ここでは、自然な細胞内ペプチドを保存し、細胞や組織の分解を避け、続いて同位体標識を用いたペプチドの相対的な定量化を行うプロテアーゼの速い熱不活性化に基づく指導方法について述べた。このラベリング方法には非常に多くの利点があります。この試薬は市販されており、安価で化学的に安定であり、1つの血清中で最大5個のサンプルの分析が可能です。
15%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを含むDMEMで15センチメートルの皿でヒト神経芽細胞細胞を培養することから始めます。5%の二酸化炭素の下で摂氏37度で細胞を維持します。PBSで細胞を2回洗い、PBSを10ミリリットル加え、細胞を掻き取り、15ミリリットルのチューブに集めます。
Gの800倍の細胞を5分間遠心し、上清を取り除きます。ペレットを80°Cの超精製脱イオン水の1ミリリットルで再懸濁し、チューブの内容物を2ミリリットルマイクロフュージチューブに移します。ゼブラフィッシュの熱不活性化後、2ミリリットルマイクロフュージチューブに脳全体を収集し、分析までマイナス80°Cで凍結します。
80°Cの超精製脱イオン水の1ミリリットルで組織サンプルを再中断し、1秒間の30パルスを使用してプローブで超音波処理します。細胞のlysateまたはホモジネート組織を摂氏80度で20分間インキュベートし、氷の上で10〜30分間冷却します。1ミリリットルのサンプル容量ごとに1モル塩酸ストック溶液10マイクロリットルを加えます。
20秒間渦を混ぜて混ぜ、氷の上で15分間インキュベートします。細胞のリセートまたはホモゲネート組織を摂氏4度で12,000倍のGで15分間遠心する。低結合タンパク質マイクロ遠心チューブに上清を収集し、マイナス80°Cで保存します。
水と遠心分離機を2,300倍Gで3分間洗浄し、その後、限外濾過装置から水を捨てます。上清を予め洗浄した10キロダルトンカットオフフィルターにピペットし、冷蔵遠心分離機で4°Cで回転します。サンプルの pH を確認します。
100%アセトニトリルの1ミリリットルでカラムを平衡化し、0.1%トリフルオロ酢酸で5%アセトニトリルの1ミリリットルで洗浄します。カラムにサンプルの完全な体積をロードし、0.1%トリフルオロ酢酸で5%アセトニトリルの1ミリリットルでカラムを洗浄します。0.15%トリフルオロ酢酸を有する1%アセトニトリルの1.8ミリリットルのカラムから、タンパク質の低結合マイクロ遠心チューブにペプチドを溶出する。
サンプルを真空遠心分離機で30°Cで完全に乾燥させ、ディスプレイ上の濃度時間を監視します。サンプルをマイナス80°Cで保存します。ペプチドサンプルを100~200マイクロリットルの超精製水とピペット2.5マイクロリットルの標準ペプチド濃度とサンプルを白色96ウェルプレートに再懸濁します。
0.2モルリン酸緩衝液25マイクロリットル、蛍光アミン12.5マイクロリットルを加えます。軌道回転器で1分間、穏やかに均質化します。次に、110マイクロリットルの水を加えた後、反応を止めます。
分光フルオロメーターの設定を調整し、プレートを読みます。1/10体積の1/10分の1のモルトリメチルアンモニウム臭化物を各ペプチドサンプルに25マイクログラムまで添加します。必要に応じて、pHが5~8個であることを確認し、塩酸または水酸化ナトリウムで調整します。
非重水素、重水素、または炭素13重水素の4マイクロリットルを加える。渦をかいて5秒間混ぜます。4マイクロリットルのシアンボロヒドリドナトリウムまたは重水素化ナトリウムをペプチドサンプルに加えます。
その後、渦をかいて5秒間サンプルを混ぜます。ペプチドサンプルをヒュームフードに室温で2時間インキュベートし、30分ごとに渦を出します。非重水素、重水素、または炭素-13の加加を繰り返し、ホルムアルデヒドおよびシアノ水素化ナトリウムまたはシアノ水素化ナトリウム、または各添加後にボルテックスする。
室温で一晩ヒュームフードにサンプルをインキュベートします。16マイクロリットルの重炭酸アンモニウムを加え、渦を混ぜて混ぜます。サンプルを氷の上に置きます。
さらに5秒間、5%のギ酸と渦の8マイクロリットルを加えます。ペプチドサンプルを組み合わせ、2つと4の間でpHを調整し、次に前述のようにアセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸を使用して逆相クリーンアップカラム上の結合サンプルを脱塩する。サンプルを真空遠心分離機で30°Cで完全に乾燥させ、マイナス20度で保管します。
標識されたペプチドは、質量スペクトルを用いて観察される。赤い矢印は、2つの異なるサンプルS1とS2の比較のために、L1およびL5の2つの同位体形態で標識された異なるペプチドのピーク対の存在を示す。3つの異なるサンプルに存在するペプチドの質量スペクトルを、それぞれL1、L3、およびL5タグで標識したS1、S2、およびS3が示されている。
4重化標識が行われました。対照試料S1及びS3をそれぞれL1及びL3で標識し、2つの実験サンプルと比較して、L2で標識したS2及びS4と、有意差 L4.No 有意な差が認められた。同位体標識は、所与のプロテアーゼまたはペプチダーゼに対するインビトロの製品の基質を示すために使用された。
神経リシン酵素の存在下で変化しないペプチドをここに示す。酵素の存在下で消失または減少するペプチドは基質であり、増加するものは製品とみなされます。この図は、3つの異なる形式のタグでラベル付けされたデータベース検索エンジンによって実行されるペプチド配列を同定する例である。
定義する前に、固い酸性化によって引き起こされるペプチド結合を壊さないように、サンプルが完全に冷却されていることを確認してください。また、限外ろ過装置の洗浄も不可欠です。質量分析法は、ペプチド質の基質を同定することにより、異なる実験条件間でペプチドを定量化し、分析研究に優れた方法です。
