この自動化されたワークフローは、再現性とスループットに優れた一貫したタンパク質酵素消化を提供します。これにより、質量分析によるバイオマーカー発見、検証、臨床応用の精度と信頼性が向上します。この技術の利点は、大多数のタンパク質に対して20%未満のアッセイおよび相互アッセイCVを使用して、約5時間で96個のサンプルのワークフロー全体を完了できることです。
この正確な高スループットサンプル調製により、組織や生体液の疾患プロテオームを大規模に調査することができます。さらに、自動化されたプロテオームサンプル調製ワークフローは、高含量および定量プロテオミクス分析のための強固な基盤を提供します。この手順のデモンストレーションは、シダーシナイのハイスループットセンター所長の秦福博士と、私の研究室の研究員であるケイシー・ジョンソン氏です。
分析を開始する前に、プールされた健康なヒトプラズマの5マイクロリットルを96ラウンドの深いウェルプロピレンプレートに加えます。すべてのサンプルがロードされたら、液体ハンドラデバイスソフトウェアを開き、メソッドタブで、すべての軸を選択して、自動液体ハンドラを向けます。すべてのワークステーションのシリンジに可視の気泡が含まれていないことを確認し、新しい方法を開き、[実行]をクリックしてメソッドを開始します。
オートサンプラーのプロンプトに使用する値を入力して、メソッドの最後にオートサンプラープレートを準備し、[OK]をクリックします。最初の列に使用する値を入力し、[OK]をクリックします。最後の列プロンプトに使用する値を入力して、「OK」をクリックします。サンプルプレートを少なくとも 20 マイクロリットルのサンプルボリュームで使用する場合は、サンプルプレートに使用する値を入力するプロンプトに true と入力し、「OK」をクリックします。ガイド付き Labware セットアップ ウィンドウの指示に従い、[続行] をクリックします。適切な試薬を適切なウェルにロードし、[次へ]をクリックします。試薬、反応、サンプル、オートサンプラープレート、6ウェル90マイクロリットルチップボックス、空の90マイクロリットルチップボックス、フル230マイクロリットルチップボックスを含む図示に示すように、再び[Next]をクリックして、自動化された液体ハンドラデッキをレイアウトします。
次に、[完了] をクリックしてメソッドを開始します。遠心分離後の継続時に、反応板を取り出し、遠心分離機に入れる。遠心分離の最後に、自動液体ハンドラ内の位置に反応プレートを戻し、[続行]をクリックします。
液体クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析では、C18 2.1 x 100ミリメートル3.5マイクロメートルカラムのペプチドを、毎分250マイクロリットルの流量を有する高圧液体クロマトグラフィーで、3倍極数質量分析計で一列に解析します。ローディングの5分後、5%バッファーB溶液でカラムを平衡化し、30分間にわたってリニアな5〜35%の緩衝剤Bでペプチドを溶出させる。溶出の終わりに、98%のバッファーBでカラムを10分間洗い、次のサンプルをロードする前に5%バッファBで5分間洗浄します。
オンライン転用の場合、2相切替弁を使用して、後列溶離液をイオン源に入る前に無駄にします。すべてのサンプルが溶出すると、複数の反応モニタリングデータを処理できます。この代表的な分析では、3つのβ-galペプチドおよび2つのアルブミンペプチドを、スパイクされたβ-galおよび処理された血漿アルブミンタンパク質から監視した。
自動サンプル調製ワークフローの精度は、選択した全プロテオミクス反応モニタリングワークフローの分散係数から、液体クロマトグラフィータンデム質量分析の分散係数の割合を差し引いた値として計算した。予想通り、ヒト血清アルブミンおよびβ-galタンパク質の両方に対して良好なシグナル強度が観察された。液体転写ステップの精度を監視するために、独立した試薬の移送ステップで内因性ヒト血清アルブミンおよび外因性β-galタンパク質に対して安定同位体標識ペプチド標準をスパイクすることができる。
自動化されたプロテオームサンプル調製ワークフローを検証するために、同じ日に調製された21のウェルから、1日中の分散係数値を計算した。40個のタンパク質の平均日中分散係数は4~20%の範囲で、プレートベースの自動化ワークフローのエッジ効果を評価するために、分散係数パーセントは、指定された列および行内の特定のウェルから計算することができます。この代表的な実験では、複数の反応監視信号強度は、3-22%の範囲の分散係数パーセントを持つ列と行のすべての構成で類似していた最も重要なステップは、所望の96ウェルプレートマップに従ってサンプルを正しく追加し、ソフトウェアの指示に従って試薬プレートを正しく設定することです。
この自動化されたプロテオームサンプル調製法により、研究者は信頼性の高い定量的プロテオミクスデータを大規模に収集することができます。
