פרוטוקול זה הוא משמעותי מכיוון שעבודה מוצלחת עם organoids טמונה בפרטים, ולתחום חסרים פרוטוקולים מפורטים ברורים שאחרים יכולים לבנות מהם. היתרון הגדול ביותר של טכניקה זו הוא ציר הזמן, דרישות הביומסה הנמוכות והמדרגיות בעלות נמוכה. בעוד הרבה יותר עבודה נדרשת, טכניקה זו יכולה לעזור לשפר את הטיפול בסרטן ריאות על ידי מתן אפשרות לבדיקה של טיפולים אישיים או משולבים מדויקים יותר שניתן לתרגם קלינית.
האתגר הגדול ביותר הוא עם טיפול BME2, הידוע בכינויו מטריגל. אני ממליץ בחום לתרגל צנרת וטיפול BME2 נוזלי לפני הצגת organoids היקר שלך. התחל על ידי ניתוק תרבות האורגנויד BME2 שקועה על ידי שאיפה קפדנית של התקשורת מלוחות התרבות הימנעות מלגעת בתרבות.
טריפסינים את תרבית האורגנויד BME2 השקועה עם אנזים רקומביננטי מתאים על ידי הוספת שני מיליליטרים של אנזים רקומביננטי לבאר בצלחת שש בארות. באופן מכני לשבור את BME2 על ידי צנרת שוב ושוב למעלה ולמטה ודגור לוחות ב 37 מעלות צלזיוס בחממה תרבית התא במשך חמש דקות. בסוף הדגירה, להעביר את ההשעיה לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 600 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לשאוף את האנזים רקומביננטי supernatant בזהירות מבלי לגעת גלולה organoid ו resuspend גלולה organoid במדיום הצמיחה. לאחר הוספת DNase 1, לדגור על ההשעיה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר וצנטריפוגה ב 600 פעמים G במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. להשליך את התקשורת בזהירות מבלי לגעת גלולה organoid ו resuspend את הכדור במדיום צמיחה טרי.
מחממים מראש צלחת שחורה חדשה וברורה 96 היטב ב 37 מעלות צלזיוס בחממה תרבית התא במשך 10 דקות, ולאחר מכן להכין השעיית תא PBS לספור את התאים באמצעות מנתח תאים. לאחר חישוב נפח ההשעיה של התא הנדרש לניסוי, יש לצטט את התאים מהשעיה של תא יחיד ולגלגל כלפי מטה על ידי צנטריפוגה כפי שהוכח בעבר. לאחר שהמדיה נמחקת, שמור את התאים על הקרח למשך כדקה אחת לפני השימוש החוזר ב- BME2.
הטה את לוחית התחתית השחורה השקוףה 96 היטב לכיוון הגוף וזרע חמישה מיקרוליטרים של השעיית תאים לבאר, ולאחר מכן זריעת כיפות התאים במיקום השעה שש של הבאר. מלאו את הבארות החיצוניות בשולי צלחת הבאר 96 עם PBS וזרעו את כיפות התאים בבארות הפנימיות הנותרות. דגירה כיפות תא זרע טרי בקפוצ'ון זרימה למינארי תרבית התא במשך חמש דקות מבלי להזיז את הצלחת, ולאחר מכן להעביר את הצלחת לחממה תרבית התא לדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
הוסף בזהירות 100 מיקרוליטרים של מדיום צמיחה לבאר לכל בארות המכילות אורגנוידים ו -100 מיקרוליטרים של PBS לבארות החיצוניות בשולי הצלחת. תרבות האורגנוידים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שבעה ימים, שינוי מדיה לפי ההוראות המוזכרות בכתב היד הטקסט, בדיקת הצמיחה של organoids תחת מיקרוסקופ האור באופן קבוע. הכן דילול תרופה סדרתית במדיה גורם גדילה נמוכה עבור osimertinib לטיפול EGFR מוטציה nonsmall תאים סרטן ריאות organoids.
כלול שליטה שלילית על-ידי הוספת מדיה של גורם צמיחה נמוך ו- 0.1%DMSO. סובב את לוח האורגנויד בכיוון השעון ב-180 מעלות, כך שהאורגנואידים נמצאים כעת במיקום של השעה 12 ושואפים בזהירות את מדיית הצמיחה באמצעות מנגנון רב-ערוצי רצוי. הוסף 100 מיקרוליטרים של שליטה או פתרון תרופתי לבאר.
הדגירה טיפלה באורגנוידים שוב ב-37 מעלות צלזיוס בחממה של תרבית התא במשך חמישה ימים. התחל לבצע את בדיקת ההישרדות על ידי הפשרת ריאגנט בן לילה בארבע מעלות צלזיוס. שיווי משקל הריאגנט באמבט מים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות לפני השימוש ומערבבים על ידי היפוך.
מוסיפים 100 מיקרוליטרים של הריאגנט לכל באר ומערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה עם קצה פיפטה להציב במיקום של כיפת organoid. דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בחושך. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להעביר כ 150 microliters של lysate לצלחת 96 תחתון לבן חדש 96 היטב ולאחר מכן לדגור על הצלחת במשך 25 דקות נוספות בטמפרטורת החדר בחושך.
הקלט אור באמצעות קורא לוחות ELISA. שמור נתונים בתבנית טבלת נתונים מתאימה המכילה את כל הקריאות וההקלטות הגולמיות של פריסת הלוח והתרופות המשמשות. האורגנוידים החיוביים TH107 מוטציה EGFR הראו רגישות לטיפול osimertinib עם ריכוז מעכבות מקסימלי למחצה של 56 ננומולר ואילו EGFR-מוטציה חיובית TH116 organoids היו עמידים לטיפול osimertinib עם ריכוז מעכבות מקסימלי למחצה של גדול ממיקרומולר אחד.
הרגישות של תאי סרטן ריאות מסוג TH107 שאינם תאי EGFR חיוביים ל-TH107 לוותה בשינויים משמעותיים בתעתיק, כולל ירידה בביטוי חתימות הגנים הקשורות למחזור התאים ועלייה בביטוי חתימת הגנים הקשורה לאפופטוזיס. התגובה של TH330 חיובי EGFR-מוטציה רגישה למעכבים ממוקדים מושפעת באופן משמעותי בתקשורת הצמיחה לעומת מדיה גורם צמיחה נמוכה. טיפולים קומבינטוריים ב-TH330 חיובי EGFR-מוטציה הביא לתגובה טיפולית מוגברת.
גישה זו משפרת אסטרטגיות מותאמות אישית לטיפול מולקולרי או משטרי טיפול קומבינטוריים. זה האחרון מסייע למקד סובלנות סמים ומנגנוני התנגדות מוקדם כדי להעמיק את התגובה הקלינית ולשפר את תוצאות המטופל.
