Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Visualisierung von dendritischen Wirbelsäulenmorphologien und Kalziumtransienten in C.elegans-Neuronen. Unser Ansatz sollte genetische Ansätze erleichtern, um Determinanten einer Wirbelsäulenmorphogenese und -funktion zu entdecken. Unser Protokoll enthält dendritische Dornen in GABAergen Neuronen.
Auch Stacheln in anderen Klassen von C.elegans-Neuronen können mit diesen Methoden untersucht werden. Unser Protokoll beschreibt Methoden zur Immobilisierung lebender C.elegans. Es ist besonders wichtig, Tierbewegungen während der Bildaufnahme zu verhindern und die richtigen Laserkonfigurationen auszuwählen, um neuronale Aktivität anzuregen und aufzuzeichnen.
Um hochauflösende Bilder zu erhalten, fügen Sie drei Mikroliter Anästhesielösung hinzu und geben Sie 15 bis 20 junge erwachsene Würmer auf 10% Agarose-Pads. Tragen Sie dann das Deckglas auf, um die Würmer zu immobilisieren, und versiegeln Sie die Deckglasränder mit einer geschmolzenen Klebstoffdichtstoffmischung. Für eine hochauflösende Erfassung verwenden Sie ein konfokales Laserscanning-Mikroskop, das mit hochauflösender Mikroskopie ausgestattet ist.
Erwerben Sie Z-Stacks mit der von der Software des Herstellers empfohlenen Schrittweite. Sammeln Sie eine Reihe optischer Schnitte, die das Gesamtvolumen des dorsalen D- oder DD-ventralen Prozesses umfassen. Senden Sie die Z-Stacks zur Bildverarbeitung mit der Software des Herstellers und analysieren Sie Bilder mit einer Punktzahl von mehr als sieben.
Verwenden Sie für die Nyquist-Erfassung ein konfokales Laserscanning-Mikroskop und wählen Sie die optimale Pixelgröße für die Wellenlänge des Lichts und die numerische Apertur des Objektivs. Dann reichen Sie den Stack für die 3D-Dekonvolution mit einem automatischen Algorithmus ein. Verwenden Sie für die Bildanalyse eine geeignete Bildverarbeitungssoftware, um Projektionen mit maximaler Intensität der Z-Stacks zu erstellen.
Und zählen Sie manuell die Vorsprünge auf dem DD-Dendriten. Bestimmen Sie dann die Länge des bewerteten DD-Dendriten, um die Dichte der Dornen pro 10 Mikrometer DD-Dendrit zu berechnen. Dann klassifizieren Sie die Stacheln als dünn oder Pilz, filopodial, stumpf oder verzweigt.
Mit herkömmlichen Techniken wie Mikroinjektion erzeugen transgene Würmer, die den Kalziumsensor GCaMP in DD-Neuronen exprimieren, und Chrimson, ein rotverschobenes Kanalrhodopsin in präsynaptischen VA-Neuronen. Als nächstes bereiten Sie unter einer laminaren Haube alle transretinalen oder ATR-Platten vor, indem Sie 300 Mikroliter über Nacht gewachsene OP50-Bakterienkultur und 0,25 Mikroliter ATR zu jeder 60-Millimeter-Nematoden-Wachstumsmedium-Nährstoff-Agarplatte hinzufügen. Dann verteilen Sie die Kultur mit einem sterilen Glasstab.
Für Kontrollplatten fügen Sie 300 Mikroliter OP50-Bakterien und 0,25 Mikroliter Ethanol hinzu. Um das Bakterienwachstum zu ermöglichen, inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei Raumtemperatur, geschützt vor Umgebungslicht. Um das Experiment einzurichten, platzieren Sie fünf Larven der L4-Stufe auf OP50-gesäten ATR- oder Kontrollplatten und inkubieren Sie die Platten im Dunkeln bei 23 Grad Celsius.
Verwenden Sie nach drei Tagen ein Stereo-Seziermikroskop, um die Entwicklung der Vulva zu bestätigen, und wählen Sie L4-Nachkommen aus der ATR und den Kontrollplatten für die Bildgebung aus. Als nächstes legen Sie zwei Mikroliter 0,05 Mikrometer Polyperlen auf einen Objektträger. Und legen Sie ungefähr 10 L4-Larven in die Lösung.
Fügen Sie der Lösung mit einem Platindraht eine kleine Kugel Sekundenkleber hinzu. Schwenken Sie die Lösung vorsichtig, um filamentöse Klebstoffstränge zu erzeugen. Dann fügen Sie drei Mikroliter M9-Puffer hinzu.
Tragen Sie dann einen Abdeckstreifen auf und versiegeln Sie seine Kanten, wie zuvor gezeigt. Um evozierte Kalziumtransienten in den dendritischen Dornen aufzuzeichnen, verwenden Sie ein konfokales Spinning-Disk-Mikroskop und stellen Sie den Mikroskoptisch so ein, dass die DD-Dornen in der Fokusebene positioniert werden. Richten Sie dann eine Zeitraffererfassung ein, um die Probe mit einer 488-Nanometer-Laserlinie in jedem Bild zur Detektion der GCaMP-Fluoreszenz und einer 561-Nanometer-Laserlinie in regelmäßigen Abständen für die Chrimson-Anregung zu beleuchten.
Verwenden Sie für die In-vivo-Kalziumbildgebung 2D-Dekonvolution und Bildausrichtung, um geringfügige Abweichungen von der Wurmbewegung während der Aufnahme zu korrigieren. Definieren Sie dann die DD-dendritische Wirbelsäule als die Region von Interesse oder ROI. Duplizieren Sie den ROI und verschieben Sie ihn in eine benachbarte Region innerhalb des Wurms, um das Hintergrundsignal zu erfassen.
Exportieren Sie dann mit geeigneter Software die GFP-Intensitäten für jeden Zeitpunkt nach Excel und subtrahieren Sie die Hintergrundfluoreszenz von der ROI-Fluoreszenz der Wirbelsäule. Bestimmen Sie die Änderung der Fluoreszenz, indem Sie die GFP-Fluoreszenz im Rahmen unmittelbar vor der 561-Nanometer-Anregung oder bei Null von jedem Zeitpunkt nach der Anregung oder Delta F subtrahieren.Dann dividieren Sie durch F Null, um Delta F über F Null zu bestimmen. Und stellen Sie die normalisierten Ablaufverfolgungen grafisch dar.
Stellen Sie zunächst mit einem Shapiro-Wilk-Test fest, ob die Daten normal verteilt sind. Verwenden Sie für Daten, die nicht normalverteilt sind, eine nicht-parametrische ANOVA mit Post-hoc-Korrektur für mehrere Tests. Alternativ können Sie für Messungen, die eine Normal- oder Gaußverteilung zeigen, einen gepaarten parametrischen ANOVA-Test für jede Messung der GCaMP-Fluoreszenz vor und nach jedem 561-Nanometer-Puls durchführen.
Und korrigieren Sie mehrere Vergleiche in jeder der beiden Gruppen. Die Markierung von DD-dendritischen Dornen mit drei unabhängigen Markern, zytosolischer mCherry, MYR:mRuby und LifeAct:GFP, ergab eine durchschnittliche Dichte von 3,4 DD dendritischen Dornen pro 10 Mikrometer DD-Dendrit bei jungen Wildtyp-Erwachsenen. Der GFP:Utrophin-Marker wurde von dieser Analyse ausgeschlossen, da er eine signifikant geringere Wirbelsäulendichte ergab, möglicherweise aufgrund von Wechselwirkungen von Utrophin mit dem Aktinzytoskelett, das die Wirbelsäulenmorphogenese antreibt.
Der Live-Cell-Imaging-Ansatz bestätigte, dass die dünne pilzförmige Morphologie der DD-Stacheln beim Erwachsenen im Vergleich zu alternativen Wirbelsäulenformen wie Filopodial, Stubby und Branch vorherrscht. Die Aktivierung von DD-dendritischen Stacheln wurde durch präsynaptische cholinerge Signale in transgenen Würmern, die GCaMP in DD-Neuronen exprimieren, und Chrimson in präsynaptischen VA-Neuronen bewertet. Transiente Ausbrüche des GCaMP-Signals wurden in DD-Stacheln unmittelbar nach der optogenetischen Aktivierung von Chrimson in präsynaptischen VA-Neuronen nachgewiesen.
Ein Kontrollexperiment in Abwesenheit von ATR bestätigte, dass die Messung des GCaMP-Signals von der optogenetischen Aktivierung von Chrimson abhängt, die streng ATR-abhängig ist. Um DD-Stacheln zu visualisieren, ist es am besten, Tiere auf der Seite zu sehen, wie die Stacheln, die im rechten Winkel zum Lichtpfad stehen. Mit dieser Methode können Wissenschaftler auch pharmakologische Manipulationen verwenden, um die Mechanismen zu verstehen, die Kalziumtransienten in DD-Stacheln antreiben.
