Name: in situ visualization of axon growth and growth cone dynamics in acute ex vivo embryonic brain slice cultures
Uploaded: 2021-10-14T15:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures at JoVE.com

Ringraziamo Maria Eugenia Bernis per aver fotografato le procedure. Ringraziamo anche Emily Burnside, Emily Handley, Thorben Pietralla, Max Schelski e Sina Stern per aver letto e discusso il manoscritto. Siamo grati ai nostri eccezionali assistenti tecnici, Jessica Gonyer, Blanca Randel e Anh-Tuan Pham. Riconosciamo il prezioso supporto della struttura per microscopi ottici e della struttura per animali del DZNE. Questo lavoro è stato sostenuto da Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG), dalla International Foundation for Research in Paraplegia (IRP) e da Wings for Life (a F.B). F.B. è membro del cluster di eccellenza ImmunoSensation2, delle SFB 1089 e 1158, e ha ricevuto il Premio Roger De Spoelberch.

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(125), (2017).</li><li>de Anda, F. C., Meletis, K., Ge, X., Rei, D., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+motility+is+essential+for+initial+axon+formation+in+the+neocortex.">Centrosome motility is essential for initial axon formation in the neocortex.</a> Journal of Neuroscience. 30 (31), 10391-10406 (2010).</li><li>Sakakibara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+centrosome+translocation+and+microtubule+organization+in+neocortical+neurons+during+distinct+modes+of+polarization.">Dynamics of centrosome translocation and microtubule organization in neocortical neurons during distinct modes of polarization.</a> Cerebral Cortex. 24 (5), 1301-1310 (2014).</li><li>Schatzle, P., Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Come i coni di crescita percepiscono e reagiscono al loro ambiente circostante per coordinare l'estensione e la guida simultanea degli assoni è ancora oggetto di dibattito 3,18. Studi pionieristici su substrati 2D hanno fornito uno sguardo sui meccanismi molecolari fondamentali che generano le forze che guidano la dinamica del cono di crescita durante la formazione degli assoni, la crescita e la navigazione 2,10,11,12,19. Più recentemente, studi su matrici 3D hanno rivelato quanta influenza ha una terza dimensione nel comportamento del cono di crescita e di conseguenza nella crescita degli assoni 8,9. Tuttavia, gli intricati meccanismi che istruiscono la dinamica dei coni di crescita in vivo devono ancora essere esaminati a fondo.
La preparazione di colture di fette organotipiche da cervelli IUE o EUE è ampiamente utilizzata e ben documentata. È diventato uno standard aureo che consente agli scienziati di ottenere informazioni sullo sviluppo e sul comportamento dei neuroni nel tessuto cerebrale vivente20,21. In effetti, questa tecnica è stata utilizzata con successo in combinazione con varie tecniche di imaging ad alta risoluzione per visualizzare specifici processi molecolari ed eventi morfologici in situ. Tali studi includono, ma non sono limitati alla formazione di assoni e all'estensione19,22, alla migrazione neuronale corticale 19,22,23,24, alla dinamica del centrosoma 25,26, alla dinamica dei microtubuli27, nonché alla dinamica funzionale dei compartimenti pre e postsinaptici 28,29.
Questo protocollo affronta una lacuna nella neurobiologia sperimentale, visualizzando le dinamiche del cono di crescita dello sviluppo di neuroni corticali in situ, in colture di fette di cervello acute ex vivo e gli strumenti per analizzare i dati ottenuti.
Le colture acute di fette di cervello sono state utilizzate per stabilire questo protocollo perché (1) con una certa pratica, sono facili da generare; (2) presentare un sistema accessibile per studiare i coni di crescita incorporati in un ambiente quasi completamente fisiologico, ma abbastanza trasparente da consentire l'imaging di cellule vive ad alta risoluzione; (3) può essere espanso per il suo uso con una miriade di linee di topo transgeniche; (4) combinati con IUE o EUE, forniscono un potenziale virtualmente illimitato per fornire strumenti molecolari per valutare le prestazioni dei coni di crescita e degli assoni in vivo in regimi di perdita/guadagno di funzione, insieme a reporter fluorescenti e sonde citoscheletriche.
Questa metodologia è stata descritta nel contesto sia dell'EUE che dell'IUE. Sebbene sia ancora un metodo altamente affidabile, l'EUE ha determinato un aumento dell'incidenza di fette di cervello che mostrano una rete RG disorganizzata rispetto a quelle ottenute con IUE come metodo di consegna (Figura 4C). I disturbi nell'array RG influenzano fortemente la migrazione neuronale e il modello di allungamento degli assoni30,31. Questi sono parametri chiave che prevedono dove trovare gli assoni per l'analisi in un dato momento e il tipo di ambiente in cui stanno navigando. Le fette di cervello con una rete RG significativamente interrotta in genere hanno una stratificazione dei neuroni corticali compromessa. Questo, a sua volta, produce assoni con traiettorie caotiche. Pertanto, si raccomanda vivamente di controllare l'integrità strutturale della rete RG. È interessante notare che la scarsa integrità strutturale è correlata all'aumento dell'età del cervello embrionale. In effetti, tali effetti negli embrioni più giovani di E12,5-E13,5 non sono stati osservati in genere19.
Il presente protocollo è completo e semplice. Tuttavia, ci sono alcuni passaggi critici in cui è necessario prestare particolare attenzione e attenzione per ottenere risultati ottimali. Questi sono stati espressamente annotati nel protocollo e includono (1) la messa a punto della quantità di DNA utilizzata nell'elettroporazione per ottenere un'etichettatura sparsa; (2) evitare danni durante l'estrazione del cervello; (3) controllare la temperatura dell'agarosio durante l'involucro cerebrale; (4) risoluzione dei problemi della percentuale ideale di agarosio per cervelli di una data età; e (5) selezione di fluorofori, la cui esperienza segue. Durante l'ottimizzazione del protocollo, sono state testate le prestazioni di diversi fluorofori nell'imaging in situ a cellule vive. Per questo protocollo sono state scelte varianti monomeriche GFP e NeonGreen per la preparazione dei plasmidi LifeAct- e Lyn-tagged (Figura 5A,B). Inoltre, la variante RFP mScarlet è stata testata e trovata altamente adatta per questa configurazione (dati non mostrati). Sono stati testati anche tRFP multimerico (dimero) e ZsGreen (tetramero) (Figura 5C e Video supplementare 1, a destra). Questi fluorofori super-luminosi a rapida piegatura sono raccomandati quando il metodo richiede una rapida generazione di segnali fluorescenti dopo la consegna del DNA.
Una pratica comune nell'uso di colture di fette è quella di utilizzare fette di cervelli diversi per testare il controllo e le condizioni sperimentali. Ciò rappresenta una fonte intrinseca di variabilità indesiderata. Qui è stato utilizzato un sistema di espressione che consente la modifica indipendente dei neuroni vicini e l'espressione dei giornalisti per l'identificazione. Si noti che in questa dimostrazione (Figura 5C), non c'erano differenze tra i neuroni che esprimono uno dei fluorofori. Tuttavia, ad esempio, un tale mix di plasmidi combinato con una linea di topo transgenico che ospita un gene Cre-sensibile etichetterà con neuroni tRFP (Dre-sensitive) che sono rimasti come wild type. Al contrario, ZsGreen (anche Cre-sensibile) etichetterà i neuroni ricombinati. Quindi, i coni di crescita dei due diversi genotipi, e probabilmente anche i fenotipi, potrebbero essere studiati fianco a fianco contemporaneamente nella stessa fetta di cervello.
La localizzazione di assoni e coni di crescita per l'analisi è una considerazione importante. I neuroni corticali si polarizzano mentre migrano radialmente dalla zona ventricolare (VZ) verso la piastra corticale (CP). Durante questo processo, i neuroni formano un processo principale (un futuro dendrite) e un processo finale che diventerà l'assone, unendosi infine agli assoni pionieristici nella zona intermedia (IZ), stabilendo tratti assonali32. Pertanto, per catturare i coni di crescita assonali, l'imaging è stato fatto su fibre assonali nell'IZ, compresi gli assoni che escono dal CP e gli assoni generati precocemente già associati a fasci assonali; o eventualmente, in fibre che attraversano l'IZ e si estendono al di sotto di esso (Figura 7).
Questo protocollo rende possibile eseguire l'imaging a super-risoluzione dei neuroni all'interno di fette organotipiche. Storicamente, la diffusione della luce era un problema significativo affrontato durante l'imaging di campioni spessi. Negli ultimi due decenni, gli ampi progressi nelle tecnologie ottiche hanno reso possibile l'imaging di campioni spessi. Qui, un obiettivo a lunga distanza di lavoro è stato utilizzato per visualizzare meglio le strutture più piccole, come i coni di crescita. Inevitabilmente, questo protocollo non cattura eventi più dettagliati come il flusso di actina retrograda o la dinamica dei microtubuli. L'obiettivo a lunga distanza di lavoro, che richiede un'apertura numerica (NA) inferiore, conserva le informazioni da fette spesse. Tuttavia, è stato anche possibile adattare questo protocollo per utilizzarlo con obiettivi di distanza di lavoro più breve. Ciò ha richiesto un trasferimento regolare delle fette a un piatto con fondo di vetro per preservare l'integrità strutturale. Tuttavia, l'uso di questo metodo ha comportato una sopravvivenza più breve - ~ 15 ore - a causa della perdita di scambio di gas (dati non mostrati). A differenza delle colture 2D, i coni di crescita in 3D occupano un volume maggiore e richiedono una compensazione movimento-artefatto nell'asse z. Per aumentare la capacità di visualizzare eventi dettagliati, è necessario utilizzare la moderna tecnologia confocale. Pertanto, si consiglia di utilizzare un motore z-stack a scansione rapida, come lo z-Galvo disponibile su microscopi confocali ad alta sensibilità33.
Da notare, questo protocollo presenta tre limitazioni principali. In primo luogo, è spesso difficile controllare i livelli di espressione / numero di cellule che esprimono di un dato plasmide in vivo. Ciò introduce variabilità tra tutte le fette anche quando si mantiene la stessa concentrazione di plasmidi. Pertanto, la selezione degli elementi regolatori nei vettori di espressione utilizzati deve essere predeterminata con cura. In secondo luogo, l'imaging di eventi dettagliati utilizzando inserti a membrana non è attualmente fattibile. Questa seconda limitazione potrà essere superata con gli aggiornamenti metodologici proposti nel paragrafo precedente. Infine, i coni di crescita sono altamente fotosensibili e possono diventare rapidamente fotosbiancati. Pertanto, l'imaging frequente dei coni di crescita, per un minimo di 5 minuti utilizzando microscopi a scansione laser, può spesso far collassare i coni di crescita. A questo proposito, i nuovi progressi nei dispositivi generati dalla microscopia a foglio luminoso possono essere adattati per l'imaging a lungo termine delle fette di cervello34.
Protocolli di questo tipo sono concepiti per aprire nuove strade di ricerca, consentendo una migliore comprensione di ciò che serve a un cono di crescita per leggere e reagire verso un ambiente complesso in vivo e, cosa più importante, per svelare i meccanismi di questa sofisticata interazione.

I neuroni sono cellule altamente polarizzate che rappresentano l'unità computazionale di base nel sistema nervoso. Ricevono ed emettono informazioni che si basano sulla compartimentazione dei siti di input e output: dendriti e assoni, rispettivamente1. Durante lo sviluppo, gli assoni si estendono mentre navigano in un ambiente incredibilmente complesso per raggiungere la loro destinazione. La navigazione degli assoni è guidata dal cono di crescita, una struttura sensoriale situata sulla punta dell'assone in via di sviluppo. Il cono di crescita è responsabile della rilevazione dei segnali ambientali e della loro traduzione nella riorganizzazione spaziale dinamica del suo citoscheletro 2,3. Le reazioni morfo-meccaniche risultanti istruiscono il cono di crescita a estendersi o ritrarsi dal segnale scatenante, portando a specifiche manovre assonali.
L'attuale comprensione dell'estensione degli assoni e della dinamica dei coni di crescita deriva da studi che valutano la crescita degli assoni su substrati bidimensionali (2D) 2,4,5,6,7. Questi studi pionieristici hanno identificato una sofisticata interazione tra coni di crescita e substrati di crescita e hanno rivelato differenze sorprendenti dipendenti dalle caratteristiche del substrato come adesività e rigidità 8,9. Guidati da queste intuizioni, sono stati ipotizzati segnali ambientali extracellulari per dettare la crescita degli assoni, con il citoscheletro del cono di crescita che esegue questa crescita 2,10,11,12. In particolare, i neuroni possono estendere gli assoni in substrati non adesivi (ad esempio, poli-lisina, poli-ornitina)13. Inoltre, la rigidità del substrato può influenzare il tasso di crescita degli assoni indipendentemente dai complessi adesivi cellulari8. Quindi, lo studio della dinamica dei coni di crescita nei substrati 2D da solo non può modellare con precisione l'equilibrio delle forze che derivano dall'interazione dei coni di crescita assonali con ambienti tridimensionali (3D) fisiologicamente rilevanti, come quelli trovati in vivo.
Per superare i limiti dei saggi 2D, la crescita degli assoni e la dinamica dei coni di crescita sono state studiate in matrici 3D 8,9. Queste matrici pongono un contesto più fisiologico ma consentono di studiare i meccanismi intrinseci delle cellule della crescita degli assoni. Consente l'esame del cono di crescita in modo monocellulare in una varietà di condizioni e trattamenti farmacologici9. In tali ambienti 3D, gli assoni mostravano dinamiche citoscheletriche distinte e crescevano più velocemente di quelli osservati nei neuroni coltivati in 2D9. Questi eleganti studi hanno dimostrato l'influenza di una dimensione extra sulla riorganizzazione del citoscheletro del cono di crescita e, di conseguenza, sul suo comportamento.
Nonostante gli apparenti vantaggi presentati dalle matrici 3D rispetto alle superfici 2D nel supportare lo sviluppo neuronale nativo e la crescita degli assoni, rimangono un'impalcatura sintetica semplificata che non può riflettere la complessità delle dinamiche osservate nel tessuto del sistema nervoso centrale (SNC). Qui, la consegna di plasmidi reporter per elettroporazione ex utero e in utero è stata combinata con la coltura di fette organotipiche del cervello e l'imaging in situ dal vivo a super-risoluzione per analizzare le dinamiche del cono di crescita all'interno di un contesto fisiologico. Questa metodologia consente la visualizzazione degli assoni in via di sviluppo mentre si sperimenta la 3-dimensionalità degli ambienti in vivo e la complessità della sua composizione fisico-chimica. Infine, vengono descritte procedure user-friendly per misurare la crescita degli assoni e le dinamiche dei coni di crescita utilizzando software comunemente concesso in licenza e disponibile pubblicamente.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Goat Anti-Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21236</td>
			<td>Goat Anti-Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>V2258-.2ML</td>
			<td>Monoclonal mouse, clone LN-6, ascites fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>3864154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym Sieve GP Agarose</td>
			<td>Biozyme</td>
			<td>850080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braunol, Spr&#252;hflasche</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>3864073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temgesic)</td>
			<td>GEHE Pharma</td>
			<td>345928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMZ unevirsal electrode puller</td>
			<td>Zeitz</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric razor</td>
			<td>Andes</td>
			<td>NA</td>
			<td>ProClip UltraEdge Super 2-Speed model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3543238</td>
			<td>2,5% (wt/vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microloader pipette tips</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td>Dye content &#8805; 85 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji 2.1.0</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>ToughCut/Straight/9cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish Cell Culture Dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>MedPex</td>
			<td>3705391</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td>calcium, magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Pan-Biotech</td>
			<td>P30-0711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.7.2</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotonic saline solution</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>8609261</td>
			<td>0.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1200 S vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 with Airyscan</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metacam</td>
			<td>Venusberg Apotheke</td>
			<td>8890217</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td>NA</td>
			<td>C57BL/6JRj</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Storage Jar</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>E210</td>
			<td>&#160;16.16.27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>30&#160;mm, hydrophilic PTFE, 0.4&#160;&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Perforated Spoons</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10321-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium, minus phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12348017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan-2 supplement</td>
			<td>Pan-Biotech</td>
			<td>P07-11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-Dre</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>133925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-iCre</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>133924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>175437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>175438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>175257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoNozzle Kit v2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-ALL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Tweezertrodes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0487</td>
			<td>1 mm / 3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Maxi kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex wound closure Clip</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500344-10</td>
			<td>7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sekundenkleber Pattex Mini Trio</td>
			<td>Lyreco</td>
			<td>4722659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave electroporation system ECM830</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>W3 45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>Braun Askina</td>
			<td>9031216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile lubricant eye ointment</td>
			<td>Bayer Vital</td>
			<td>PZN1578675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>Sempermed</td>
			<td>14C0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4621.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supramid 5-0 surgical silk sutures</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-wall glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ visualization of axon growth and growth cone dynamics in acute ex vivo embryonic brain slice cultures

Durante lo sviluppo neuronale, gli assoni navigano nell'ambiente corticale per raggiungere le loro destinazioni finali e stabilire connessioni sinaptiche. I coni di crescita - le strutture sensoriali situate sulle punte distali degli assoni in via di sviluppo - eseguono questo processo. Studiare la struttura e la dinamica del cono di crescita è fondamentale per comprendere lo sviluppo assonale e le interazioni con il sistema nervoso centrale circostante (SNC) che gli consentono di formare circuiti neurali. Ciò è essenziale quando si elaborano metodi per reintegrare gli assoni nei circuiti neurali a seguito di lesioni nella ricerca fondamentale e nei contesti pre-clinici. Finora, la comprensione generale della dinamica dei coni di crescita si basa principalmente su studi di neuroni coltivati in due dimensioni (2D). Sebbene indubbiamente fondamentale per l'attuale conoscenza delle dinamiche strutturali del cono di crescita e della risposta agli stimoli, gli studi 2D travisano l'ambiente fisiologico tridimensionale (3D) incontrato dai coni di crescita neuronale nel tessuto del SNC intatto. Più recentemente, i gel di collagene sono stati impiegati per superare alcune di queste limitazioni, consentendo lo studio dello sviluppo neuronale in 3D. Tuttavia, sia gli ambienti sintetici 2D che 3D mancano di segnali di segnalazione all'interno del tessuto del SNC, che dirigono l'estensione e il pathfinding degli assoni in via di sviluppo. Questo protocollo fornisce un metodo per studiare assoni e coni di crescita utilizzando fette di cervello organotipiche, in cui gli assoni in via di sviluppo incontrano segnali fisici e chimici fisiologicamente rilevanti. Combinando l'elettroporazione fine messa a punto in utero ed ex utero per fornire scarsamente reporter fluorescenti insieme alla microscopia a super-risoluzione, questo protocollo presenta una pipeline metodologica per la visualizzazione delle dinamiche degli assoni e dei coni di crescita in situ. Inoltre, è inclusa una descrizione dettagliata del toolkit dell'analisi dei dati di imaging a lungo termine e delle cellule vive.

Vengono mostrati i risultati rappresentativi ottenuti con il flusso di lavoro del metodo descritto. I topi E15.5 sono stati utilizzati nella presente dimostrazione, sebbene questo protocollo sia facilmente adattabile praticamente a tutte le età embrionali che vanno da E11 alla fine di E17. In questo protocollo, sia l'elettroporazione ex utero (EUE; Figura 2A, 2C-I) o elettroporazione in utero (IUE; Le figure 2B, C e 2J-Q) sono state utilizzate per fornire plasmidi nei neuroni progenitori che rivestono i ventricoli laterali. Questi progenitori sono la fonte dei futuri neuroni proiettati corticali (CPN)15,16. Sono state preparate miscele di plasmidi per guidare l'espressione neurone-specifica sparsa di membrana (Lyn)-mNeonGreen (Figura 1A) o LifeAct-enhanced (E)GFP (Figura 1B) per valutare rispettivamente il comportamento complessivo e le dinamiche dell'actina nei coni di crescita. Inoltre, è stato incluso un mix di plasmidi mirato a etichettare i singoli neuroni con turbo(t)-RFP o zoanthus sp. (Zs) proteina fluorescente verde (ZsGreen) (Figura 1C). Ciò facilita il monitoraggio del comportamento del cono di crescita da neuroni vicini indipendenti.
La dissezione cerebrale da embrioni elettroporati è un passaggio cruciale che deve essere eseguito con attenzione per ottenere fette di alta qualità, preservando la struttura cerebrale nativa. Gli strumenti di dissezione e il vibratoma sono stati preparati in anticipo e accuratamente sterilizzati con etanolo (Figura 3A, B). Successivamente, le teste di embrioni elettroporati sono state accuratamente sezionate e i cervelli sono stati estratti. Qui viene mostrata la dissezione rappresentativa del cervello dagli embrioni sottoposti a EUE a E15 (Figura 3C-F) ed E12.5 (Figura 3G-J). I cervelli vengono immediatamente racchiusi in una matrice di agarosio, affettati e posizionati su inserti di membrana in PTFE all'interno di un piatto di vetro inferiore per l'incubazione (Figura 3K-M).
Lo stato di salute delle fette di cervello è un punto significativo per il controllo per garantire risultati affidabili. Ogni giorno è stata eseguita un'ispezione visiva per qualsiasi contaminazione. Inoltre, una volta che la coltura è stata finalizzata, le fette di cervello vengono fissate e sottoposte a immunoistochimica. Qui,4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) è stato utilizzato per controllare l'organizzazione cellulare complessiva e la colorazione della vimentina per rivelare l'organizzazione gliale; in particolare, impalcatura radiale glia (RG). Tipicamente, le fette di cervello coltivate con successo derivate da IUE o EUE mostrano una normale distribuzione cellulare come rivelato da DAPI e una serie in qualche modo organizzata di RG con processi di contatto piale orientati apicalmente17 (Figura 4A, B rispettivamente). Occasionalmente, si osservano marcati disturbi nell'impalcatura RG in fette di cervello in coltura, specialmente in quelli derivati dall'elettroporazione EUE (Figura 4C). Le fette di cervello con impalcatura RG estremamente disorganizzata mostrano una migrazione neuronale compromessa e una crescita assonale difettosa (non mostrata). Quindi, il controllo dell'impalcatura RG è un semplice metodo post-coltura per ordinare i dati ottenuti da fette di cervello affidabili.
Le fette di cervello derivate da IUE o EUE con mix di plasmidi che esprimono Lyn-mNeonGreen si traducono in un'etichettatura simile dei neuroni sparsi. Un CPN piramidale rappresentativo che esprime Lyn-mNeonGreen e il comportamento dinamico del suo cono di crescita è mostrato come esempio (Figura 5A e Video supplementare 1, in alto a sinistra). Inoltre, i neuroni sono stati etichettati utilizzando un plasmide che esprime una sonda di actina per analizzare la dinamica dell'actina dei coni di crescita assonale in situ (Figura 5B e Video supplementare 1, in basso a sinistra). Sono stati eseguiti anche esperimenti in situ con un plasmide a doppia espressione fluorofora Cre/Dre (Figura 1C e Video supplementare 1, a destra). I fluorofori tRFP o ZsGreen in questo plasmide potrebbero essere attivati in modo specifico e individuale da ricombinasi Dre o Cre, rispettivamente, nei neuroni vicini (Figura 5C). Questa formazione sperimentale consente l'analisi affiancata dei coni di crescita dai neuroni di controllo con neuroni modificati vicini (qualsiasi perdita o guadagno di funzione). Ciò elude la variabilità derivante dall'uso di diverse fette per testare il controllo e le condizioni sperimentali.
Sono stati analizzati i kymografi generati dal filmato registrato, dai quali è possibile ottenere facilmente parametri di crescita dinamica come l'attività protrusiva nel tempo e la lunghezza della crescita (Figura 6A). Si noti che una semplice regolazione della risoluzione temporale del time-lapse consente di misurare la velocità di allungamento degli assoni per 2 ore (Figura 6A). Inoltre, la variazione del volume del cono di crescita nel tempo - una misura dell'attività dinamica generale del cono di crescita - può essere facilmente ottenuta, in questo caso con software concesso in licenza (Figura 6B e Figura 6E, F). Questo può essere utilizzato per valutare la velocità del tapis roulant dell'actina e l'equilibrio tra filopodia / lamellipodia durante l'attività di esplorazione del cono di crescita.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig01.jpg"> Figura 1: Schemi dei plasmidi utilizzati nel protocollo. (A) pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen. (B) p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP. (C) pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA. Informazioni rilevanti riguardanti i componenti del plasmide e l'origine del fluoroforo si trovano nelle scatole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig02.jpg"> Figura 2: Flusso di lavoro dell'elettroporazione ex utero e in utero di topi E15.5. (A) Allestimento di una stazione chirurgica per l'elettroporazione ex utero. (B) Allestimento di una stazione chirurgica per l'elettroporazione in utero. (C) Corna uterine tirate fuori dalla cavità addominale del topo anestetizzato. (D) Estrazione di un embrione dal sacco uterino. (E) Sacrificio embrionale mediante completa traslazione del midollo spinale mediante incisione diagonale; si noti che la decapitazione è stata evitata. (F) Posizionamento dell'embrione nel detentore e iniettato con la miscela DNA/Fast Green nel ventricolo laterale sinistro. (G,H) Posizionare la testa dell'embrione tra gli elettrodi della pinzetta di platino con il catodo (freccia rossa) sopra la corteccia con un angolo di 60 °. (I) Posizionamento delle braccia dell'embrione (frecce nere) all'esterno del detentore per evitare lo scivolamento dell'embrione durante la procedura. (J) Rotazione dell'embrione all'interno del sacco uterino per esporre la testa. (K,L) Iniezione di miscela DNA/Fast Green nei ventricoli laterali dell'embrione attraverso la parete uterina. (M) Posizionare la testa dell'embrione tra gli elettrodi della pinzetta di platino con un catodo (freccia rossa) sopra la corteccia con un angolo di 60°. (N) Incisione muscolare suturata tramite sutura di bloccaggio in esecuzione. (O) Incisione cutanea suturata mediante sutura interrotta. (P) Fissaggio della ferita mediante clip chirurgiche per ferite e disinfezione mediante betadina. (Q) Posizionamento del mouse nella gabbia di recupero con luce di riscaldamento a infrarossi lontani. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig03.jpg"> Figura 3: Estrazione di cervelli E15.5 ed E12.5 e procedura di slice culture organotipica. (A) Strumenti utilizzati per la procedura di estrazione del cervello. (B) Allestimento di una stazione di coltura organotipica. (C-F) Estrazione del cervello E15.5. (G-J) Estrazione del cervello E12.5. Le linee tratteggiate evidenziano la posizione delle incisioni. Le frecce rosse indicano la direzione di tirare con una pinza. (K) Incorporare il cervello in un piatto di 3 cm contenente il 3% di agarosio a bassa fusione, lasciando uno spazio di distanza di agarosio di 1-2 mm sotto il cervello. (L) Raccolta di 150 μm di fetta di cervello. (M) Posizionamento di fette di cervello su inserti a membrana in PTFE immobilizzati in un piatto da 35 mm utilizzando pellicola di paraffina (freccia blu). La marcatura a stella rossa indica una data raccolta di fette di cervello dal vibratoma (L) e il suo trasferimento alla membrana ptfe (M). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig04.jpg"> Figura 4: Struttura cellulare gliale radiale conservata in fette organotipiche sane. Immagini confocali di fette cerebrali E17.5 che rivelano array RG (vimentina; verde) e organizzazione cellulare complessiva (DAPI; magenta) dopo IUE (A) e EUE (B,C). Si notino i forti disturbi nell'array RG che possono occasionalmente derivare da EUE (C). Gli ingrandimenti corrispondono ai fotogrammi punteggiati di rosso nella figura principale: barre di scala, 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig05.jpg"> Figura 5: Visualizzazione in situ della dinamica del cono di crescita in fette organotipiche acute. (A,B) Neuroni e i loro corrispondenti coni di crescita etichettati rispettivamente con Lyn-mNeonGreen e LifeAct-GFP. Stella rossa che segna il cono di crescita del neurone che esprime Lyn-mNeonGreen. Asterisco blu che segna il cono di crescita del neurone che esprime LifeAct-GFP. (C) Neuroni vicini etichettati con il sistema a doppio plasmide contenente tRFP (magenta) e ZsGreen (verde) e i loro corrispondenti coni di crescita. I coni di crescita ripresi (a destra) erano al di fuori del fotogramma catturato (a sinistra), ottenuti poco dopo aver acquisito il time-lapse del cono di crescita; barre di scala, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2.jpg"> Figura 6: Analisi della velocità di crescita degli assoni e del volume del cono di crescita. (A) Tracciamento dell'assone su un neurone che esprime Lyn-mNeonGreen (in alto) e il suo corrispondente kymografo (sotto) generato utilizzando ImageJ. (B) Ricostruzione del video z-stack del cono di crescita utilizzando il software di analisi delle immagini (in alto) e lo stesso cono di crescita evidenziato utilizzando lo strumento di misurazione delle superfici (sotto). (C) Grafici che mostrano i cambiamenti nella velocità di crescita nel tempo per diversi assoni. (D) La velocità media di crescita degli assoni è quantificata in (C). (E) Grafico che mostra le variazioni del volume del cono di crescita nel tempo. F) Il volume medio dei coni di crescita è quantificato in (E); barra della scala, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig07.jpg"> Figura 7: Migrazione radiale e polarizzazione neuronale dei neuroni corticali piramidali. Diagramma che illustra lo sviluppo di neuroni corticali piramidali (rosa) che migrano radialmente dalla zona ventricolare germinale (VZ) verso la superficie pia. Guidati da processi di glia radiale (grigio), i neuroni polarizzati migratori stabiliscono un processo principale, il dendrite futuro e il processo finale, l'assone futuro, che continuano ad estendersi verso il basso verso la zona intermedia (IZ). Le caselle rosse tratteggiate rappresentano le aree corticali in cui sono stati ripresi i coni di crescita. In particolare nell'IZ, zona subventricolare (SVZ) o unendo fasci assonali (verde). L'illustrazione è stata creata con uno strumento basato sul web, BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Plasmide</td>
			<td>Concentrazione (μg/μL)</td>
			<td>Destinazione d'uso</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td>
			<td>0.25</td>
			<td rowspan="3">Etichettatura delle proteine bersaglio di membrana (Lyn)</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-iCre</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-LifeAct-GFP</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Etichettatura dell'actina filamentosa (F-actina) nei coni di crescita</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="5">Etichettatura indipendente di due popolazioni di neuroni vicini</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-iCre</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-Dre</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Elenco dei plasmidi utilizzati nel protocollo. Nome, concentrazione e destinazione d'uso di ciascun plasmide utilizzato.
Video supplementare 1: Visualizzazione in situ della dinamica del cono di crescita in fette organotipiche acute. Dinamica dei coni di crescita etichettati con Lyn-mNeonGreen (in alto a sinistra) e LifeAct-GFP (in basso a sinistra). I coni di crescita vicini sono etichettati in modo differenziale con il sistema a doppio plasmide contenente tRFP (magenta; in alto a destra) e ZsGreen (verde; in basso a destra). Intervallo di imaging, 2,5 s. Barre di scala, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/Supplementary_Video_1.mp4" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures at JoVE.com

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

Questo protocollo dimostra un metodo semplice e robusto per studiare la crescita degli assoni in situ e la dinamica dei coni di crescita. Descrive come preparare ex vivo fette di cervello acuto fisiologicamente rilevanti e fornisce una pipeline di analisi di facile utilizzo.

Sul posto Visualizzazione delle dinamiche dei coni di crescita e crescita degli assoni in colture di fette di cervello embrionali ex vivo acute

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

Come gli assoni navigano nella complessa matrice del sistema nervoso centrale è una domanda fondamentale in neurobiologia. Questo protocollo consente lo studio della crescita degli assoni e della dinamica dei coni di crescita nell'ambiente fisiologico con imaging ad alta risoluzione. Questo protocollo descrive una pipeline end-to-end di facile utilizzo per la consegna del DNA nel cervello embrionale del topo, preparazioni per fette organotipiche di alta qualità e una guida passo passo per l'acquisizione e l'analisi delle immagini.Sebbene originariamente progettato per studiare la dinamica degli assoni nel sistema nervoso centrale embrionale, questo protocollo potrebbe essere regolato per consentire la coltura organotipica e la visualizzazione della plasticità assonale dopo condizioni traumatiche o patologiche. Il protocollo stesso è relativamente semplice. Tuttavia, raggiungere la sua prima etichettatura e conservazione delle strutture cerebrali sono punti critici.Pertanto, l'elettroporazione, la dissezione del cervello e le fasi di affettamento richiedono una cura extra. Dimostrare la procedura sarà utile e lo studente di dottorato proviene dal laboratorio di Bracket. Dopo aver anestetizzato una topa femmina incinta, fare un'incisione per estrarre entrambe le corna uterine usando un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione salina calda o pinza, afferrando con cura gli spazi tra gli embrioni.Quindi posizionare gli embrioni su una garza bagnata. Dopo aver tagliato aprire il sacco uterino, rimuovere ogni embrione. Metti gli embrioni in un piatto di 10 centimetri contenente HBSS integrato con glucosio su ghiaccio.Per l'elettroporazione ex utero, prendi un embrione e mettilo nel supporto. Quindi inserire con attenzione il capillare di vetro contenente la miscela verde veloce del DNA attraverso il cranio dell'embrione nel ventricolo laterale e iniettare da due a tre microlitri della miscela di plasmidi del DNA in ciascun ventricolo. Quindi, tenere la testa dell'embrione tra gli elettrodi della pinzetta di platino all'angolo appropriato per colpire l'area cerebrale desiderata, con il catodo rivolto verso l'area in cui è previsto il trasferimento del DNA.Per l'elettroporazione in utero, dopo aver estratto le corna uterine e posizionato gli embrioni su una garza bagnata come dimostrato in precedenza, utilizzare la punta delle dita per ruotare delicatamente l'embrione all'interno dell'utero fino a quando non si trovano le suture lambdoidali e saggitali. Quindi inserire con attenzione il capillare di vetro contenente la miscela verde veloce del DNA attraverso la parete uterina e il cranio dell'embrione nel ventricolo laterale e iniettare da due a tre microlitri della miscela di plasmidi del DNA in uno o entrambi i ventricoli come desiderato con un massimo di due microlitri per ventricolo. Dopo l'iniezione, tenere la testa dell'embrione tra gli elettrodi della pinzetta di platino all'angolo appropriato per colpire l'area cerebrale desiderata con il catodo rivolto verso l'area in cui è previsto il trasferimento del DNA.Una volta che tutti gli embrioni richiesti sono stati elettroporati, utilizzare un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione salina per posizionare delicatamente le corna uterine all'interno della cavità addominale. Suturare le incisioni muscolari e cutanee utilizzando materiale di sutura 5-0, quindi fissare la ferita con clip di sutura e disinfettare la ferita spruzzandola con betadine. Riposizionare il mouse nella gabbia di recupero e mantenere il calore utilizzando una luce di riscaldamento a infrarossi lontani per almeno 20 minuti dopo la procedura.Fissare la testa dell'embrione sotto un microscopio di dissezione. Quindi rimuovere la pelle nel cranio tagliando lungo la linea mediana partendo dalla base della testa verso il naso. Sbucciare la pelle nel cranio lateralmente creando uno spazio abbastanza grande da poter essere asportato dal cervello.Successivamente, per rimuovere il cervello inserire la punta chiusa di forbici di dissezione sterili che iniziano sotto il bulbo olfattivo e si muovono verso il tronco cerebrale. Quindi tagliare il tronco cerebrale e tagliare molti pezzi sciolti di meningi intorno al cervello. Usando un cucchiaio perforato, raccogli il cervello e rimuovi il liquido in eccesso tamponando il fondo del cucchiaio contro la carta velina secca.Quindi metti il cervello in un piatto di agarosio sul ghiaccio. Successivamente, usando un cucchiaio più piccolo mescolare l'agarosio per 10 secondi per un raffreddamento uniforme, quindi manovrare il cervello al centro del piatto posizionandolo orizzontalmente con il lato dorsale verso l'alto e assicurandosi che sia completamente coperto di agarosio da tutte le direzioni. Prelevare delicatamente il blocco di agarosio dalla postazione di lavoro Vibratome e asciugare il fondo tamponando la carta velina.Quindi posizionare il blocco sull'area incollata del supporto del campione con il lato rostrale del cervello rivolto verso l'alto e mettere il supporto del campione sul ghiaccio. Lasciare asciugare la colla per un minuto. Tagliare il cervello a fette coronali con un angolo di 15 gradi.Quindi, utilizzando spatole pulite, raccogliere le fette di cervello e posizionarle su una membrana di PTFE immobilizzata in un piatto di fondo di vetro da 35 millimetri usando Parrafin. Raccogli fino a cinque fette di cervello per membrana. Successivamente, utilizzando una pipetta da 200 microlitri rimuovere la soluzione di glucosio HBSS in eccesso da intorno alle fette sulla membrana lasciando le fette semi asciutte, quindi aggiungere 500 microlitri di slice media preriscaldata direttamente nello spazio sotto la membrana e incubare le fette a 35 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.Per l'imaging della crescita degli assoni, individuare una regione della corteccia con densità cellulare da bassa a media. Mentre per l'imaging della dinamica del cono di crescita, individuare un cono di crescita nella zona immediata della corteccia o nella zona subventricolare. Quindi definire una dimensione dello stack Z.Per la crescita degli assoni in una grande pila Z, impostare una dimensione del gradino di due micrometri e per i coni di crescita in una pila Z più piccola, impostare una dimensione del gradino di un micrometro. Per l'analisi dei dati, aprire il file immagine in Figi facendo clic su file, quindi apri e selezionando l'immagine. Ottieni la proiezione di massima intensità del time lapse facendo clic sull'immagine, seguita da pile, proiezione Z e proiezione di massima intensità.Passa attraverso il lasso di tempo e individua un assone in crescita. Una volta individuato, disegna una linea attraverso l'assone in crescita, partendo dalla punta dell'assone nel primo fotogramma e seguendo l'assone per tutto il lasso di tempo. Quindi, canta il plugin kymo re-slice wide.Imposta la scala del kymograph andando su image, quindi su properties. Dopo aver impostato la distanza in micrometri, la larghezza dei pixel e il tempo in secondi o minuti e l'altezza dei pixel, vai ad analizzare e fai clic su Misura. Per misurare il volume del cono di crescita, aprire il file di immagine nel software di analisi delle immagini facendo clic su file, apri e selezionando il file di interesse.Quindi, selezionate la procedura guidata Aggiungi nuove superfici nel primo passaggio, in Impostazioni algoritmo, selezionate segmenta solo una regione di interesse e, nel secondo passaggio, ritagliate la cornice per adattarla all'intero cono di crescita in tutti i fotogrammi. Successivamente, nel terzo passaggio, mantenere la soglia all'intensità assoluta e nel passaggio quattro, assicurarsi che l'intera regione del cono di crescita sia thresholded. Quindi nel passaggio cinque, sotto il tipo di filtro selezionare il numero di voxel LMG a uno.Selezionate il pulsante Esegui per eseguire tutti i passaggi di creazione e terminare la procedura guidata Aggiungi nuove superfici. Infine, nella scheda Statistiche nella parte superiore della finestra della procedura guidata, selezionare valori e volumi specifici nella scheda dettagliata. Tipicamente, le fette di cervello coltivate con successo derivate dall'elettroporazione in utero o ex utero mostrano una normale distribuzione cellulare e una serie organizzata di glia radiale con processi di contatto pilo orientati apicalmente.Occasionalmente si osserva un'elettroporazione ex utero marcata disturbi nell'impalcatura gliale radiale e fette di cervello coltivate che rendono raccomandabile questa colorazione di controllo. Un neurone proiettante corticale piramidale rappresentativo che esprime Lyn-mNeonGreen e il comportamento dinamico del suo cono di crescita è mostrato qui. Inoltre, i neuroni sono stati etichettati utilizzando una sonda di actina che esprime il plasmide per analizzare le dinamiche dell'actina dei coni di crescita assonale in situ.Sono stati eseguiti anche esperimenti in situ con un fluoroforo dual cre dre che esprime il design del plasmide, in cui i fluorofori tRFP o ZsGreen potrebbero essere attivati in modo specifico e individuale da dre o cre ricombinasi, rispettivamente nei neuroni vicini. Dai kymografi si ottengono facilmente parametri di crescita dinamica come la velocità di crescita per diversi assoni e il volume del cono di crescita nel tempo. Questo può essere utilizzato per valutare la velocità del tapis roulant dell'actina e l'equilibrio tra filopodia e lamellapodia durante l'attività di esplorazione del cono di crescita.È importante mantenere la struttura del cervello e mettere a punto le concentrazioni di plasmidi per ottenere un'etichettatura sparsa. Questo è fondamentale per una visualizzazione accurata degli assoni e dei coni di crescita nella corteccia. A seconda dei plasmi selezionati e del background genetico, questo protocollo consente agli utenti di modificare i neuroni o l'ambiente in cui crescono consentendo una vasta gamma di studi.Consentendo l'accesso ad alta risoluzione ai neuroni in situ, questa tecnica consente ai neuroscienziati di interrogare l'interazione dinamica tra i coni di crescita e le metriche del sistema nervoso centrale sia a livello morfologico che molecolare.

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