חקר תגובת הנזק לדנ"א הכרחי להבנת הפתופיזיולוגיה של סמנים ביולוגיים פוטנציאליים לסרטן השחלות בטיפול ממוקד חדש. טכניקה זו מאפשרת לדגימה להישאר שלמה ומאפשרת בדיקה של אנטיגנים במיקום הפעולה שלהם. פרוטוקול זה הוא מהיר וניתן להתאים אותו לכל אנטיגן מקובל immunofluorescence.
שיטה זו נותנת תובנה לגבי סרטן השחלות ותהליכי תיקון נזקי DNA המעורבים בעמידות לכימותרפיה ומעכבי PARP. שיטות אלה יכולות להיות מיושמות בתחומי מחקר אחרים הכוללים שימוש בתרבויות תלת ממדיות ואורגנואידים. כדי להתחיל, שאפו את המדיה מהאורגנואידים המוקרנים והמוגרים מבלי להפריע למטריצה התלת-ממדית.
לאחר מכן לשטוף עם 300 מיקרוליטר של PBS. תקן את האורגנואידים ב 300 מיקרוליטר של 2% paraformaldehyde במשך 10 דקות. לאחר התיקון, שטפו את האורגנואידים עם 300 מיקרוליטר של חיץ מכתים והניחו אותם על שייקר למשך חמש דקות.
לאחר מכן לחדור את האורגנואיד על ידי הוספה עדינה של 300 מיקרוליטר של מאגר חדירה. לאחר 20 דקות של דגירה, להסיר את החיץ ולשטוף עם 300 מיקרוליטר של חיץ צביעה. הניחו את האורגנואידים על שייקר למשך חמש דקות.
לאחר מכן, הוסף 300 מיקרוליטר של חיץ צביעה כדי לחסום את שלב החדירה. מניחים על השייקר למשך 30 דקות ושאפו את חיץ הכתמים בעזרת פיפטה. לאחר מכן להוסיף 300 מיקרוליטר של נוגדנים ראשוניים מדוללים בחיץ צביעה.
דוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. לאחר הדגירה, הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית. בצעו שלוש שטיפות עם 300 מיקרוליטר של חיץ כתמים במשך חמש דקות כל אחת על השייקר.
מוסיפים 300 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית מדוללת בחיץ צביעה, ודגרים במשך שעה בחושך. לאחר שעה, לשאוף את פתרון נוגדנים משני ולהוסיף 300 מיקרוליטר של DAPI מדולל. מניחים על השייקר למשך חמש דקות.
בצעו שלוש שטיפות עם 300 מיקרוליטר של חיץ כתמים במשך חמש דקות כל אחת על השייקר. הסר את חיץ הצביעה ונתק את התאים באמצעות ערכת ההסרה המצורפת לשקופיות התא. חתכו את קצה קצה פיפטה P200 והשתמשו בו כדי להוסיף אמצעי הרכבה שיכסה כל באר המכילה לשונית אורגנואידים.
הניחו את החלקת הכיסוי מעל הדגימה תוך הימנעות מבועות. יש לקחת לק שקוף ולצבוע אותו על צידי זכוכית הכיסוי כדי לאטום את המגלשה. תן לו להתקשות במשך שעה ולאחר מכן מניחים אותו על 20 מעלות צלזיוס.
קבל תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות מטרה 63X עם שמן טבילה. באמצעות פרוטוקול זה, אורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופלות הוכתמו עבור חלבונים לתיקון נזקי DNA לפני ואחרי הקרנה, והוערכו עבור סמנים ביולוגיים כגון גמא H2AX, סמן של נזק לדנ"א, ו- RAD51, סמן לתיקון רקומבינציה הומולוגית. RPA, סמן של לחץ שכפול, 53BP1, סמן של חיבור לא הומולוגי, וג'מינין, סמן מחזור תא פאזה GS2 הוערכו גם הם באמצעות טכניקה זו.
כרטיסיות BME נוטות לדה-פולימריזציה, ולכן תשומת לב רבה לאחר תיקון ושאיפה היא חיונית. ניתוח האנטיגנים כדי לקבוע את נזקי האורגנואידים ואת היכולת להרכיב תגובת נזק לדנ"א יכול לסייע בהערכת עמידות כימותרפית.
