Wir danken James Perna für die grafische Darstellung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institute of Mental Health, um YZ unterstützt

Genehmigung braucht, um von zu Hause aus Institutionen vor Beginn der Operation und bildgebenden Studie gewonnen werden. In dieser Handschrift beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften von der University of California, Santa Cruz Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss durchgeführt. 1. Chirurgie <ol><li> Autoklav alle chirurgischen Instrumenten und sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Alkohol gründlich vor der Operation. </li><li> Anesthetize die Maus durch intraperitoneale (IP) Injektion von KX Anästhesielösung (200 mg / kg Ketamin und 20 mg / kg Xylazin) nach der Mauskörpergewicht. Hinweis: KX Dosierung kann je nach Stamm, Alter angepasst und Gesundheitsstatus der Mäuse. Veterinär Beratung, die optimale Dosis zu bestimmen ist ebenfalls empfehlenswert. </li><li> Führen Sie eine Zehe-Pinch-Test in regelmäßigen Abständen durch Drücken der Maus die Zehen und die Überprüfung für eine reflexive Reaktion auf die Anästhesie-Status überwachen.Stellen Sie sicher, dass die Maus vollständig vor Beginn der Operation betäubt. Hinweis: Bei längerer Imaging-Sitzungen, überprüfen Sie den Status der Anästhesie Maus regelmäßig, verwalten zusätzlichen KX wenn nötig. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf einem Heizkissen, um die Körpertemperatur während der Operation zu erhalten. </li><li> Rasieren Sie den Kopf der Maus mit einer Rasierklinge die Kopfhaut aus. </li><li> Sterilisieren Sie die rasierte Fläche durch Abwischen der Haut mit Alkohol-Pads und Wechsel betadine. Entfernen Sie alle Resthaarabschnitten. </li><li> Augensalbe, beide Augen zu schmieren vorsichtig anwenden, damit verhindert bleibende Schäden durch Austrocknung während des Experiments verursacht. </li><li> Machen Sie einen geraden Schnitt entlang der Mittellinie der Kopfhaut, und bewegen Sie die Haut seitlich zu den Rändern des Schädels. </li><li> Entfernen Sie das Bindegewebe am Schädel befestigt. </li></ol> 2. Verdünnt Schädel-Vorbereitung <ol><li> Identifizieren Sie den Abbildungsbereich auf Basis von ster. eotaxic Koordinaten Hinweis: Versuchen Sie, große Blutgefäße, die Blocklichteinfall zu vermeiden und verwischen die abgebildeten Strukturen. Gefäßsystem lässt sich am besten beobachten, wenn der Schädel ist feucht mit steriler Kochsalzlösung. </li><li> Verwenden Sie den High-Speed-Mikrobohrer dünne einem kreisförmigen Bereich von Schädel (0,5 bis 1,0 mm Durchmesser). Bewegen Sie den Bohrer parallel zur Schädeloberfläche, anstatt hielt es gegen den Schädel und nach unten drücken. Drill, bis sowohl die äußere kompakte Knochenschicht und der Mittel spongiösen Knochenschicht entfernt werden. Hinweis: Um Schäden durch Überhitzung zu vermeiden, sollten längeren Kontakt zwischen dem Bohrmeißel und dem Schädel. </li><li> Weiterhin Verdünnen des inneren kompakten Knochenschicht mit einer mikrochirurgischen Klinge in der Mitte der Drill verdünnten Bereich. Halten Sie die mikro Klinge in einem Winkel von etwa 45 ° um den Schädel ohne Niederdrücken gegen den Schädel, bis eine gleichmäßig verdünnte kleinen Bereich (200-300 &amp;mgr; m Durchmesser) mit einer Dicke von ungefähr kratzenly 20-30 &amp;mgr; m erhalten wird. . Aufgrund der Eigenfluoreszenz des Schädels, kann die Dicke durch Abtasten des Abstandes zwischen der oberen und unteren Oberfläche des Schädels unter dem Zwei-Photonen-Mikroskop gemessen werden Hinweis: Obwohl ein Schädel Dicke von weniger als 20 um eine gute Bildqualität, es wird nicht empfohlen, weil es die Ausdünnungsprozess in nachfolgenden Re-Imaging-Sitzungen schwierig. Eine Überverdünnung zu verhindern, die Dicke des Schädels muß während der Operation periodisch überprüft werden (siehe Diskussion). </li></ol> 3. Immobilisierung <ol><li> Knochentrümmer vorsichtig entfernen. </li><li> Setzen Sie einen kleinen Tropfen Sekundenkleber an jeder Kante der Mittelöffnung der sterilen Kopfplatte, die seit autoklaviert hat (siehe Abbildung 1). Halten Sie die Kopfplatte fest gegen den Schädel mit dem verdünnten Bereich in der Mitte der Öffnung befindet Hinweis:. Wenn der Kleber verunreinigt die ausgedünnten region durch Unfall, entfernen Sie ihn vorsichtig mit der mikrochirurgischen Klinge. </li><li> Ziehen Sie die Haut von den Seiten des Schädels, um die Kanten der Mittelöffnung der Kopfplatte. </li><li> Warten Sie etwa 10 Minuten, bis die Kopfplatte ist gut mit dem Schädel befestigt. </li><li> Legen Sie die Kopfplatte auf zwei Seitenblöcke der Halteplatte und die Schrauben über die Kanten der Kopfplatte festziehen, um die Maus auf der Halteplatte zu immobilisieren (siehe Abbildung 1). Hinweis: Stellen Sie sicher, dass es keine Haut-oder Schnurrhaare zwischen die Kopfplatte und die Blöcke vor dem Anziehen der Schrauben. Eine gute Vorbereitung sollte immobilisierten keine beobachtbare Bewegung des Schädels unter dem Binokular zu zeigen, wenn der Rücken des Tieres streichelte sanft ist. </li><li> . Spülen ausgesetzt Schädel mit Kochsalzlösung, um nicht polymerisierte Klebstoff entfernen Hinweis: Es ist wichtig, um alle verbleibenden Klebstoff zu entfernen, wie nichtpolymerisierten Leim verwischt Bilder und Schäden Mikroskopobjektive &lt;./ Li&gt; </ol> 4. Imaging <ol><li> Nehmen Sie ein Foto von dem Gefäßsystem des Schädels ausgesetzt mit der verdünnten Bereich als Karte ein, die verwendet wird, um die abgebildeten Region in den folgenden Imaging-Sitzungen zu verlegen (siehe Abbildung 2). </li><li> Platzieren Sie die Maus unter dem Mikroskop Bildgebung. Suchen Sie den verdünnten Bereich unter einem 10X Luftziel mit Epi-Fluoreszenz und bewegen Sie den dünnsten Bereich in den Mittelpunkt der Ansicht. </li><li> Fügen Sie einen Tropfen Kochsalzlösung auf der Oberseite des Schädels und wechseln Sie in das 60X Objektiv, das mit sterilem Wasser gespült wurde. Wählen Sie eine Region, wo einzelne dendritische Dornen sind klar entlang Dendriten visualisiert. Identifizieren und beschriften Sie die entsprechende Region auf der Karte 1 durch den Vergleich zwischen der Gefäß epifluoreszenten Ansicht und der Gefäß Foto. </li><li> Tune die Zwei-Photonen-Laser-Wellenlänge nach der Fluorophore. Zum Beispiel 920 nm für YFP; 890 nm für GFP; 1000 nm für DsRed und tdTomato 24. </li><li> Erwerben Bildstapeln mit 2um Schritte auf Verwendung des 60X Ziel der z-Achse. Dieses Bild Stapel umfasst eine ca. 200 um x 200 um Bereich (512 x 512 Pixel) und wird als Karte 2 für die Verlagerung bei der anschließenden Imaging-Sitzungen verwendet wird (siehe Abbildung 2). </li><li> Erwerben neun Bildstapel in Karte 2 mit 3fach digitalem Zoom. Jeder Bildstapel umfasst eine Fläche von ungefähr 70 um x 70 um (512 x 512 Pixel), mit 0,7 &amp;mgr; m Schritten längs der z-Achse. Hinweis: Die Intensität des Lasers sollte unter 40 mW, wenn an Proben gemessen, um Phototoxizität zu minimieren. </li></ol> 5. Rettung <ol><li> Nach der Bebilderung, sanft lösen Sie die Kopfplatte aus dem Schädel. </li><li> Den Schädel und die Haut den ganzen restlichen Kleber entfernen, gründlich reinigen. Hinweis: Alle restlichen Kleber auf der Haut Reizungen verursachen und verlangsamen die Heilung der Haut, während der verbleibende Kleber auf dem Schädel wird die Erosion der Schädel und verursachen einengiogenesis in der neu gewachsenen Knochenschicht, so dass anschließende Umzug und Re-Imaging schwierig. </li><li> Spülen Sie den Schädel und die Haut mit Kochsalzlösung mehrmals. </li><li> Nähen Sie die Kopfhaut mit sterilen chirurgischen Naht. </li><li> Halten Sie das Tier auf einem Heizkissen in einem separaten Käfig. Verwalten Analgetikum Buprenorphin (0,1 mg / kg) subkutan an postoperativen Schmerzen zu mildern. Bringen Sie das Tier zum eigenen Käfig nach vollständiger Genesung. Überwachen Sie die Tier eng (mindestens einmal täglich kontrollieren), bis der Schnitt verheilt und Nähte entfernt werden. Verwalten folgenden Injektionen von Buprenorphin analgetisch, wenn nötig. </li></ol> 6. Reimaging <ol><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,1-1,8. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.6 </li><li> Suchen Sie zuvor abgebildeten Region durch den Vergleich der Gefäßmuster auf Karte 1 und die dendritische Verzweigungsmuster zu Karte 2. </li><li> Wenn Re-Imaging wird innerhalb von 1 Woche durchgeführt, wiederholen Sie Schritt 2.3, um die dünne Schicht der neu gewachsenen Knochen auf dem ausgedünnten wieder entfernenRegion mit Hilfe der mikrochirurgischen Klinge. Wenn Re-Imaging wird nach mehr als 1 Woche durchgeführt, wiederholen Sie die Schritte sowohl 2.2 und 2.3. Hinweis: Die neu gewachsenen Knochenschicht besteht aus einem weniger kondensierten Struktur im Vergleich zum ursprünglichen kompakte Knochenschicht, was zu einer reduzierten Bildqualität. Deshalb, um die gleiche Qualität zu erwerben, ist es notwendig, dünne Schädel etwas mehr als der bisherige Bildgebungssitzung. </li><li> Stellen Sie die Position und Ausrichtung zu Bildstapeln, die zuvor unter dem Bildstapel Zwei-Photonen-Mikroskop übereinstimmen erhalten. </li><li> Bilder zu erfassen, wie in Schritt 4.6. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.5 nach der Abbildung. </li></ol>

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	<li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain.">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).</li><li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex.">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).</li><li>Yu, X., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spine+plasticity+in+the+motor+cortex.">Spine plasticity in the motor cortex.</a> Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).</li><li>Harms, K. J., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+plasticity:+looking+beyond+development.">Dendritic spine plasticity: looking beyond development.</a> Brain research. 1184, 65-71 (2007).</li><li>Segal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+and+long-term+plasticity.">Dendritic spines and long-term plasticity.</a> Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).</li><li>Tada, T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+dendritic+spine+morphogenesis.">Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis.</a> Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).</li><li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines.">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature protocols. 5, 201-208 (2010).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).</li><li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull.">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature methods. 7, 981-984 (2010).</li><li>Szu, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cortical+window+technique+for+in+vivo+optical+coherence+tomography+imaging.">Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+formation+and+selective+stabilization+of+synapses+for+enduring+motor+memories.">Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories.</a> Nature. 462, 915-919 (2009).</li><li>Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+motor+learning+induces+coordinated+formation+of+clustered+dendritic+spines+in+vivo.">Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo.</a> Nature. 483, 92-95 (2012).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).</li><li>Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillar+amyloid+deposition+leads+to+local+synaptic+abnormalities+and+breakage+of+neuronal+branches.">Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches.</a> Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).</li><li>Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+instability+and+insensitivity+to+modulation+by+sensory+experience+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).</li><li>Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1+in+microglia+regulates+brain+amyloid+deposition+through+selective+protofibrillar+amyloid-beta+phagocytosis.">CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis.</a> J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).</li><li>Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+and+sensory+loss+on+glial+cells+in+mouse+visual+and+auditory+cortices.">Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices.</a> Glia. 60, 541-558 (2012).</li><li>Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embolus+extravasation+is+an+alternative+mechanism+for+cerebral+microvascular+recanalization.">Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization.</a> Nature. 465, 478-482 (2010).</li><li>Kelly, E. A., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+imaging+of+mouse+visual+cortex+using+a+thinned-skull+preparation.">Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation.">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain.">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+glioma+initiation+in+vivo+through+a+polished+and+reinforced+thin-skull+cranial+window.">Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+genetic+manipulation+of+dendrites+and+spines+in+the+mouse+cerebral+cortex+and+hippocampus+using+in+utero+electroporation.">Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental biology. 240, 237-246 (2001).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors.">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex.">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71, 995-1013 (2011).</li><li>Zariwala, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo.">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).</li><li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression.">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PloS one. 3, (2008).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Um eine erfolgreiche dünnten Schädel Präparat zu erhalten, sind mehrere Schritte in diesem Protokoll entscheidend. 1) Die Dicke des Schädels. Die Schädelknochen hat eine Sandwich-Struktur mit zwei Schichten aus kompaktem Knochen mit hoher Dichte und einer Mittelschicht aus Low-Density-spongiösen Knochen. Während der Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrer ist geeignet zum Entfernen der äußeren Schichten der kompakte Knochen und spongiösen Knochen, ist die mikrochirurgische Klinge ideal zum Verdünnen des inneren Schi...

Die Säugetier Kortex beteiligt sich an zahlreichen Hirnfunktionen, von der Sinneswahrnehmung und Bewegungssteuerung, um abstrakte Informationsverarbeitung und Kognition. Verschiedene kortikaler Funktionen bauen auf verschiedenen neuronalen Schaltkreisen, die aus verschiedenen Arten von Neuronen, die Kommunikation und den Austausch von Informationen an einzelnen Synapsen gemacht. Die Struktur und Funktion der Synapsen werden kontinuierlich in Abhängigkeit von Erfahrungen und Pathologien modifiziert. In reifen Gehirn nimmt die Form der synaptischen Plastizität beider Stärke Veränderungen und Hinzufügen / Entfernen von Synapsen, spielen eine wichtige Rolle in Bildung und Aufrechterhaltung eines funktionellen neuronalen Schaltkreisen. Dendriten sind die postsynaptischen Komponenten der Mehrzahl der Synapsen im Gehirn von Säugetieren. Die Konstante Umsatz-und morphologische Veränderungen von Stacheln dienen wahrscheinlich als ein guter Indikator für Veränderungen in der synaptischen Verbindungen 1-7 dienen. Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikropie bietet tiefe Penetration durch dicke, undurchsichtige Vorbereitungen und geringe Phototoxizität, die es für die Live-Darstellung im intakten Gehirn 8 geeignet ist. In Kombination mit Fluoreszenzmarkierung, bietet zwei-Photonen-Imaging ein leistungsfähiges Werkzeug, um in das lebende Gehirn zu spähen und folgen strukturelle Reorganisation an einzelnen Synapsen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Es wurden verschiedene Methoden verwendet, um Mäuse für Live-Imaging 9-13 vorzubereiten. Hier beschreiben wir eine dünnten Schädel Herstellung von in vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung, um die strukturelle Plastizität der postsynaptischen dendritischen Dornen in der Maus Kortex zu untersuchen. Mit diesem Ansatz haben unsere jüngsten Studien ein dynamisches Bild von dendritischen Dorn sich in Reaktion auf motorischen Lern Mit zunehmender Verfügbarkeit von transgenen Tieren mit fluoreszenzmarkierten neuronalen Teilmengen und schnelle Entwicklung der in-vivo-Markierungstechniken dargestellt, können hier beschriebenen ähnliche Verfahren auch angewendet werden, Untersuchungen zute anderen Zelltypen und kortikalen Regionen, zusammen mit anderen Behandlungen, wie auch in Krankheitsmodellen 16-23 verwendet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1253">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Ketamine</td>
			<td style="width:181px;">Bioniche Pharma</td>
			<td style="width:108px;">67457-034-10</td>
			<td style="width:775px;">Mixed with xylazine for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Xylazine</td>
			<td style="width:181px;">Lloyd laboratories</td>
			<td style="width:108px;">139-236</td>
			<td>Mixed with ketamine for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Saline</td>
			<td style="width:181px;">Hospira</td>
			<td style="width:108px;">0409-7983-09</td>
			<td>0.9% NaCl for injection and imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">Razor blades</td>
			<td style="width:181px;">Electron microscopy sciences</td>
			<td style="width:108px;">72000</td>
			<td>Double-edge stainless steel razor blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Alcohol pads</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:108px;">06-669-62</td>
			<td>Sterile alcohol prep pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Eye ointment</td>
			<td style="width:181px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:108px;">102-9470</td>
			<td>Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">High-speed micro drill</td>
			<td style="width:181px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:108px;">18000-17</td>
			<td>The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Micro drill steel burrs</td>
			<td style="width:181px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:108px;">19007-14</td>
			<td>1.4 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Microsurgical blade</td>
			<td style="width:181px;">Surgistar</td>
			<td style="width:108px;">6961</td>
			<td>The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Cyanoacrylate glue</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:108px;">NC9062131</td>
			<td>Fix the head plate onto the skull</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Suture</td>
			<td style="width:181px;">Havard Apparatus</td>
			<td style="width:108px;">510461</td>
			<td>Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td>SZ61</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">CCD camera</td>
			<td>Infinity</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Two-photon microscope</td>
			<td style="width:181px;">Prairie Technologies</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:775px;">Ultima IV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">10X objective</td>
			<td style="width:181px;">Olympus</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td>NA 0.30, air</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">60X objective</td>
			<td style="width:181px;">Olympus</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td>NA 1.1, IR permeable, water immersion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Ti-sapphire laser</td>
			<td style="width:181px;">Spectra-Physics</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td>Mai Tai HP</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon in vivo imaging of dendritic spines in the mouse cortex using a thinned-skull preparation

In der Säugetier Cortex, Neuronen äußerst kompliziert Netzwerken und den Austausch von Informationen an den Synapsen. Veränderungen in der synaptischen Stärke, sowie Hinzufügen / Entfernen von Synapsen, treten in einer Erfahrung abhängig und bietet die strukturelle Grundlage der neuronalen Plastizität. Wie postsynaptischen Komponenten der Synapsen in der Großhirnrinde werden dendritische Dornen als eine gute Proxy von Synapsen sein. Unter Vorteile der Mausgenetik und fluoreszierende Markierungstechniken, einzelne Neuronen und ihre synaptischen Strukturen im intakten Gehirn gekennzeichnet werden. Hier haben wir eine transkranielle Bildgebungsprotokoll einzuführen mit Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie zur fluoreszenzmarkierten postsynaptischen dendritischen Dornen im Laufe der Zeit in vivo zu folgen. Dieses Protokoll verwendet einen ausgedünnten Schädel Zubereitung, die den Schädel intakt hält und vermeidet inflammatorische Effekte durch die Exposition der Hirnhäute und die Rinde verursacht. Daher können Bilder sofort nach su erworben werdenrgery durchgeführt wird. Das experimentelle Verfahren kann wiederholt über verschiedene Zeitintervalle im Bereich von Stunden bis zu Jahren durchgeführt werden. Die Anwendung dieser Zubereitung kann auch erweitert werden, um verschiedenen kortikalen Regionen und Schichten sowie andere Zelltypen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen, werden.

In YFP-H Linie Mäusen 25 drückt gelb fluoreszierenden Proteins in einer Teilmenge der Schicht V pyramidalen Neuronen, die ihren apikalen Dendriten auf den oberflächlichen Schichten des Cortex projizieren. Durch den ausgedünnten Schädel Herstellung die fluoreszierend markierten dendritischen Segmente wiederholt unter Zwei-Photonen-Mikroskop über verschiedene Abbildungsintervalle abgebildet werden, im Bereich von Stunden bis Monaten. Hier zeigen wir ein Beispiel eines Vier-Zeitabbildung der gleichen Dendr...

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Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

17.8K Aufrufe.  University of California, Santa Cruz. Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Serie: Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Chronische Imaging of Mouse Visual Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Erkennung von mikroregionale Hypoxie in Maus-Großhirnrinde Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Verdünnt-skull Kortikale Fenster-Technik für<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...