This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience T&#252;bingen, EXC 307 to T.E. and T.S.; KFO 134 to B.W. and F.P.D.), the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF) (BCCN T&#252;bingen, FKZ 01GQ1002 to T.E and T.B.), and the European Union (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 to M.K. and F.P.D).

Tutte le procedure di animali sono state effettuate rispettando le linee guida e le leggi per la protezione degli animali determinate dal governo federale tedesco e approvato dal comitato istituzionale il benessere degli animali dell&#39;Università di Tubinga. 1. Modelli animali <ol><li> HR2.1: TN-XL Ca 2+ topo biosensore <ol><li> Utilizzare il HR2.1 transgenico: linea di topi TN-XL che esprime il Ca 2+ biosensore TN-XL selettivamente nei fotorecettori cono 10. Utilizzare 3-6 settimane i topi di entrambi i sessi in rilievo con una 12 ore giorno / notte di ritmo normale. </li></ol></li></ol> 2. retina Dissection <ol><li> Soluzione fisiologica <ol><li> Preparare freschi 2 L di soluzione extracellulare, contenente 125 mM NaCl, KCl 2,5 mm, 1 mM MgCl 2, da 1,25 mm NaH 2 PO 4, NaHCO 26 mm 3, 0,5 mM L-glutammina, e 20 mm (+) glucosio. Mescolare fino a quando tutti gli ingredienti si dissolvono. </li><li> Soluzione extracellulare &quot;Bubble&quot;con carboxygen (95% O 2, 5% di CO 2) per 5 - 10 minuti. Aggiungere CaCl 2 per raggiungere una concentrazione di 2 mM. </li><li> Dopo gorgogliare la soluzione extracellulare, misurare il pH. Il pH deve essere 7,4, altrimenti è probabile che gli errori sono stati fatti durante la preparazione della soluzione. Mantenere spumeggiante votare e soluzione temperatura costante per tutto esperimento per garantire costante il pH. </li><li> Separare il brodo in 2 palloni, uno per la dissezione retina e uno per la messa a punto di registrazione (perfusione). </li></ol></li><li> Enucleazione dell&#39;occhio e l&#39;isolamento di retina (5 - 10 min) <ol><li> Mantenere una illuminazione rossa fioca nell&#39;area di lavoro per l&#39;enucleazione. Utilizzare LED con una lunghezza d&#39;onda di picco di 650 nm (o più) per evitare sbiancamento dei coni durante la dissezione. </li><li> Dark-adattare il mouse per 2 ore, mettendo la sua gabbia in un ben ventilata, scatola a tenuta di luce per garantire che i coni siano completamente sensibilizzati al momento della registrazione. </li><li> Anestetizzare il topo sotto un laboratocappa ry con isoflurano (5%) usando un vaporizzatore e un contenitore a tenuta di gas che contiene una gabbia mouse standard. Seguire attentamente le istruzioni del fabbricante quando si maneggia il vaporizzatore. Utilizzare guanti e maschera di protezione per ridurre l&#39;esposizione agli allergeni. </li><li> Utilizzare un microscopio binoculare con un 10 - ingrandimenti 40X per la dissezione. </li><li> Sacrifica il mouse anestetizzata per decapitazione. </li><li> Per l&#39;orientamento, segnare la parte superiore di ogni occhio (= dorsale) con una penna impermeabile. Tieni traccia di se con l&#39;occhio a sinistra oa destra. </li><li> Rimuovere l&#39;occhio con attenzione forbici curve tagliando il nervo ottico dietro il bulbo oculare. Per la dissezione, trasferire il bulbo oculare di una capsula di Petri contenente soluzione extracellulare appena carboxygenated. Per il trasferimento del bulbo oculare, tenerlo dal moncone del nervo ottico. </li><li> Perforare dell&#39;occhio in qualsiasi punto lungo il confine tra la cornea e la sclera (cioè, al serrata) con un ago per iniezione tagliente. </li><li> Tenere la postavoi alla sclera con un paio di pinze e delicatamente inserire uno Forbici nel foro praticato nel passaggio precedente. Tagliare lungo serrata per separare la parte anteriore dell&#39;occhio (cornea, cristallino, vitreo) dalla parte posteriore (oculare). Tagliare l&#39;oculare radialmente (verso il disco ottico) nella posizione del marchio penna per indicare la posizione supina sulla retina. Nota: Preparato in questo modo, le conchiglie oculari possono essere tenuti in soluzione continua carboxygenated per un uso successivo. </li><li> Girare l&#39;oculare nella scatola di Petri in modo tale che la dorsale tagliato punti di distanza da se stessi. Afferra la sclera sul lato destro della conchiglia oculare con un paio di pinze ogni sinistra e inserendo le punte pinze tra retina e sclera. </li><li> Staccare la retina invertendo delicatamente la parte sclerale della conchiglia oculare. Infine, tagliare il nervo ottico utilizzando micro sezionare forbici per liberare la retina dalla sclera. Nota: Questo è un passo fondamentale. Evitare danni alla retina (ad esempio,toccante e stringendolo con una pinza). </li><li> Tenere uno dei bordi della retina con un paio di pinze e delicatamente rimuovere i detriti e corpo vitreo dalla superficie retinica utilizzando un secondo paio di pinze. Quando la superficie della retina è pulita, utilizzare micro dissezione forbici per fare altre tre brevi, tagli radiali (circa ogni 90 °). Questi tagli permettono di appiattire accuratamente la retina con il lato rivolto verso il basso fotorecettori nella scatola di Petri (Figura 1A). </li></ol></li><li> Preparazione Slice (10 - 15 min) <ol><li> Preparare membrane filtranti di nitrocellulosa in anticipo per la retina di affettamento e vetro coperture scivola per il montaggio fette e trasferirli alla camera di registrazione. Tagliare membrana filtrante di nitrocellulosa in circa 10 x 5 millimetri di dimensioni pezzi rettangolari con le forbici. Tagliare coprioggetto in pezzi rettangolari di circa 10 x 5 mm di dimensioni con un tagliavetro. </li><li> Lentamente immergere un vetrino nella soluzione extracellulare vicino atissue. Delicatamente, tirare la retina sul vetrino con il lato di cellule gangliari da afferrandolo al limite con un paio di pinze. Questo processo riduce danni meccanici e la piegatura del tessuto. </li><li> Scegli la regione della retina che è legato alla rispettiva domanda di ricerca (si veda anche la discussione). Ricordate, il lungo taglio fatto nella fase 2.2.9 segna la metà della retina dorsale (Figura 1A). Tagliare a, circa 1 x 2 mm pezzo rettangolare di dimensioni fuori della regione retinica selezionato utilizzando un bisturi curvo. Rimuovere la soluzione in eccesso intorno al tessuto. </li><li> Posizionare la membrana del filtro sulla parte superiore del pezzo di retina tale che il lato cellule gangliari aderisce alla membrana. Immediatamente, aggiungere una goccia di mezzo extracellulare sulla membrana per fissare saldamente il tessuto alla membrana. </li><li> Trasferire il tessuto retinico montato membrana alla camera affettatura contenente soluzione fresca extracellulare. </li><li> Tagliate a fette retina verticali di 200 micronspessore (Figura 1B) usando una lama di rasoio fresco attaccato ad un chopper tessuti 23. Cambia lama per ogni pezzo della retina. Nota: La lama di rasoio deve essere perfettamente allineata con la superficie del fondo della camera di affettatura tale che tutta la membrana divide simultaneamente, come indicato da un &quot;clic&quot; suono durante il taglio - altrimenti la lama può piegare e danneggiare la fetta. </li><li> Incollare una sola fetta montato a membrana su un vetro di copertura antiscivolo applicando grasso alto vuoto alla membrana termina solo (Figura 1C). Mantenere la superficie del vetro sotto la retina privo di grasso. </li><li> Mantenere fette montato coprioggetto rivestiti da una goccia di soluzione extracellulare nella camera di tenuta - un contenitore chiuso a tenuta di luce e, ad esempio, una piastra di Petri con coperchio coperto con un foglio di alluminio - in atmosfera carboxygen a RT. Introdurre carboxygen facendo gorgogliare un piccolo serbatoio d&#39;acqua per mantenere l&#39;atmosfera nell&#39;aziendacamera umidificata; questo impedisce le fette si secchi. </li><li> Lasciare fette di riposare nella camera di tenuta per 10 - 15 minuti prima di loro (uno per uno) di passare alla camera di registrazione. Fette possono essere mantenuti fino a 4-5 ore in possesso camera alla RT (~ 21 ° C). </li></ol></li></ol> 3. a due fotoni Ca 2+ Imaging <ol><li> Microscopia a due fotoni <ol><li> Utilizzare un microscopio obiettivo mobile (MOM) tipo microscopio a due fotoni. Sono stati descritti sia nel design che di imaging procedure MOM in precedenza 24, per i dettagli vedere anche 10,21,25 (per le fonti e le imprese, vedi tabella 1). Nota: Ogni montante microscopio a due fotoni che soddisfi i seguenti requisiti minimi possono essere utilizzati: Deve essere dotato di (a) un laser pulsato sintonizzabile a ~ 860 nm, (b) almeno due canali di fluorescenza acquisiti contemporaneamente, (c ) Filtri per ECFP e citrino fluorescenza, (d)uno stimolatore di luce (per eventuali disegni, vedi 24,26), e (e) un software che consente di registrare le sequenze di immagini in tempo trascorso in un frame rate sufficiente a risolvere il Ca 2 + segnali di interesse. </li><li> Avviare il sistema di imaging due fotoni come indicato dal produttore. Rigorosamente seguire le linee guida di sicurezza del laser della struttura. Avviare il laser e sintonizzare a ~ 860 nm. </li><li> Trasferire una fetta da camera di tenuta alla camera di registrazione e iniziare immediatamente perfusione con soluzione extracellulare carboxygenated. Mantenere un flusso di perfusione di 2 ml / min e una temperatura di 37 ° C nella camera di registrazione. </li><li> Utilizzare un NA obiettivo 20X 0,95 immersione in acqua. Se disponibile, utilizzare una telecamera CCD in combinazione con un infrarossi LED sotto camera di registrazione per localizzare la fetta della retina (Figura 2). In caso contrario, individuare fetta con due fotoni di imaging (vedi 3.1.5). </li><li> Passare a due fotoni di imaging per visualizzare espressione biosensore. Accendii due canali di rilevazione per imaging di fluorescenza di ECFP e citrino. </li><li> Utilizzare il software di acquisizione di immagini che controlla il microscopio a due fotoni per la scansione e selezionare una riga di terminali conici per la registrazione (Figura 3A). Impostare l&#39;acquisizione di immagini a 128 x 16 pixel immagini (31.25 Hz) o una configurazione simile. Restringere area acquisita ai terminali conici per evitare lo sbiancamento di fotopigmenti in segmenti esterni. Nota: Per il sensore TN-XL calcio (τ = ~ 0,6 sec per Ca 2+ vincolante, τ = ~ 0,2 sec per Ca 2+ non vincolante; vedi 16) un frame rate minimo di ~ 8 Hz è raccomandato. </li></ol></li><li> Stimolazione della luce e la registrazione <ol><li> Utilizzare un sub-stage full-campo di luce stimolatore come descritto altrove 10,21,26 per eseguire le seguenti operazioni. Nota: una soluzione semplice per uno stimolatore di luce a tutto campo è quello di utilizzare due LED passa-banda-filtrati (per esempio, &quot;blu&quot;: 360 BP 12, &quot;verde&quot;: 578 BP 10)che corrispondono alle sensibilità di lunghezza d&#39;onda di coni di topo, ma allo stesso tempo non si sovrappongono con i filtri utilizzati per il rilevamento della fluorescenza (cfr. 3.2.4). La luce dei LED è focalizzata dal condensatore attraverso il fondo della camera di registrazione (Figura 2). Per i dettagli su questo disegno stimolatore, la taratura, le intensità di luce utilizzate e le tariffe cono foto-isomerizzazione evocati, vedere 10,21,26. </li><li> Accendere il laser e permettono coni di adattarsi al scansione laser e la luce dello stimolo di fondo (20 - 30 secondi, puoi anche potenziali insidie) prima di presentare stimoli luminosi (vedi 3.2.3) o l&#39;applicazione di agenti farmacologici. </li><li> Inizia presentazione di stimoli arbitrarie (es lampi di luce, come mostrato nella Figura 3B, C). Nel caso dello stimolatore descritto nel passaggio 3.2.1, generare gli stimoli modulando l&#39;intensità dei due LED nel tempo utilizzando una scheda a microprocessore controllato da software personalizzato (perdettagli, vedere 10,21,26). </li><li> Avviare la registrazione dei due canali di fluorescenza (ad esempio, a 483 nm per &quot;blue&quot; FRET-donatore ECFP e a 535 nm per &quot;giallo&quot; FRET-accettore,. Per specifiche vedi Tabella 1) contemporaneamente utilizzando il relativo software di acquisizione di immagini (vedi anche 3.1 .6). Ad esempio, nel caso di lampi di luce (Figura 3B, C), registrare almeno 8 - 10 presentazioni stimolo (prove). </li></ol></li><li> Ca 2+ calibrazione &quot;In-slice&quot; <ol><li> Record di Ca 2+ segnali nei terminali a cono (come descritto in 3.1.6 e 3.2.4) ed estrarre la linea di base Ca 2+ livello in una serie di coni (come descritto in 3.4). </li><li> Passare a &quot;Ca 2+ libero&quot; mezzo extracellulare con 5 micron ionomicina (sciolto in DMSO) e 10 mM EGTA (o, in alternativa, BAPTA) ha aggiunto. Terminali Record cono di nuovo ogni 5 minuti per determinare il rapporto di fluorescenza minima (R min), &lt;em&gt; cioè, il rapporto in (vicino) assenza di Ca2 + intracellulare. Questo può richiedere tra i 15 - 30 min. Nota: un sistema di perfusione è richiesto che consente il passaggio tra i diversi serbatoi. </li><li> Passare a mezzo extracellulare con 5 micron ionomicina (sciolto in DMSO) e Ca 2,5 mm 2 +. Dopo un tempo di incubazione di 5 minuti, coni registrare nuovamente ogni 5 min per misurare il rapporto di fluorescenza massima (R max), cioè il rapporto in presenza di saturare concentrazioni di Ca2 + intracellulare. Dopo l&#39;applicazione ionomicina, si può prendere tra 3-15 min per il rapporto Ca 2+ a diventare stabile. Nota: Esponendo le fette di alta Ca 2+ e ionomicina per un periodo più lungo finirà per danneggiare le cellule. Includere solo le cellule per l&#39;analisi che mantengono la loro morfologia normale. Concentrazioni (cioè, EGTA, ionomicina) potrebbero dover essere adattati. Per maggiori dettagli sulla calibrazione Ca 2+protocollo, vedere 13,17. </li></ol></li><li> Analisi dei dati Nota: utilizzare un software di elaborazione delle immagini e l&#39;analisi dei dati compatibile con il rispettivo software microscopio e in grado di eseguire script di analisi personalizzate. <ol><li> Caricare un file di dati di imaging e disegnare regioni di interesse (ROI) intorno ad ogni terminale cono (Figura 3A). Per ogni frame, intensità media di fluorescenza ai ROI e sottrarre fluorescenza di fondo, prima di calcolare il rapporto (R) tra FRET-accettore (citrino) e donatore (ECFP) fluorescenza (R = F A / F D; la figura 3B, C). Questo rapporto viene in genere utilizzato come proxy per il parente concentrazione intracellulare di Ca 2+, ma dopo la calibrazione (vedi 3.3), anche le concentrazioni assolute può essere stimato (vedi 3.4.3). Nota: I peduncoli sono riconoscibili dalla loro posizione nello strato plessiforme esterno e la loro morfologia (un po &#39;appiattito &quot;blob&quot; più piccolo rispetto al conosomata, situato all&#39;estremità dell&#39;assone cono). </li><li> Prove di stimolo medio (Figura 4A). Estrarre parametri di risposta da tracce medi (Figura 4B), come Ca 2+ livello di base (base R) prima stimolazione luminosa, ampiezza di picco (R amp), e l&#39;area sotto la curva (R A) le misure per la taglia risposta. Inoltre, estrarre la cinetica di reazione da tracce mediate, come aumento di risposta (t aumento) e tempo di decadimento (t decadimento) (= rispettivi intervalli di tempo tra il 20% e il 80% di R amp; vedi illustrazione nella Figura 4B). Per maggiori dettagli su come determinare questi parametri, vedere 10. </li><li> Calcola una stima del cono assoluto Ca 2+ concentrazione sulla base delle misurazioni da passaggi 3.3.1-3.3.3. Utilizzare i rapporti di minima e massima concentrazione Ca 2+, R e R max min, rispettivamente, la fluorescenza del donatore nel Ca 2+ </sup&gt; -bound (F D, Ca-bound) e -unbound (F D, Ca-libera) dello stato, nonché l&#39;in-vivo costante di dissociazione (K d = 0,77, vedere 16) per TN-XL con il seguente equazione (da analogico a 27): </li></ol></li></ol><img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/52588/52588eq1.jpg" />

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Protocolli pre-esistenti utilizzando registrazioni unicellulari elettrofisiologiche o Ca 2+ immagini con indicatori fluorescenti sintetici lottano per registrare i Ca 2+ dinamiche in fotorecettori coni del mouse per una serie di ragioni tecniche (vedi introduzione). Il protocollo qui descritto consente la misurazione di Ca 2+ segnali e persino assoluti Ca 2+ nei singoli livelli, terminali cono topo individuate in modo efficiente e relativamente semplice. Questo protocollo è già stato utilizzato con successo in tre studi affrontando diversi aspetti della funzione cono nel sano retina di topo. Nel primo studio 10, la HR2.1: Mouse TN-XL è stato caratterizzato con immunoistochimica, registrazioni ERG, a due fotoni Ca 2+ di imaging, e farmacologia, mostrando che la specifica espressione-cono del Ca 2+ biosensore non ostacola cono anatomia e la funzione. Nel secondo studio 21, cromaticae proprietà di risposta acromatici di coni di topo sono state mappate in tutta la retina, dimostrando notevoli differenze nella funzione cono tra dorsale opsina dominato &quot;verde&quot; e il &quot;blu&quot; ventrale del mouse retina opsina-dominato. Queste differenze regionali nelle proprietà cono abbinati alla distribuzione di contrasto differenziale in ambiente naturale (ad esempio, cielo contro terra), il che suggerisce che i diversi tipi spettrali di coni di topo prevedono (vicino) campionamento ottimale di contrasti acromatici e, quindi, può offrire un vantaggio evolutivo. Nel terzo studio 22 le valutazioni reciproche che i terminali cono assoni ricevono dalle cellule orizzontali è stata studiata. Come tutti i meccanismi di feedback cellula orizzontale proposte agiscono sul voltaggio-dipendenti Ca 2+ canali nei terminali cono assoni 28, terminale cono Ca 2+ può servire come un proxy per le interazioni orizzontali cellula-cono. Lo studio di Kemmler e collaboratori 22 supportil&#39;idea che cellule orizzontali utilizzano un sistema di feedback complesso composto da diversi meccanismi per controllare il rilascio di glutammato fotorecettori. Questi studi dimostrano la versatilità del protocollo descritto e mostrano che può essere adattato ad una vasta gamma di questioni relative al funzionamento cono e suoi circuiti sinaptici. Inoltre, il protocollo consente studiare locale Ca 2+ segnalazione nei vari compartimenti cono, ad una migliore comprensione della fisiologia cono. Tale conoscenza è importante per comprendere i processi fisiopatologici in coni degenerazione, per consentire eventualmente per lo sviluppo razionale di potenziali approcci terapeutici, in particolare per le malattie degenerative che colpiscono i coni. Nella HR2.1: linea di topi TN-XL, il Ca 2+ biosensore è espresso tutto il cono, con l&#39;eccezione del segmento esterno. Questo offre l&#39;opportunità per una valutazione diretta e raziometrica di Ca 2+ dinamicos in diversi scomparti cono. Poiché l&#39;evoluzione Ca 2+ correnti nel segmento esterno si riflettono in terminali con il potenziale di membrana e l&#39;attivazione risultante di Ca 2+ canali voltaggio-dipendenti, processi nel segmento esterno possono essere osservati indirettamente. Potenziali insidie: La dissezione della retina è un passaggio fondamentale: Nel topo, la retina si separa dalla oculare di solito tra i segmenti esterni dei fotorecettori e dell&#39;epitelio pigmentato. Pertanto, i segmenti esterni fotorecettori fotosensibile della retina isolata sono esposti ed estremamente resistenti ai danni meccanici. Grande attenzione deve essere presa non danneggiare toccando il lato fotorecettore con strumenti o spostando il tessuto lateralmente su una superficie adesiva (ad esempio, una membrana filtro). Fette retina di alta qualità può essere riconosciuto al microscopio per la loro superficie di taglio pulito eda uno strato fotorecettore ben organizzata con segmenti esterni chiaramente definiti. Valutazione funzionale di qualità fetta può essere rapidamente fatto lampeggiare stimoli luminosi luminosi e la determinazione della percentuale di coni sensibili (ad esempio, in un campo visivo con 10-20 coni). Qui, la qualità risposta dovrebbe essere valutata calcolando il rapporto segnale-rumore (S / N) (ampiezza del rumore di fondo prima della luce stimolo vs. ampiezza della risposta luce); un S / N di 2 - 3 dovrebbe essere considerato come la soglia minima. Tipicamente, scartiamo fette con meno del 50% coni sensibili. Seziona Anche con i coni che mostrano eccessivo comportamento chiodare spontanea (si veda la Figura 4 a 10) deve essere eliminata. Fette nella camera di registrazione che soddisfano i criteri anatomici e funzionali di cui sopra mostrano risposte coerenti per 1-2 ore (per i dettagli su consistenza di risposta, vedi 10). Perché fette sopravvivere per orela nostra in camera di tenuta, un esperimento riuscito può durare fino a 6 ore. È interessante notare che ci sono alcune restrizioni rispetto al studiando a lungo vanno interazioni spaziali tra coni e cellule orizzontali, come affettare separa inevitabilmente connessioni laterali nelle reti della retina. Tuttavia, aumentando lo spessore delle fette retina a 300 micron migliora questo problema 22. L&#39;uso di sezioni retiniche verticali evita la scansione di segmenti esterni cono fotosensibile dal laser di eccitazione e, pertanto, impedisce sostanzialmente opsin sbianca (per un&#39;ampia discussione, vedi 10,21). Tuttavia, le registrate Ca 2+ segnali non dipendono solo stimoli luminosi, ma anche ottenere colpite da un componente di illuminazione di fondo generato dal laser a scansione di eccitazione. Infatti, l&#39;efficace retroilluminazione in tali esperimenti di imaging a due fotoni è una combinazione di luce laser diffusa, luce fluorescente emessa dal ce registratalls, e qualsiasi componente di fondo stimolo LED. Pertanto, coni dovrebbero poter adattare per almeno 20 - 30 s a scansione laser (con la componente dello stimolo luce di sfondo accesa) prima della registrazione. Vantaggi e applicazioni: Mentre alcune applicazioni per questo cono Ca 2+ protocollo -Imaging sono state descritte in precedenza 10,21,22, altre applicazioni possono essere immaginato: Studi farmacologici in combinazione con cono Ca 2+ immagini possono convalidare Ca 2+ segnalazione percorsi in coni e potrebbe essere usato per testare l&#39;efficacia e la potenza di farmaci destinati diversi giocatori Ca 2+ -Segnalazione 10. Tuttavia, un&#39;applicazione chiave potrebbe essere quella di studiare le malattie che colpiscono la funzione cono. Molti modelli murini di degenerazione retinica che mimano malattie umane sono disponibili. Per esempio, la perdita di cono fotorecettore 1 (CPFL 1) mouse è un cono primario modello di degenerazione sofferenzada una mutazione Pde6c 29. Viceversa, l&#39;asta degenerazione 1 (rd 1) topo affetto da una mutazione Pde6b. Anche se questo fa sì che l&#39;asta principale fotorecettori degenerazione 30, una volta rd 1 sconfitta asta è completato, secondarie set cono degenerazione in 1. Incroci questi animali con la HR2.1: Linea TN-XL permetterà lo studio e il confronto Ca 2+ dinamica sia degenerazione cono primaria e secondaria e rischia di fornire preziose informazioni sul ruolo di Ca 2+ durante la morte delle cellule cono. Inoltre, farmacologicamente indotto cone degenerazione - ad esempio con gli inibitori selettivi della PDE6 - può servire a identificare i meccanismi a valle di cono degenerazione 10,29,31. In sintesi, il protocollo qui descritto permette di misurare Ca 2+ in compartimenti subcellulari di fotorecettori coni mouse e presenta grandi opportunità per scoprire cono fisiologia in una vasta gammadelle condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per lo screening di agenti farmacologici volti a interferire con il cono di Ca 2+ -Segnalazione e quindi aiutare a stabilire nuove terapie per le malattie del cono.

Vision inizia con l&#39;attivazione-indotta luce della cascata fototrasduzione nei fotorecettori retinici. Bastoncelli consentono la visione a bassi livelli di luce, mentre fotorecettori cono mediano a colori e ad alta risoluzione visione diurna. Molti geni specifici fotorecettori sono suscettibili di mutazioni che portano alla degenerazione di queste cellule. Un certo numero di marcatori molecolari associati alla perdita dei fotorecettori sono stati identificati 1, ma finora i meccanismi molecolari dettagliate e la sequenza degli eventi rimangono poco chiari. Altered Ca 2+ omeostasi stato ipotizzato essere un trigger di morte cellulare dei fotorecettori, ipotesi sostenuta dalla up-regolazione dell&#39;attività di Ca 2+ -dipendente proteasi calpaina tipo durante il processo di degenerazione 2,3. Tuttavia, ad oggi, questa ipotesi non è sostenuta da misure fisiologiche di Ca 2+. Incongruenze in diversi studi sugli effetti di Ca 2+ bloccanti dei canali in remalattie fonodale sfidato ulteriormente il coinvolgimento di Ca 2+ nella morte cellulare 4-6, chiedendo metodi per valutare direttamente Ca 2+ nei fotorecettori cono mammiferi. In precedenza, la maggior parte registrazione elettrica e studi di imaging Ca 2+ sono stati condotti in modelli di anfibi e rettili a causa del più facile accesso ai coni 7-9. Tuttavia, mammiferi fotorecettori fisiologia può essere diversa da quella dei non mammiferi 10 e in particolare, nel contesto di degenerazione retinica ereditaria umana, una migliore comprensione della fisiologia dei mammiferi fotorecettore è una chiave per lo sviluppo di terapie innovative. Molti modelli murini che mimano malattie retiniche umane sono disponibili, ma poco si sa su Ca 2+ dinamiche nei coni di topo 11. Tecniche elettrici non sono adatti per le registrazioni ad alto rendimento da coni, in particolare, non nei topi, dove aste (~ 97%) superano significativamente coni (~ 3%) 12 </sup&gt;. Inoltre, tecniche elettrofisiologiche sensibili come whole-cell patch-clamp disturbano l&#39;ambiente intracellulare e di fornire i dati relativi Ca 2+ correnti, ma non in assoluto intracellulare Ca 2 + concentrazioni. Quindi, nonostante la risoluzione temporale inferiore, l&#39;imaging è il metodo di scelta nel trattamento delle problematiche circa cono Ca 2+ dinamiche. La questione chiave con imaging è come etichettare in modo selettivo i coni con un Ca 2+ colorante indicatore fluorescente. Compartimentazione corretta e la specificità delle cellule è difficile da raggiungere entro il &quot;bulk-loading&quot; sintetico Ca 2+ indicatore coloranti nel tessuto. Di conseguenza, coni etichettati, aste 13,14, e le cellule gliali Müller non possono essere distinti in modo affidabile. Inoltre, coloranti sintetici tendono a fuoriuscire delle cellule, impedendo registrazioni prolungato in condizioni costanti. Inoltre, il caricamento sintetiche Ca 2+ indicatori nella loro forma AM-estere è problematico, in quanto richiede detergents (ad esempio, DMSO) e genera formaldeide 15. Per assoluti Ca 2+ misurazioni, indicatori raziometrico sono obbligatori. Tuttavia, il miglior indicatore raziometrica sintetico disponibile Fura-2 richiede luce di eccitazione nell&#39;intervallo da 700 a 760 nm (per eccitazione a due fotoni), che, a seconda della sua intensità, può di per sé stimolare i coni, e quindi impediscono studi cono di Ca 2+ dinamica in condizioni di illuminazione fisiologiche. A differenza di coloranti sintetici, geneticamente codificati Ca 2+ indicatori possono essere espressi in un tipo selettivo cellule maniera. Essi non fuoriuscire di cellule, e quindi, se si evita candeggio, misurazioni raziometrico prolungate e affidabili sono possibili. Tipo selettivo cellulare espressione di Ca 2+ biosensori, in combinazione con la microscopia a due fotoni, rappresenta un potente strumento per valutare e studiare subcellulare Ca 2+ in condizioni in gran parte fisiologiche 13,16,17 </sup&gt;. Qui, descriviamo un protocollo per studiare la luce stimolo-evocato cono di Ca 2+ dinamiche in un transgenico Ca 2+ topo biosensore linea (HR2.1: TN-XL), che esprime la base FRET-Ca 2+ biosensore TN-XL 18 selettivamente in coni, sotto l&#39;umano opsina rosso promotore HR2.1 19. Per accedere ai morsetti del cono, una preparazione fetta ex-vivo 20 è stato impiegato. Il protocollo è stato già utilizzato con successo in tre studi sulla funzione cono in topi sani 10,21,22. Inoltre, il protocollo consente di studiare cono Ca 2 + Segnalazione di condizioni genetiche specifiche, ad esempio, incrociando modelli murini di degenerazione retinica ereditaria con HR2.1: topi TN-XL.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1018817</td>
			<td><a href="http://www.dowcorning.com/">http://www.dowcorning.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td></td>
			<td>24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td></td>
			<td>76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades for tissue chopper</td>
			<td>MARTOR KG</td>
			<td>ARGENTAX No. 1044</td>
			<td>0.25 mm; http://www.martor.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper</td>
			<td>Custom-build</td>
			<td></td>
			<td>Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose filter membrane gridded</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AABG01300</td>
			<td>Filter type: 0.8 &#181;m; http://www.emdmillipore.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane CP</td>
			<td>CP pharma</td>
			<td>AP/DRUGS/220/96</td>
			<td><a href="http://www.cp-pharma.de/">http://www.cp-pharma.de</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/green LED-based full-field stimulator</td>
			<td>Custom-build</td>
			<td></td>
			<td>for details, see10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open source microprocessor board</td>
			<td>Arduino</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.arduino.cc/">http://www.arduino.cc</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software CfNT</td>
			<td>Custom-written</td>
			<td></td>
			<td>developed by Michael M&#252;ller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgorPro</td>
			<td>Wavemetrics</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.wavemetrics.com/">http://www.wavemetrics.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC3-4 System focal perfusion system</td>
			<td>ALA Scientific Instrument</td>
			<td></td>
			<td>with 100 &#956;m-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)</td>
			<td>Newport Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.spectra-physics.com/">http://www.spectra-physics.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Movable objective microscope (MOM), 
			Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html">http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLUMPlanFL 20x/0.95w objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.olympusamerica.com/">http://www.olympusamerica.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer 100 series</td>
			<td>Surgivet</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.surgivet.com/">http://www.surgivet.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin, Calcium salt</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>I24222</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/">https://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>101191250</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ95</td>
			<td>leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.leica-microsystems.com/">http://www.leica-microsystems.com/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina

Fotorecettori cono della retina (coni) servono visione diurna e sono alla base della discriminazione dei colori. Le tariffe sono soggette alla degenerazione, spesso porta alla cecità in molte malattie della retina. Il calcio (Ca 2+), una chiave secondo messaggero nella segnalazione fotorecettori e il metabolismo, è stato proposto di essere indirettamente collegata con fotorecettori degenerazione in vari modelli animali. Sistematicamente studiare questi aspetti del cono fisiologia e fisiopatologia è stata ostacolata dalla difficoltà di registrazione elettricamente da queste piccole cellule, in particolare nel topo in cui la retina è dominato da bastoncelli. Per aggirare questo problema, abbiamo stabilito un Ca 2 + protocollo di imaging a due fotoni con una linea di topo transgenico che esprime il geneticamente codificato Ca 2+ biosensore TN-XL esclusivamente in coni e possono essere incrociati con modelli murini per fotorecettori degenerazione. Il protocollo qui descritto prevede la preparazione di sezioni verticali (R20; fette &quot;) di retine di topi e imaging ottico dei cambiamenti di stimolo-evocati leggeri nel cono Ca 2+ livello. Il protocollo consente inoltre &quot;misurare nel fetta&quot; di assoluto Ca 2 + concentrazioni; come le registrazioni possono essere seguiti mediante calibrazione. Questo protocollo consente studi in proprietà cono funzionali e dovrebbe contribuire alla comprensione del cono Ca 2+ segnalazione nonché il potenziale coinvolgimento di Ca 2+ in fotorecettori morte e degenerazione retinica.

Combinando fette verticali (Figura 1) preparato da HR2.1: TN-XL retina di topo con due fotoni di imaging (figura 2), siamo stati in grado di effettuare misurazioni raziometriche di luce Ca 2+ segnali di stimolo-evocati in terminali degli assoni cono fotorecettori . Questo approccio rappresenta un significativo miglioramento per l&#39;accesso e la visualizzazione di coni del mouse rispetto ai metodi di imaging ottico preesistenti con sintetici di Ca 2+ indicatori. Per esempio, l&#39;espressione specifica cono del Ca raziometrico geneticamente codificato 2+ biosensore TN-XL notevolmente facilitato l&#39;individuazione dei terminali cono assoni (vedi ROI in Figura 3A). Pertanto, il nostro protocollo elimina il rischio di segnali di registrazione di origine poco chiara, come ad esempio segnali &quot;misti&quot; con il contributo di entrambi i terminali di cono e rod assoni. Il nostro approccio permette risolvere risposte singola prova a livello della indiviterminali di doppio cono assoni. Light-evocato estrusione di Ca 2+ dal terminale cono è caratterizzato da un aumento e una diminuzione del donatore e accettore di fluorescenza, rispettivamente (Figura 3B). Diminuzione rapporto di fluorescenza (R) corrisponde alla estrusione di Ca 2+ dal terminale cono (Figura 3C), causata dalla iperpolarizzazione indotta dalla luce del cono e successiva chiusura di Ca 2+ canali voltaggio-dipendenti. Poiché diversi terminali cono assoni possono essere monitorati contemporaneamente (figura 3A), l&#39;acquisizione dei dati è molto efficiente e centinaia di cono Ca 2+ risposte possono essere raccolte in un singolo esperimento. Valutando queste risposte quantitativamente (figura 4), ​​cono Ca 2 + segnali possono essere confrontati e valutati in una serie di condizioni (vedi la discussione). Spesso è sufficiente utilizzare il rapporto tra FRET-accettore (citrino) e -donor (ECFP) fluorescenza(F A / F D; per i dettagli, vedi 3.4) come una misura relativa della intracellulare Ca 2 + livello. Tuttavia, se necessario, il rapporto può essere calibrato per ottenere assoluti intracellulare Ca 2+ concentrazioni ([Ca 2+]) (Figura 5). Al retroilluminazione utilizzata in questo protocollo (per i dettagli, vedere la 10 e la figura 3 leggenda), calibrazione ha prodotto una stima di assoluto riposo [Ca 2+] nel &quot;wild-type&quot; HR2.1: TN-XL terminali cono del mouse su 243 ± 159 nM (media ± SD), che è entro il range riportato per topi in letteratura 11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig1.jpg" /> Figura 1. Preparazione di fette retina verticali. (A) isolato e appiattito retina preparato per affettare. (B) pezzo rettangolare di retina (see riquadro rosso in A) montato su membrana di carta da filtro (grigio scuro) dopo il taglio. (C) Vista dall&#39;alto della fetta della retina montato membrana fissato su un vetrino di vetro con grasso. (D) Schema di una parte di una fetta della retina (vedi riquadro rosso in C). Fotorecettori cono sono indicate in verde. V, ventrale; D, dorsale; N, nasale; T, temporali; OS, segmento esterno; ONL, strato nucleare esterno; OPL strato plessiforme esterno; INL, strato nucleare interno; IPL, strato plessiforme interno; GCL, strato di cellule gangliari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig2.jpg" /> Figura 2. due fotoni di imaging di fette della retina: Illustrazione della configurazione di registrazione Top:. L&#39;acqua-immersion lente dell&#39;obiettivo focalizzando l&#39;esseream del laser a scansione (freccia rossa verso il basso) nella retina, e raccogliendo la fluorescenza emessa (frecce verso l&#39;alto). L&#39;obiettivo raccoglie anche trasmessa luce infrarossa da un LED di illuminazione montato sotto il condensatore quando l&#39;imaging la fetta con una camera CCD Center.. Fetta della retina montato nella camera di registrazione e perfusi con soluzione extracellulare basso: condensatore ottico focalizzare la luce dei LED di stimolazione (e il LED a infrarossi per l&#39;imaging CCD) attraverso il fondo trasparente della camera di registrazione nel tessuto retinico. IR LED, infrarossi diodi emettitori di luce; CCD, dispositivo ad accoppiamento di carica; BP, passa-banda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig3.jpg" /> Figura 3. Light-EVOKEd Ca 2+ risposte in terminali degli assoni dei fotorecettori cono del mouse. (A) a sinistra: Recordings focalizzata sui terminali sinaptici (box rosso) di fotorecettori cono (verde) in fettine di retina. A destra: Esempio per una regione registrato con 7 terminali individuali. La fluorescenza è stato registrato utilizzando due canali:. Uno per il citrino FRET-accettore (top; 535 BP 50) e una per il FRET-donatore ECFP (in basso; 480 BP 32) (B) cambiamenti luminosi evocati in citrino (F A) e ECFP (F D) fluorescenza registrata in un unico ROI. (C) Ca 2+ risposte (come rapporto F A / F D) di un terminale cono ad una serie di 1 sec brillanti lampi di luce in intervalli di 5 sec. ROI, regione di interesse; BP, filtro passa-banda; F, intensità di fluorescenza; au, unità arbitrarie; FRET, Förster trasferimento di energia di risonanza; ECFP, migliorato proteina fluorescente ciano. Intensità dello stimolo (come ptasso hoto-isomerizzazione in 10 3 · P · s -1 per cono):. 13.0 e 12.8 per M- e S-opsine, rispettivamente, aggiungendo su un livello di fondo (= LED spenti, scansione laser eccitazione) di ~ 10 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig4.jpg" /> Figura 4. Esempi analisi quantitativa del cono di luce evocata Ca 2+ risposte (A) Luce-evocato Ca 2+ risposte (come ΔR) da un unico terminale cono (prove singole: tracce grigie, n = 16; media:. Traccia nera ) (b) i parametri stabiliti per la media di Ca 2+ risposta:. riposo Ca 2+ livello (base R), che rappresenta la linea di base prima di stimolazione luminosa, dimensioni della risposta come area-under-the-curva (R A) e ampiezza di picco (R amp), cinetica della risposta insorgenza (t luogo, intervallo di tempo dal 20% al 80% di R amp) e offset (t decadimento, l&#39;intervallo di tempo da 80% al 20% di R amp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig5.jpg" /> Figura 5. Stima assoluta concentrazione di Ca 2+. Riposo Ca 2+ concentrazione ([Ca 2+], come rapporto F A / F D) registrato nel terminali degli assoni 8 cono in un mouse TN-XL (cerchi, con media ± DS) per diverse soluzioni extracellulari: due volte in mezzo extracellulare normale (Ctrl 1 e 2), quindi con il minimo (&quot;zero&quot;) [Ca 2+] (EGTA 10 mM) und con alta [Ca 2+] (2,5 mm), le ultime due condizioni in presenza di 5 micron ionomicina per equilibrare extracellulare e intracellulare di Ca 2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Descriviamo un protocollo per il monitoraggio Ca 2+ dinamiche nei terminali degli assoni dei fotorecettori cono con un ex-vivo la preparazione fetta della retina del mouse. Questo protocollo permette studi completi di cono Ca 2 + Segnalazione di un importante sistema modello mammiferi, il mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dinamica a cono fotorecettore Axon Terminali della retina di topo

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

imaging-ca2-dynamics-cone-photoreceptor-axon-terminals-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

10.5K Views.  University of Tübingen.  Descriviamo un protocollo per il monitoraggio Ca 2+ dinamiche nei terminali degli assoni dei fotorecettori cono con un ex-vivo la preparazione fetta della retina del mouse. Questo protocollo permette studi completi di cono Ca 2 + Segnalazione di un importante sistema modello mammiferi, il mouse. 

Video: Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-clamp Misure di capacità e Ca 2 + Imaging terminazioni nervose della retina singola in Fette

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Ricerca

Neuroscienze

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light whereas cones operate continuously under rapidly changing bright light conditions. Absorption of light by rod- and cone-specific visual pigments in the outer segments of photoreceptors triggers a phototransduction cascade that eventually leads to closure of cyclic nucleotide-gated channels on the plasma membrane and cell hyperpolarization. This light-induced change in membrane current and potential can be registered as a photoresponse, by either classical suction electrode recording technique1,2 or by transretinal electroretinogram recordings (ERG) from isolated retinas with pharmacologically blocked postsynaptic response components3-5. The latter method allows drug-accessible long-lasting recordings from mouse photoreceptors and is particularly useful for obtaining stable photoresponses from the scarce and fragile mouse cones. In the case of cones, such experiments can be performed both in dark-adapted conditions and following intense illumination that bleaches essentially all visual pigment, to monitor the process of cone photosensitivity recovery during dark adaptation6,7. In this video, we will show how to perform rod- and M/L-cone-driven transretinal recordings from dark-adapted mouse retina. Rod recordings will be carried out using retina of wild type (C57Bl/6) mice. For simplicity, cone recordings will be obtained from genetically modified rod transducin &alpha;-subunit knockout (T&alpha;-/-) mice which lack rod signaling8.

We describe a relatively simple method of transretinal electroretinogram (ERG) recordings for obtaining rod and cone photoresponses from intact mouse retina. This approach takes advantage of the block of synaptic transmission from photoreceptors to isolate their light responses and record them using field electrodes placed across the isolated flat-mounted retina.

Transretinal Recordings ERG di retina di topo: Rod e fotorisposte Cone

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

Uso di pHluorin per valutare la dinamica dei recettori di guida axon nella coltura cellulare e nell'embrione del pulcino

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Assessment of Vascular rigenerazione nel SNC Utilizzo del Retina mouse

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

Visualizzazione del endosome Dynamics in Vivere terminazioni nervose con quattro-dimensionale imaging di fluorescenza

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome sezionamento mouse Retina preparare Culture fotorecettori

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Whole-mount Imaging di embrione di topo Sensory Axon Proiezioni

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

In Situ Ca 2+ Imaging del sistema nervoso enterico

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Due fotoni Imaging di Cellular Dynamics nel midollo spinale del mouse

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...