Bu yöntem Drosophila erkek aksesuar bezi nadir bir hücre popülasyonunun transkripsiyonanalizine izin verir, ikincil hücreler olarak adlandırılan, ve onları üreme başarısı için kritik hale genleri ortaya çıkarır. Bir gün içinde, bu teknik farklı genotip ikincil hücrelerin ayıklanması ve sonraki qPCR veya RNA sıralama için toplam RNA çıkarılması sağlar. Bazen projeler başlangıç malzemesi nadir ile sınırlıdır.
Bu yöntem, nadir bir hücre popülasyonu ile çalışma zorluğu yla karşı karşıya olan diğer gruplar için temel sağlayabilir. İşlemin 40 bez birikmesi gerektiğinden, diseksiyonları uygulamak önemlidir. Ev yapımı pipet ipuçları hazırlanması da önemlidir, ve bu yüzden nasıl yapmak ve önceden hazırlamak için video üzerinde görselleştirmek gerekir.
İşleme başlamadan önce, kesme ve alev yuvarlak, geniş, bezleri işlemek için 200 mikrolitre ipuçları, ve birden fazla 1, 000 mikrolitre uçları bir alev yakın bir saniyeden daha az açıklıkları daraltmak için ucu açılış geçmek. Ardından, değiştirilmiş ipuçlarını aspirasyon hızlarına göre daha dardan daha geniş lere doğru sıralayın. Erişkin bezi diseksiyonu için, buz üzerinde cam bir çanak 20 ila 25 erkek Drosophila yerleştirin ve bir erkek sinek üreme yolu kaldırmak için forseps ve diseksiyon mikroskop kullanın.
Testisler ve boşalma ampulü de dahil olmak üzere diğer tüm dokulardan aksesuar bezi çiftini temizleyin ve aksesuar bezlerini oda sıcaklığında serum takviyesi içeren bir cam plakaya aktarın. 20 çift aksesuar bezi toplandığında, bezleri oda sıcaklığında bir ila iki dakika boyunca PBS'nin bir kabında yıkayın. Yıkamasonunda, bezleri taze hazırlanmış ayrıştırma çözeltisine aktarın ve glandüler lobun ortasını sıkıca çimdiklemek için bir kesme mikroskobu altında keskin forsepsler kullanın.
Forceps ikinci bir çift kullanarak, aksesuar bezi ve ikincil hücreleri içeren bezin bölümü boşalma kanalı proksimal bölge ayırmak için keskin ucu ile doku kesti. Peptidazlar aksi dış kas tabakası ve bezinin lümen viskoz meni sıvısı tarafından korunan hücrelere ulaşabilirsiniz böylece bezleri kesin. Daha sonra, 1.5 mililitrelik bir tüp bezleri aktarmak için önceden ıslak, alev yuvarlak, geniş, 200 mikrolitrelik pipet ucu kullanın.
Doku sindirimi için tüpü dakikada 1.000 dönüşte 60 dakika boyunca 37 derecelik bir santigrat shaker'a yerleştirin. Kuluçka sonunda, serum takviyeli orta bir mililitre ile sindirim durdurmak ve 24-well plaka örnekleri aktarmak için önceden ıslak, alev yuvarlak, geniş, 1, 000 mikrolitrelik pipet ucu kullanın. Hücreleri floresan mikroskop altında GFP ifadeleri için kontrol edin.
Bez uçlarının çoğu sağlam görünmeli ve birkaç ikincil hücre ayrılmalıdır. Aksesuar bezi dokusunu bozmak için hücreleri 3-5 kez hafifçe triturate için yuvarlak, dar, 1, 000 mikrolitrelik pipet ucu kullanın. Daha sonra, hücreleri bireyselleştirmek için çok dar, yuvarlak, 1,000 mikrolitrelik pipet ucu 1-2 kez kullanın.
Hücrelerin 15 dakika yada 15 dakika yerleşmesine izin verin. Hücrelerin mikroskop altında sağlıklı göründüğünü doğrulayın ve fazla ortamı çıkarın. Daha sonra hücreleri 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve kalan hücreleri kurtarmak için kuyuları taze orta ile durulayın.
Abd-B-GAL4 yapısı bu deneylerde ikincil değil, GFP ile ana hücreleri etiketlemek için kullanılabilir. Bu çalışmada her iki hücre tipi yabani tip ve iab-6cocuD1 mutant aksesuar bezlerinden ayrıştı. Bu D1 mutant abd-b ve MSA transkript, ikincil hücre gelişimi, morfolojisi ve fonksiyonu etkileyen ifade yoksundur.
Hücre bölünmesinden sonra, DRAQ7'ye dayalı canlı hücreleri seçmek için FACS, ikincil hücreleri ve ana hücreleri izole etmek için GFP floresans düzeyi kullanılır. RNA her hücre popülasyonundan çıkarılır ve sonraki RT-qPCR ve sıralama için numune başına iki nanograma ayarlanır. Yabani tip ana ve sekonder hücre ekstrelerinde belirli genlerin gerçek zamanlı kantitatif PCR ile ekspresyonunun ölçülmesi, ikincil hücre genlerinin Rab19 ve MSA'nın sadece ikincil hücre ekstrelerinden saptandığını, ana hücre geni cinsiyet peptidinin ise sadece ana hücre örneklerinden saptandığını ortaya koymaktadır.
Üç vahşi tip ve üç mutant çoğaltma RNA sıralama verileri üzerinde temel bileşen analizi vahşi tip birbirine yakın ve mutant örnekleri uzak hem de küme çoğaltır ortaya koymaktadır. Belirli genlerle uyumlu okumaların görselleştirilmesi, aktin 5C gibi temizlik genlerinin ve rab19 ve Dve gibi ikincil hücrespesifik genlerin her iki genotipte de ifade edildiğini göstermektedir. Ancak MSA için, yabani sineklerde gözlenen genin güçlü ifadesi mutant suşlarında kaybolur.
Başarılı bir işlem için yeterli canlı ayrışmış ikincil hücrelerin elde edilmesi önemlidir. Böylece, küçük ölçekli deneyde diseksiyon ve dissosiasyon protokolünü doğrulayın. Bu yöntem, her iki hücre tipi aksesuar bezinin az sayıda sinekten ayrıştırılmasını sağlayarak, bu hücrenin transkripsiyonel olarak birden fazla genetik veya çevresel koşullara nasıl tepki verdiğini araştırmasını sağlar.
Erkek üreme başarısı genotip, yaş ve çiftleme durumu da dahil olmak üzere birçok şey, etkilendiği bilinmektedir. Bu yöntemin kolaylığı bize bu faktörlerin aksesuar bezi transkripsiyonnasıl etkilediğini araştırmak için izin vermelidir.
