יצירה וטיפוח של אורגנואידים שמקורם בסרטן השחלות הסרוסי ברמה גבוהה

מודלים אורגנואידים מניעים של מטופלים מייצגים גנטית ותפקודית את גידולי האב שלהם ולכן הם מודלים אמינים לחקר טיפולים חדשניים ותהליכים ביולוגיים מורכבים בסרטן השחלות. על ידי שחזור הטרוגניות שבטית (clonal heterogeneity), המיקרו-סביבה של הגידול ואינטראקציות בין תאים במבחנה לתאים, מודלים אלה מתגברים על המגבלות של קווי תאים סרטניים ושל קסנוגרפטים שמקורם במטופלים. אורגנואידים שמקורם במטופל מציעים יכולות הרחבה ואחסון ארוכות טווח ומחקים את הפיזיולוגיה של הגידול.

כתוצאה מכך, הם מודלים אידיאליים לחקר טיפולים חדשניים וסמנים ביולוגיים מנבאים. התחל לקצור את האורגנואידים על ידי הנחת דגימות הגידול בצלחת תרבית רקמה של 10 ס"מ וטחינת הרקמה ליצירת תערובת הומוגנית באמצעות אזמל חד פעמי. מניחים את תערובת הרקמה ההומוגנית לתוך צינור דיסוציאציה באמצעות מלקחיים.

עבור כל מיליליטר עד שני מיליליטר של רקמה הומוגנית, הוסף שבעה עד שמונה מיליליטר של מיליגרם אחד למיליליטר מסוג שני תמיסת קולגנאז בתווך בסיס אורגנואיד ומיליליטר אחד של תמיסת DNase One. מערבלים את התמיסה ב 458 G.Liquefy הרקמה בזמן שהיא בתמיסת collagenase באמצעות מכונת דיסוציאציה. הפעל את התוכנית 37 C קו תחתון H קו תחתון TDK שלוש שעה אחת עד שהוא השעיה תא יחיד.

לאחר שתסיים, העבר את התערובת ההומוגנית לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר. הוסף 20 עד 40 מיליליטר של תווך בסיס אורגנואיד ומערבל את התמיסה ב 458 G.לאחר מכן סנן את התמיסה דרך מסננת תאים 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר שכותרתו לאחרונה. לאחר מכן, צנטריפוגו את התערובת המסוננת ב 1, 650 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ושאפו את supernatant באמצעות פיפטה מרעה זכוכית.

הכינו 100 מיקרוגרם למיליליטר Dnase One והשהו מחדש את התאים במיליליטר אחד של תמיסת Dnase One על ידי הוספת תמיסת DNase One חכמה טיפה. לאחר 15 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר להוסיף 25 מיליליטר של תווך בסיס אורגנואיד לתאים ולהפוך כדי לערבב. לאחר מכן צנטריפוגו את התאים ב 1, 650 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס בזהירות לשאוף את supernatant באמצעות פיפטה מרעה זכוכית.

השהה מחדש את גלולת התא החדשה שנוצרה בחמישה מיליליטר של תאי דם אדומים שחוממו מראש או חיץ ליזיס RBC. מערבבים את התמיסות בכל צינור חרוטי ב 458 G ודגרים במשך חמש דקות. שוב, צנטריפוגו את הגלולה התלויה בחיץ הליזיס RBC ושאפו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטת מרעה זכוכית.

לשטוף את הגלולה עם PBS 10 מיליליטר ולסובב את התאים לפני צנטריפוגה של התאים. עבור כדורית תא גדול, שאפו את PBS והוסיפו מיליליטר אחד של תווך בסיס האורגנואיד על גבי הכדורית. לאחר ערבול התמיסה, מעבירים 300 עד 400 מיקרוליטר של תרחיף התא לצינור מיקרוצנטריפוגה.

לאחר חמש דקות של צנטריפוגה, שאפו את הסופרנאטנט והשעו אותו מחדש בתמצית קרום מרתף, או BME, ומדיום בסיס אורגנואידי באמצעות קצוות קרים. צלחת את תמיסת התא resuspended לתוך צלחת שש בארות ב 40 microliter aliquots. צלחת עד חמישה aliquots לכל באר.

מניחים מיד את צלחת הבאר באינקובטור למשך 20 דקות, ולאחר הדגירה, מוסיפים בעדינות שני מיליליטר של מדיום אורגנואיד שלם לכל באר. הוסף מיליליטר אחד של מדיום בסיס אורגנואיד לכל באר ופיפט את המדיה למעלה ולמטה ישירות על לשוניות האורגנואידים לדיסוציאציה. לאסוף את כל המדיום המכיל את כדורי resuspended בצינור חרוטי 15 מיליליטר.

לאחר מכן, צנטריפוגו את הצינור החרוטי 15 מיליליטר המכיל את התערובת במשך חמש דקות לפני שואפים את הסופרנטנט. הוסף מיליליטר אחד של אנזים רקומביננטי חופשי מן החי לכדורית התא. מערבבים על ידי מערבולות ומעבירים את המתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.

לאחר 15 דקות של דגירה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס וחמש דקות של צנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט. השהה מחדש את הגלולה בתווך בסיס BME ואורגנואיד וצלחת את תמיסת התא המרחף מחדש לתוך צלחת שש בארות ב 40 מיקרוליטר aliquots. צלחת עד חמישה aliquots לכל באר.

לאחר 20 דקות של דגירה, להוסיף בעדינות שני מיליליטר של מדיום אורגנואיד שלם לתוך כל באר. השהה מחדש את כדורי תא אורגנואיד המעבר ב 0.5 עד מיליליטר אחד של תרבית תאי התאוששות הקפאה בינונית ולהעביר מיליליטר אחד לכל בקבוקון קריו לפני העברתם למינוס 80 מעלות ומיכל חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. הפשירו את האורגנואידים על ידי העברת בקבוקוני הקריו המאוחסנים בחנקן נוזלי לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר ההפשרה, מעבירים את האורגנואידים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר וצנטריפוגות אותם לפני שאיפת הסופרנטנט. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של PBS לגלולה ולהעביר את הגלולה resuspended לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר לאחר צנטריפוגה ב 1, 650 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, בזהירות לשאוף את supernatant באמצעות פיפטה מרעה זכוכית. השהה מחדש את הגלולה בתווך בסיס BME ואורגנואיד וצלחת את התאים המרחפים מחדש על צלחת שש בארות ב 40 מיקרוליטר aliquots.

מניחים עד חמישה aliquots לכל באר. מניחים מיד את הצלחת באינקובטור למשך 20 דקות לפני הוספת שני מיליליטר של מדיום אורגנואיד שלם לבארות. אורגנואידים הוקמו במשך 10 ימים ולאחר מכן הם הדגימו אורגנואידים בדידים בתרבית.

תרביות אורגנואידים שמקורן במטופלים הוערכו על ידי הטמעתם באגרוז והערכתם עם המטוקסילין וכתמי אאוזין. חשוב לשקול את האתגרים של עבודה עם BME. ההשעיה של גלולת התא וה-BME חייבת להיעשות על קרח ולהבטיח שלא ייווצרו בועות בתהליך.

טכניקה זו מאפשרת מחקר נוסף על השפעת הכימותרפיה על ייצור והתפתחות אורגנואידים בשל הבעיות בהן נתקלים חולים שעברו כימותרפיה ניאו-אדג'ובנטית.