin. Diseksiyondan beş ila on dakika önce, oda sıcaklığındaki CSM'yi doğrudan kapaktan mililitre başına 100 birim lik bir konsantrasyona çıkarmak için bir şırınga kullanın. Karıştırmak için, önce kapağın içine sıkışmış herhangi bir toz yakalamak için şişe ters ve sonra pipet yukarı ve aşağı içeriğini.
Reaktifleri karıştırdıktan sonra, suyu su banyosundaki bir kabın içinde 37 dereceye kadar getirin. Sonra papain etkinleştirmek ve şişe yüzen olmadığından emin olmak için 30 dakika boyunca kabın içinde şişe yerleştirin. Papain kuluçka yakarken, dondurucudan proteolitik enzim karışımının aliquot'unu alın ve oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
Aktivasyon 30 dakika sonra, oda sıcaklığında papain kuluçka. Altı haftanın Salı günü, temiz çökezmelerle soğuk CSM'de sahnelenen gözbebeği beyinlerini inceleyin. 10 dakikada mümkün olduğunca çok beyni kesip beyni yeni bir soğuk CSM damlasında birleştirin.
Optik lob ve merkezi beyin kavşağında çimdikleyerek optik lobları kesin. Daha sonra, 1x RS 500 mikrolitre içeren bir mikrotüp altına loblar ekleyin. Deneysel doku için bir mikrotüp ve negatif kontrol dokusu için bir mikrotüp. Tüpleri buzda tut.
Bir saatte mümkün olduğunca çok lob ları inceleyin. Mikrotüpler arasında transfer sırasında doku kaybını ortadan kaldırmak için tek bir mikrotüp içinde diseksiyon optik loblar Havuzu. P200 pipetkullanarak parçalanmış optik loblarla mikrotüpten 1x RS'yi dikkatlice çıkarın ve lobları kapsayacak kadar çözelti bırakın.
Tüpün yan tarafına 500 mikrolitre 1x RS ekleyin. Loblar tüpün dibine yerleşsin, sonra 200 mikrolitre kadar pipet. Karışımı dışarı at, lobların hareket etmesini gözlemle ve lobların tekrar yerleşmesine izin ver.
İki örnek için, aliquot 600 mikrolitre aktif, oda sıcaklığında papain bir mikrotüp içine. Sonra, dissociation çözüm oluşturun. 600 mikrolitre papain çözeltisine oda sıcaklığında 4,2 mikrolitre proteolitik enzim karışımı ekleyin ve mililitre başına 0,18 WU'luk son konsantrasyonu elde edin ve çözeltiyi yukarı ve aşağı boruhaline getirerek karıştırın.
Daha sonra her örnekten 1x RS'yi dikkatlice çıkarın ve loblara 300 mikrolitre ayrışma çözeltisi ekleyin. Örnekleri 25 derecede kuluçkaya yatırın. 1, 000 RPM bir mikrotüp ThermoMixer 15 dakika için.
5 ve 10 dakikalık zaman noktalarında ThermoMixer'ı durdurun ve lobların mikrotüpün dibine batmasına izin verin. Pipet kadar 200 mikrolitre çözelti ve karıştırın. 15 dakikalık kuluçkadan sonra, lobların dibe yerleşmesini bekleyin ve lobları rahatsız etmeden ayrışma çözümlerini dikkatlice loblardan çıkarın.
Lobları 1x RS ile iki kez yıkayın. Lobları rahatsız etmeden 500 mikrolitre 1x RS ekleyin. Daha sonra 200 mikrolitrekadar dikkatli bir şekilde pipet ve yavaşça çözelti dışarı. Lobların dibe batmasını bekleyin ve tekrarlayın.
Ardından, her numuneyi 500 mikrolitre CSM ile iki kez yıkayın. CSM'yi dikkatlice çıkarın ve tüpe 200 mikrolitre daha CSM ekleyin. P200 pipetkullanarak, çözelti homojen olana kadar köpüklenmeden yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak dokuyu bozun.
P200 pipetkullanarak, hücre süspansiyonuna 30 mikrometrelik bir kafes kapağından buz üzerinde 5 mililitrelik faks tüpüne filtre uygulayın. Ve tüm süspansiyonun gittiğinden emin ol. Dissociation mikrotüp durulamak için CSM 500 mikrolitre ekleyin.
Ve çözümü faks tüpüne süzün. Son olarak, faks tüpünün kapağını dikkatlice çıkar. P200 ile kafes filtresinin altındaki çözümü toplayın ve faks tüpündeki süspansiyonun geri kalanına ekleyin.
Lamina ve Medulla nöropillerine referans olarak DsRed ve GFP'ye özgü antikorları olan immün omükal mikroskobların konfokal mikroskobu, L3'ün optik lobda Hem DsRed hem de GFP tarafından etiketlenmiş tek hücre tipi olduğunu doğruladı. 100, 000 olaydan elde edilen gerçekler kaydedildi ve bunların %29,9'u potansiyel bekarlar. Farklı boyutlardaki hücrelerdeki çiftlemeler granülerite ve boyuta göre çıkarıldıktan sonra, geri kalan tek hücreler, L3 nöronlar, P1'de arka plan hücrelerinden iyi ayrılmış sıkı kümeler olarak ortaya çıktı.
Bu prosedürü takiben, sırasıyla gen ekspresyonu veya kromatin organizasyonu analizi ile biyolojik soruları ele almak için RNA-seq veya ATAC-seq gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu teknik, araştırmacıların Drosophila görme sistemini bir model olarak kullanarak karmaşık dokuların gelişimini ve işlevini nihave etmeyi temel alan genetik mekanizmaları keşfetme yeteneğini önemli ölçüde geliştirmesini önemli ölçüde geliştirmez.
