クライオ電子顕微鏡用高温サンプルグリッドの作製

タンパク質の機能は温度に依存し、温度に最適です。このプロトコルは、より高い温度でタンパク質構造を解決する方法を提供します。このアプローチは、機能的に関連する構造を提供し、タンパク質構造の温度依存性の理解を深めることができます。

手順のデモンストレーションは、中央研究院クライオEM施設のマネージャーであるYuan-Chih Changです。閉じた端にある50ミリメートルの遠沈管に1センチメートルの穴を開けることから始めます。超音波水出口のガラス化保存装置チャンバーにチューブを置きます。

ガラス化保存装置の温度を規定温度に設定し、ガラス化槽を摂氏55度、相対湿度100%にします。実験を開始する前に、条件を安定させるために少なくとも30分間放置します。ウォーターバスをホットプレートに置き、ホットプレートを希望の温度に設定します。

温度計で水が摂氏55度に達することを確認します。サンプルをウォーターバスでインキュベートし、ブロッティング実験の前にホットプレートの端にあるピペットチップを2分以上予熱します。グローは、穴のあるカーボン支持グリッドを25ミリアンペアで30秒間放電します。

吸い取り実験の5分前までにガラス化ろ紙をガラス化装置チャンバーに入れます。ピンセットをガラス化装置のグリッドで2分以上インキュベートします。標準的な手順に従ってエタンでエタン容器を構築し、エタンがオーバーフローしないようにします。

ピペットを使用して、7〜9マイクロリットルのサンプルをグリッドに適用します。次に、1〜2秒待ち、1〜1秒半ブロットして、サンプルを液体エタンにすばやく浸します。グリッドを液体エタンから液体窒素に保存されたクライオボックスに移します。

グリッドをクリップしてアンロードし、電子顕微鏡またはクライオEM装置を取得します。クライオEM装置の表示画面とソフトウェアの低線量機能を使用して、グリッド上の氷の状態とグリッド上のサンプルの分布をスクリーニングします。得られたグリッドの品質が良くない場合は、待機時間、ブロッティング時間などのさまざまな条件でグリッド準備のプロセスを繰り返します。

結果のグリッドの品質が良好な場合は、同じ手順を繰り返して、異なる温度でグリッドを作成します。高品質のグリッドを高解像度のクライオEM装置に転送します。確立された手順に従ってデータ収集とデータ分析を実行します。

成功したグリッドの場合、グリッドの左上に厚い氷、右下に薄い氷で氷の勾配が形成されました。データ収集に適した青と緑のボックスが成功したグリッドで観察されました。もう一方のグリッドでは明るいコントラストが観察されました。

氷の薄い層または氷の欠如を示します。2番目のグリッドでのデータ収集に適しているのは2つの正方形のみであることがわかりました。グリッドの1つは、主にクリスタリン型の氷で構成されており、データ収集には適していませんでした。

一方、もう一方のグリッドは、氷層がほとんどデータ収集に適したアモルファス状態にあることを示しました。ASコンテナなどの準備は、時点に応じて完了する必要があります。時間管理と実験を迅速かつ正確に終了することが最も重要です。

このプロトコルを使用して得られた結果によっては、研究者は単純な条件を設定する際により注意しなければならない場合があります。