אורגנואידים אנושיים שמקורם בחולה הם מערכות מודל תלת ממדיות במבחנה המייצגות הן את מגוון המטופלים והן את ההטרוגניות התאית של הגידולים. פרוטוקול זה והדגמת וידאו מספקים מדריך מפורט ומעשי לקביעת גידול שד שמקורו במטופלת ואורגנואידים נורמליים. אורגנואידים של גידולי שד שמקורם במטופל הם מודלים חדשים ומלהיבים, אך קשה להקים.
הפרוטוקול המקיף שאנו מספקים כאן אמור לסייע בהכנת החוקרים המנסים לפתח אורגנואידי שד ולהכיר להם את האתגרים הצפויים. כל קו PDO הנגזר ממטופל אחר הוא ייחודי במורפולוגיה ובקצב הגדילה. שלא כמו שתי מערכות קו תאים דו-ממדיות, אורגנואידים גדלים טוב יותר כאשר הם מצופים בצפיפות גבוהה, מה שמאפשר אינטראקציות בין-תאיות טובות יותר.
מי שתדגים את ההליך תהיה דישה אגרוואל, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי. כדי להתחיל, להפשיר בקבוק של מטריצת קרום מרתף על קרח או לילה בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את הרקמה המנותחת לצלחת פטרי סטרילית בקוטר 10 ס"מ.
בדוק את הרקמה באופן מקרוסקופי ורשום אם היא נראית שומנית מורפולוגית, כלי דם או נמק. בנוסף, רשום את הגודל והצורה של הרקמה וצלם תמונה של הרקמה עם סרגל מוצג. טוחנים את הרקמה לחתיכות קטנות עם אזמל מספר סטרילי 10 ומעבירים אותו לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.
מוסיפים 10 מיליליטר של שני מיליגרם לכל תמיסת collagenase IV מיליליטר ואטמו את הצינור. הניחו את הצינור על שייקר מסלול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-140 סל"ד למשך 30 עד 90 דקות בזווית של 30 מעלות. במהלך הדגירה, מניחים aliquot של מדיום מלא מראש חם ב 37 מעלות צלזיוס בחרוז או אמבט מים.
כל 15 דקות, להשהות מחדש את הרקמה על ידי ערבוב למעלה ולמטה במרץ באמצעות פיפטה סרולוגית חמישה מיליליטר, סטרילית, מצופה מראש. ניטור דיסוציאציה לאורך זמן על ידי התבוננות בצינור מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של פי 5 ומעלה. ברגע שהרקמה מנותקת, צנטריפוגה ב-400 גרם למשך חמש דקות, שאפו את הסופר-נטנט, והוסיפו 10 מיליליטר של AdDF+Again, צנטריפוגה ושאפו בזהירות את הסופר-נטנט, שכן כדורי הרקמה יכולים להשתחרר מדי פעם.
אם כדורית הרקמה אדומה חלקית, יש להוסיף שני מיליליטר של חיץ ליזה של תאי דם אדומים ולדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, הוסיפו 10 מיליליטר של AdDF+ לצינור, צנטריפוגה ב-400 גרם למשך חמש דקות, והשליכו את הסופרנטנט. השהה מחדש את הגלולה ב 50 עד 300 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף קר לא מדולל ומעורבב על ידי pipetting בזהירות כדי למנוע היווצרות בועות.
באמצעות צלחת תרבית רקמה בת שש בארות שמחוממת מראש באינקובטור למשך הלילה, צלחת 300 מיקרוליטר של כיפת מטריצת קרום מרתף המכילה אורגנואידים בכל באר. השאירו את הצלחת ללא הפרעה במכסה המנוע למשך חמש דקות לפני שתניחו אותה על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות כדי שכיפת המטריקס של קרום המרתף תתמצק במלואה. בתום הדגירה מוסיפים לכל באר שלושה מיליליטר של מדיום שלם שחומם מראש ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.
לאחר הדגירה, צלם תמונות של האורגנואידים באמצעות מטרה 5X במיקרוסקופ שדה בהיר הפוך. הרימו את כיפת מטריצת קרום המרתף לתוך המדיום שבבאר באמצעות מגרד תאים או קצה פיפטה של מיליליטר. בעזרת קצה פיפטה מצופה מראש, מעבירים את הכיפה הצפה של האורגנואידים עם מדיום לצינור חרוטי של 15 או 50 מיליליטר, בהתאם למספר הבארות הנקצרות.
לאחר מכן הוסף DPBS כדי להגדיל את עוצמת הקול לחמישה מיליליטר לפחות. סובב את הצינורות ב 400 G במשך חמש דקות. מטריצת קרום המרתף עם אורגנואידים יוצרת שכבה בתחתית.
לאחר שאיפת הסופרנטנט, הוסף 5 עד 20 מיליליטר של DPBS, בהתאם למספר הבארות המאוגדות בצינור. ערבבו את גלולת מטריצת קרום מרתף האורגנואיד ב- DBPS באמצעות פיפטה חד פעמית סטרילית מצופה מראש. שוב, צנטריפוגה ולהשליך את הסופרנטנט.
בעזרת קצה פיפטה מצופה, מוסיפים מגיב דיסוציאציה של תאים בנפח גדול פי שלושה ממטריצת קרום המרתף ומשהים מחדש את האורגנואידים. הניחו את הצינור על שייקר מסלול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-140 סל"ד למשך 8 עד 15 דקות במצב זוויתי. עקוב אחר הצינור על ידי התבוננות בו תחת המיקרוסקופ כל חמש דקות כדי להבטיח שהאורגנואידים נשברים לצבירים קטנים יותר.
הוסף AdDF+בנפח השווה או גדול מהמגיב הדיסוציאציה של התא והפיפטה כדי לערבב את האורגנואידים. סובב ב 400 גרם במשך חמש דקות כדי לקבל גלולת אורגנואידים. לאחר קבלת גלולת אורגנואיד לבנה ללא מטריצת קרום מרתף בלתי מומסת, יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של AdDF+לפצות את הנפח ל-10 מיליליטר עם AdDF+לסובב את הצינור לשלב השטיפה ולהשליך את הסופרנטנט.
הוסף את הכמות הנדרשת של מטריצת קרום מרתף לאורגנואידים המעוכלים בהתבסס על יחס הפיצול המתאים. מערבבים בעדינות למעלה ולמטה כדי למנוע יצירת בועות ומניחים מיד על קרח. צלחת 300 מיקרוליטר כיפות של אורגנואידים תלויים מחדש במטריצת קרום מרתף בצלחת שש בארות שחוממה מראש.
השאירו את הצלחת ללא הפרעה במכסה המנוע למשך חמש דקות לפני שתניחו אותה על 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 20 עד 30 דקות כדי שהכיפות יתמצקו. בסוף הדגירה, ושלושה מיליליטר של תווך שלם שחומם מראש לכל באר ומניחים את הצלחת בחזרה באינקובטור. הוסיפו מדיום מלא טרי כל חמישה עד שבעה ימים.
קווי האורגנואידים השונים של גידולי השד שמקורם במטופל נבדלים במורפולוגיה ובקצב הגדילה. אורגנואידי השד הרגילים ומעט הקרצינומות הductal המוקדמות באורגנואידים שמקורם ב- C2 דמו למבנה השד הרגיל, עם לומן מרכזי מוקף בתאים דוקטליים. אורגנואידים שמקורם בקרצינומה לובולרית פולשנית נוטים ליצור מבנים דמויי חבורת ענבים המחוברים באופן רופף.
בינתיים, אורגנואידים שמקורם בקרצינומה פולשנית נוטים ליצור אורגנואידים צפופים, גדולים ועגולים. גדילת האורגנואידים נמדדה באמצעות בדיקת כדאיות תאים זוהרים בימים שלוש, שש, תשע ו-12, עם קריאה בסיסית ביום הראשון לאחר הציפוי. תמונות השדה הבהיר של אותם אורגנואידים שהתרחבו עם הזמן מוצגות כאן.
לחלק מקווי האורגנואידים שמקורם במטופל יש זמן הכפלה של יומיים, בעוד שלחלק לוקח חמישה ימים. חשוב להיות סבלניים עם קווי אורגנואידים מסוימים כי הם איטיים להקים. מניסיוננו, הגדלת צפיפות הציפוי או סינון הפסולת החוצה מקדמים את הצמיחה של PDOs.
אורגנואידים שמקורם בחולה, או PDOs, הם מודלים מצוינים לבדיקת תרופות. הם מדגימים אינטראקציות של מטריקס תא-תא וחוץ-תאי שהן המפתח לחקר הפתופיזיולוגיה של הסרטן. בנוסף, PDOs יכולים לעבור מניפולציה גנטית וניתן להשתמש בהם כדי לפתח xenografts במערכות תרבות משותפת, מה שהופך אותם מודלים נהדרים למחקרים מכניסטיים.
