Questa ricerca è stata sostenuta da R00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) e fondi di avvio UT Southwestern (JPM).

Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo protocolli approvati dal Sud Institutional Animal Care ed uso commissione UT, e sono stati scelti in modo da minimizzare lo stress, il disagio e il dolore provato dagli animali sperimentali. 1. Dissezione Camera Una camera di dissezione costume e piccolo, sottile tavola di plastica sono necessari per ottenere i migliori risultati (Figura 1). Costruire o ottenere tale camera in anticipo di tentare questo protocollo. 2. Dissezione Solutions <ol><li> Preparare 1 L di liquido cerebrospinale artificiale standard (aCSF) per l&#39;uso in Piazza di 3,22-5,4. Aggiungi NaCl 125 mM, KCl 2,5 mm, CaCl 2 2 mM, MgCl2 1 mM, NaHCO 3 a 25 mm, NaH 2 PO 4 da 1,25 mm, mio-inositolo 3 mM, piruvato di sodio 2 mM, ascorbato di sodio 0,4 mM e glucosio 25 mm a 1 L di acqua apirogena. </li><li> Preparare la aCSF dissezione iniziale (200 ml) perutilizzare nei passaggi 3,3-3,22. Prendere 200 ml di aCSF standard ed aumentare la concentrazione MgCl 2 da 9 mM aggiungendo 0,366 g di MgCl 2 esaidrato. </li><li> Preparare soluzione standard di Ringer per portare stimoli alla VNO attraverso la cannula per l&#39;uso in fasi 4,11-5,4 contenente NaCl 115 mM, KCl 5 mM, CaCl 2, 2 mM, MgCl 2, 2 mM, NaHCO 3 25 mM, HEPES 10 mM, glucosio 10 mm. </li><li> Bubble il 0,8 L di aCSF norma e 0,5 L di Ringer con 95% O 2, 5% CO 2 gas in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per un minimo di 15 min fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Bubble 200 ml di aCSF dissezione iniziale con 95% O 2, 5% CO 2 gas in ghiaccio per 15-20 minuti fino a raggiungere 4 ° C. </li></ol> 3. Dissezione primaria <ol><li> Preparare l&#39;area dissezione. Mettere tre piatti 35 millimetri Petri, ossigenato aCSF, forbici decapitazione, curve dissezione forbici, diritto dissezione forbici, pinze Adson, un cuoio capelluto # 11el lama e manico e una lama di rasoio sul ghiaccio. </li><li> Dopo ossigenato aCSF è stata raffreddata a 4 ° C, profondamente anestetizzare l&#39;animale in una camera di essiccazione con 2-5 ml Isothesia (99,9% isofluorano). Eseguire i test pizzico di coda e piedi per garantire l&#39;animale è profondamente anestetizzato. </li><li> Una volta che l&#39;anestesia profonda è confermata, decapitare l&#39;animale e collocare immediatamente la testa in una capsula di Petri riempita con la dissezione aCSF refrigerata. NOTA: immergere il tessuto nella dissezione refrigerati aCSF per tenerlo fresco durante tutta la procedura quando non in uso. </li><li> Rimuovere l&#39;aspetto inferiore (ventrale faringe, mascella inferiore, e la lingua), con un paio di forbici curve. </li><li> Utilizzando Adson forcipe deglove (buccia), la pelle superficiale e inserzioni muscolari del cranio. Sbucciare il cuoio capelluto da caudale al rostrale fino a quando l&#39;unico sito di attacco è sopra i denti anteriori. Tagliare il tessuto al punto di attacco con un paio di forbici curve. Rimuovere gli occhi afferrandolo con una pinza e tirarlo fuori dalla preparazione. Norecchio termine della procedura degloving, evitare una forza eccessiva sulla cartilagine nasale delicato in base alle pinze Adson agli allegati muscolari liberi dalle ossa mascellari superiori. NOTA: Staccare il cuoio capelluto dalla parte caudale del cranio con le forbici diritte. </li><li> Con le forbici dritte, tagliare lungo la linea mediana del cranio da caudale a rostrale fino a quando le punte delle forbici sono pochi mm nelle ossa frontali (appena prima il seno rhinal). </li><li> Rimuovere il parietale e ossa frontali del cranio con pinze Adson. NOTA: Pezzi di osso frontale spesso rimangono attaccati alle ossa nasali caudali al seno rhinal. Rimuovere questi pezzi con cura adottate non a contattare i bulbi olfattivi. </li><li> Utilizzare il bisturi per fare un taglio coronale attraverso il lobo frontale 2 millimetri caudale ai seni e poi togliere la caudale cervello al taglio. Assicurarsi che la punta dei contatti bisturi del contorno osseo del cranio ventrale di recidere completamente il tessuto posteriore. NOTA: Questo consenterimozione della maggior parte del cervello senza mettere sollecitazioni meccaniche sui tratti olfattivi laterali o bulbi olfattivi. </li><li> Rimuovere gli aspetti caudali esposte del cranio ventrale con le forbici diritte. Lasciare i seni e le restanti tessuto nervoso. </li><li> Rimuovere zigomatica e muscoli facciali sul lato anatomico destro del cranio con le forbici diritte </li><li> Girare il muso sopra (lato ventrale) per esporre il tetto della bocca. </li><li> Tagliare e rimuovere il palato immediatamente caudale agli incisivi. Fare inserendo la punta della lama bisturi sotto il palato parallelo al tetto della bocca e quindi spostare la lama verso gli incisivi. </li><li> Afferrare l&#39;(rostrale) bordo liberato del palato con una pinza Adson e rimuovere tirando caudale. </li><li> Sul lato sinistro anatomica del cranio, utilizzare il bisturi per estendere il forame palatino caudalmente, partendo dalle piccole forame vicino molari. Conseguire questo inserendo la punta del bisturi blade nel vuoto in prossimità dei molari e rotazione del polso. NOTA: Utilizzare estrema cautela per usare solo la punta della lama - un taglio profondo può danneggiare il tessuto del setto. </li><li> Utilizzando la punta della lama del bisturi, tagliare dal forame palatino attraverso gli incisivi, a partire rostrale alla anatomica sinistra, organo vomeronasale. Utilizzare più tagli di punteggio. Non danneggiare il tessuto del setto e nervi vomeronasali inserendo la lama troppo profondo. </li><li> Ruotare il tessuto in modo che il cranio dorsale è rivolto verso l&#39;alto e poi orientare la lama di rasoio verticale (parallelo alla linea mediana) all&#39;estremità caudale della preparazione. </li><li> Sul bordo ventrale del tessuto, toccare il tagliente della lama di rasoio immediatamente alla sinistra della linea mediana. Agitare delicatamente la lama e muoversi lungo il forame palatino sinistra (tagliate regione introdotto nel passaggio 3.14). </li><li> Al bordo dorsale del tessuto, posizionare il tagliente del rasoio immediatamente alla sinistra della linea mediana (meno di 1 mm). </li><li> Conservazionela lama parallelamente alla linea mediana, Rock il lama lentamente con pressione verso la parte anteriore del tessuto. Notare resistenza a lamina cribrosa. Interrompere immediatamente dopo la rottura attraverso questa resistenza. NOTA: A questo punto, l&#39;emisfero destro è allentato dalla emisfero sinistro. Il collegamento Rimane solo tra gli emisferi lungo la dorsale muso anteriore alla piastra cribrosa. </li><li> Separare gli emisferi da loro afferrando vicino ai lati caudale con le dita guantate e delicatamente ruotare lateralmente e anteriormente. NOTA: Questo passaggio è una fonte di variabilità sperimentale, soprattutto in topi con musi deviate o fragili (ad esempio, topi anziani). Inoltre, durante il tentativo di ruotare gli emisferi distanti, se forte resistenza si incontra segnare il muso dorsale (anteriore alla piastra cribrosa) per indebolire i tessuti connettivi. Nel farlo, fare estrema attenzione a non inserire il bisturi in profondità, che possono danneggiare il setto tissue e nervi vomeronasale. </li><li> Applicare una piccola quantità (50-100 ml) di colla tessuto per la tavola e inserire delicatamente il bordo laterale dell&#39;emisfero destro sulla colla utilizzando le pinze Adson. Rimuovere l&#39;umidità in eccesso dal lato laterale della preparazione con un tovagliolo di carta per evitare premature polimerizzazione della colla e l&#39;adesione allentato per la tavola. NOTA: Applicare alcune gocce di aCSF dissezione refrigerata sul campione di accelerare la polimerizzazione colla dopo tessuto viene posizionato sulla colla. Questo assicura che il tessuto rimane saldamente in attesa alla plancia. </li><li> Mettere una piccola quantità (diametro 3-5 mm, 2 mm di profondità) di grasso per vuoto nel centro della camera di dissezione secondaria e posizionare il lato della doga di fronte al tessuto saldamente contro il grasso. Riempire subito la camera di dissezione con refrigerati dissezione aCSF, il trasferimento alla zona dissezione fine e cominciare perfusione con lo standard ossigenato aCSF. Orientare la tavola in modo che il bulbo olfattivo è direttamente nelflusso di appena ossigenato aCSF standard. </li></ol> 4. Dissezione secondario <ol><li> Rimuovere eventuali controlaterale (a sinistra) bulbo olfattivo visibile o tessuto corticale dalla preparazione utilizzando una pinza sottile. Pizzicare insieme le belle pinze (formando un semi smussato), e poi metterlo alla dorsale e caudale porzione del tessuto vicino alla linea mediana. Eseguire delicatamente la pinza pizzicato lungo la linea mediana, peeling il tessuto lontano dal emisfero destro lentamente in moto anteriore. Rimuovere tutto il tessuto controlaterale, compreso il tessuto bulbo olfattivo controlaterale. Fate molta attenzione a non colpire attraverso il tessuto, che può causare danni al AOB o vomeronasale nervo. </li><li> Osservare la dura madre bianca lungo la superficie dorsale / mediale del bulbo olfattivo. Strappare questa dura madre lungo il bordo dorsale / caudale del bulbo olfattivo afferrandolo in corrispondenza della porzione più bianco della dura con due coppie di pinza sottile e tirare via da quel punto. La durata è strettamenteavvolto intorno bulbi olfattivi, e si può facilmente tagliare attraverso il tessuto mentre viene rimosso. Evitare danni alla superficie mediale del bulbo olfattivo e la AOB stessa. NOTA: Se la dura resiste strappare facilmente, a questo punto, introdurre un piccolo taglio con punta fine primavera forbici dissezione per facilitare la separazione. </li><li> Lentamente e con attenzione staccarsi la corteccia frontale con una pinza sottile senza danneggiare i bulbi olfattivi sottostanti. Osservare una collezione di vasi sanguigni appaiono come una rete semi-trasparente immediatamente caudale al AOB. Rimuovi questa rete con una pinza sottile per facilitare la penetrazione elettrodo in esperimenti di elettrofisiologia. Afferrare la rete con una pinza come si separa dalla AOB durante la corteccia retrazione frontale e rimuoverlo tirando caudalmente e medialmente, facendo attenzione a non toccare la AOB. Una volta che la corteccia frontale è stato separato dai bulbi olfattivi, rimuoverla tagliando con una pinza ventrali e posteriori alla AOB. NOTA: Prendere extreme attenzione con la rimozione rete, perché se è fatto troppo grosso modo il livello glomerulare può danneggiarsi. </li><li> Nella cavità nasale controlaterale esposto, rimuovere ogni residuo di tessuto del setto controlaterale (foglio di velina gialla contenente i vasi sanguigni) utilizzando le belle pinze. Afferrare il tessuto in corrispondenza della regione caudale / dorsale (vicino all&#39;osso del setto) e poi tirare / sollevare il tessuto verso il lato anteriore. NOTA: Il tessuto del setto controlaterale può essere inavvertitamente rimosso durante la fase di emisezione (Step 3.20). In tal caso, osservare un bianco, avascolare cartilagine settale e la leggermente trasparente, vascolarizzato setto osseo. Se questo è il caso, Passaggio 4.4 può essere saltata. </li><li> Rimuovere con attenzione il controlaterale VNO eseguendo un unico punto delle belle pinze tra la cartilagine del setto e la &quot;ala&quot; VNO (un sottile pezzo di tessuto osseo che corre lungo il bordo dorsale di entrambi vnos. <ol><li> Dopo il distacco dell&#39;ala dalla cartilagine, spostare la punta della pinza ventrenel VNO controlaterale nei pressi della linea mediana. Ripetere questo passaggio in diverse località lungo l&#39;asse rostrale / caudale del controlaterale VNO per allentarla, le consente di essere rimosso da afferrare con una pinza e di sollevamento di distanza. </li></ol></li><li> Preparare per rimuovere la cartilagine del setto effettuando un taglio sul bordo ventrale / caudale (dove si restringe a un bianco avascolare striscia che corre lungo il bordo ventrale dell&#39;osso del setto) con una pinza sottile. </li><li> Togliere la cartilagine del setto pizzicando insieme i pinza sottile per fare un semi punto smussato. Identificare il taglio fatto nella Fase 4.6, inserire le pinze pizzicato dietro (laterale) a quel taglio, e poi sollevare lentamente la cartilagine lontano dal tessuto settale e procedendo rostralmente. NOTA: Non distruggere il tessuto del setto sottostante. Poiché la cartilagine viene sollevato, osservare il foglio sottostante tratto di tessuto del setto causa di aderenze sciolti alla cartilagine. Un movimento periodico, dolce e stabile delle pinza sottile pizzicato lungo questo sito di perdere undhesion può facilitare notevolmente efficace separazione delle due strutture. </li><li> Usare un paio di # 3 pinze con una punta piegata per rimuovere l&#39;osso del setto. Avvicinarsi l&#39;osso del setto con un angolo quasi parallela al piano dell&#39;osso settale. Inserire il dente curvo tra il tessuto del setto e setto osseo. Afferrare l&#39;osso con la pinza e delicatamente spostare l&#39;osso e indietro fino a quando si incrina vicino alla lamina cribrosa. NOTA: In alcuni casi, l&#39;osso settale resisterà rottura in prossimità della piastra cribrosa. In questo caso, utilizzare una pinza sottile a segnare delicatamente l&#39;osso del setto lungo l&#39;asse / ventrale dorsale appena anteriormente alla piastra cribrosa, quindi ripetere il punto 4.8. </li><li> Togliere la cartilagine bianca appena rostrale alla VNO pizzicando con un paio di pinze sottili all&#39;ingresso e tirando rostralmente con un altro paio di pinze sottili. </li><li> Fissare la cannula poliimmide ad un dispositivo perfusione veloce e avviare il flusso di soluzione di Ringer (0,1-0,3 ml / min) attraverso la cannula poliimmide.NOTA: la portata di misura con una, flussometro in linea piccolo volume. L&#39;uso del dispositivo di commutazione stimolo pneumatico controllato da computer riduce variazioni di portata durante la stimolazione. Confronta risposte neurali per testare stimoli con le risposte ad uno stimolo finto (controllare la soluzione di Ringer) per garantire risposte sono specifici stimoli. </li><li> Orientare la cannula parallelo all&#39;ingresso VNO. Quando la cannula è soddisfacente parallelo all&#39;ingresso VNO, osservare come la pressione di uscita fa sì che il VNO a &quot;gonfiare&quot;, che consenta l&#39;evacuazione del vaso sanguigno. Inserire immediatamente la cannula nel VNO, mantenendo l&#39;angolo della costante cannula in modo che rimanga parallelo all&#39;apertura VNO. NOTA: Può essere utile per tenere la cannula con un paio di pinze fini contro la plancia plastica e utilizzare un altro paio di pinze sottili angolare l&#39;estremità della cannula leggermente verso l&#39;alto. Se si mette inavvertitamente la cannula dietro la VNO, il deflusso può anche causare il vaso sanguigno VNOevacuare, determinando l&#39;impressione di una corretta incannulamento stata eseguita. Posizione corretta può essere confermata incorporando un colorante in soluzione di Ringer l&#39;. Quando la cannula viene posizionato correttamente, il colorante deve unica uscita tramite l&#39;ingresso VNO. Inoltre, si può confermare il corretto posizionamento facendo in modo che la cannula è facilmente visibile attraverso l&#39;aspetto mediale semi-trasparente del VNO. </li><li> Spostare la plancia in plastica lentamente fino a quando la AOB è nel flusso diretto della norma aCSF, facendo attenzione a non spostare la cannula dal VNO. La dissezione è completo e la valutazione della funzione fisiologica può iniziare immediatamente. Fase 5 descrive brevemente un approccio per fare una tale valutazione. </li></ol> 5. Valutazione <ol><li> Penetrare la superficie della AOB con un 2-4 mW microelettrodo vetro borosilicato collegato ad un amplificatore extracellulare e oscilloscopio. </li><li> Far avanzare lentamente l&#39;microelettrodo ad una profondità di 100-200 micron dallasuperficie ad una velocità di 50 um / min. Nota: A questa profondità il tessuto, uno incontrerà occasionali azione spontanea potenziali forme d&#39;onda esemplificate dalla taglienti, brevi (~ 1-2 msec) deviazioni della tensione microelettrodo. </li><li> Su incontrare un potenziale forma d&#39;onda d&#39;azione, interrompere avanzare il microelettrodo. </li><li> Osservare e / o registrare il tasso potenziale di azione mentre si cambia la modalità di consegna da stimolo Controllo suoneria di un attivatore noto di attività VSN (ad esempio, la soluzione di Ringer contenente 50 mM KCl). Se la dissezione era successo, un cambiamento di stimolo-dipendente in azione tasso potenziale o potenziale ambito locale può essere osservato. NOTA: Non tutti i neuroni AOB risponderanno ad ogni stimolo con un aumento della frequenza di scarica (tra cui la soluzione di Ringer contenente 50 mM KCl). Una diminuzione stimolo-dipendente della frequenza di scarica indica anche connettività funzionale e una dissezione di successo. Nel caso in cui due o più neuroni che si incontranonon rispondono alla stimolazione VNO, o se non potenziali d&#39;azione si osservano dopo più penetrazioni degli elettrodi, questo suggerisce una dissezione senza successo. Se questo è il caso, un nuovo dissezione può essere avviata nella Fase 3. </li></ol>

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Gli autori non hanno significativi conflitti di interesse da dichiarare.

L&#39;ex vivo di preparazione VNO-AOB descritto in questo protocollo è una valida alternativa alla anestetizzato in vivo 5-7 e acuta fetta vivo 17 esperimenti di funzione AOB. A differenza acuti esperimenti fetta AOB, che espongono anche elementi circuitali per le registrazioni elettrofisiologiche e ottici, questa preparazione conserva tutte le afferenze sensoriali e collegamenti intra-AOB. Anche se questo può anche essere detto di anestetizzato negli approcci vivo, la ...

Elaborazione sensoriale nel cervello dei mammiferi si estende in genere più circuiti neuronali reciprocamente collegate, ciascuna delle quali estrae particolari caratteristiche da input sensoriali. In percorsi sensoriali, elaborazione delle informazioni precoce è di vitale importanza per la percezione e il comportamento normale. Nel sistema olfattivo accessorio (AOS), il bulbo olfattivo accessorio (AOB) è il principale circuito neurale che collega la periferia sensoriale alle strutture a valle che determinano l&#39;equilibrio ormonale 1,2, aggressività 3, e l&#39;eccitazione 4. Come tale, l&#39;elaborazione delle informazioni all&#39;interno di questo circuito è fortemente legata ai cambiamenti nel comportamento animale. Il bulbo olfattivo accessorio è situato in topi e ratti nella parte dorsale / caudale / posteriore del bulbo olfattivo principale (MOB) sotto la fitta, vascolarizzato seno rhinal. L&#39;AOB riceve afferente innervazione da assoni dei neuroni sensoriali vomeronasali periferico (VSNs) che risiedono nell&#39;organo vomeronasale (VNO), un small tubo cieco-ended nel muso anteriore, appena sopra il palato molle. Questi assoni attraversano il delicato strato di tessuto settale al confine mediale dei passaggi nasali. Diversi studi hanno sondato AOB risposte neurali alle fonti di odori AOS (come l&#39;urina del mouse) in vivo utilizzando topi anestetizzati 5-7 o animali liberamente esplorare 8. L&#39;eroico anestetizzati studi in vivo coinvolti (a) tracheotomia per garantire l&#39;anestesia profonda e prevenire l&#39;aspirazione di stimoli liquido 5-7, (b) stimolazione del ganglio cervicale simpatico 6 o incannulamento diretta dell&#39;organo vomeronasale 5,7 per introdurre gli odori volatili e (c) craniotomie con o senza ablazione del lobo frontale per consentire elettrodo avanzamento nella AOB 6. Awake / comportarsi studi 8-10 coinvolti impianto chirurgico di un microdrive. In sintesi, questi paradigmi sperimentali sono potenti, ma estremamente difficile e spesso richiedono l&#39;anestesia. (ex vivo) con un certo successo 11-15. Poiché i collegamenti tra il VNO e AOB rimangono omolaterale, e perché il tessuto linea mediana del setto può essere esposto a superfusate ossigenato in un singolo emisfero, abbiamo cercato di sviluppare un ex vivo approccio unico emisfero isolare queste strutture pur mantenendo la loro connettività funzionale. Recentemente siamo riusciti a raggiungere questo obiettivo 16. Questa preparazione mantiene sia il VNO e AOB vivo e funzionalmente collegato per almeno 4-6 ore perché entrambi gli assoni (lungo la linea mediana del setto tessuti molli) e AOB sono relativamente poco profonde &lt;600 micron caratteristiche che sono accessibili a superfuse ossigenato liquido cerebrospinale artificiale ( aCSF). Questo ex vivo preparazione VNO-AOB permette l&#39;introduzione di stimoli controllati nel VNO tramite una cannula sottile, eaccesso visivo diretto al piccolo AOB per il posizionamento degli elettrodi e / o alla microscopia a fluorescenza diretta. Questo metodo è vantaggioso se la si vuole studiare questi circuiti in assenza di anestetici. Poiché questo approccio recide le connessioni centrifughe, non è adatto a inchieste modulazione centrifuga della funzione AOB. L&#39;ex vivo di preparazione VNO-AOB è difficile da imparare, ma una volta raggiunto produce una piattaforma affidabile su cui indagare l&#39;organizzazione del circuito, elaborazione delle informazioni, e la plasticità neurale in questo circuito sensoriale potente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Straight Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-Curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#3 Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#11 Scalpel Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Carbon Steel Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Chamber</td>
			<td>Custom&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See Fig. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm</td>
			<td>Custom&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning Silicon Vacuum grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Student</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Biologie Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Student</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.0045&#34; Polyimide Tubing</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>823400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45505-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two ton epoxy</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5E157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveBank Pressurized Perfusion Kit</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>09-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveLink digital/manual controller</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo preparations of the intact vomeronasal organ and accessory olfactory bulb

Il sistema olfattivo accessorio mouse (AOS) è un percorso sensoriale specializzato per rilevare gli odori volatili sociali, feromoni, e cairomoni. Il primo circuito neurale nel pathway AOS, chiamato il bulbo olfattivo accessorio (AOB), svolge un ruolo importante nello stabilire comportamenti sesso tipico come l&#39;aggressività territoriale e accoppiamento. Questo piccolo circuito (&lt;1 mm 3) possiede la capacità di distinguere gli stati comportamentali unici, come il sesso, tensione, e lo stress da spunti chemiosensoriali nelle secrezioni ed escrezioni di conspecifici. Mentre l&#39;organizzazione compatta di questo sistema offre opportunità uniche per la registrazione da grandi porzioni del circuito contemporaneamente, ricerca di elaborazione sensoriale nel AOB rimane impegnativo, in gran parte dovuto alla sua posizione svantaggiosa sperimentalmente nel cervello. Qui, dimostriamo una dissezione più stadi che rimuove il AOB intatto all&#39;interno di un singolo emisfero del mouse cranio anteriore, lasciando collegareioni ad entrambi i vomeronasali periferica neuroni sensoriali (VSNs) e circuiti neuronali locali intatti. La procedura espone la superficie AOB dirigere ispezione visiva, facilitando elettrofisiologica e registrazioni ottiche da elementi circuitali AOB in assenza di anestetici. Dopo l&#39;inserimento di una cannula sottile nell&#39;organo vomeronasale (VNO), che ospita le VSNs, si può esporre direttamente la periferia agli odori sociali e feromoni durante la registrazione di attività a valle nella AOB. Questa procedura consente indagini controllate in AOS elaborazione delle informazioni, che possono far luce sui meccanismi che legano l&#39;esposizione feromone a cambiamenti nel comportamento.

Raggiungere il successo con questa preparazione richiede pratica estesa, e ha diverse fasi in cui si può fallire. Ci si dovrebbe aspettare da richiedere molti tentativi prima di raggiungere il successo. È richiesta la camera di dissezione personalizzata per il completamento di questo protocollo, e deve essere ottenuto prima di avviare le fasi successive della dissezione. Il disegno della camera illustrato nella figura 1 è sufficiente per questo scopo, e può essere realizzato in materia plastica rela...

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Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

L&#39;accessorio bulbo olfattivo mouse (AOB) è stato difficile studiare nel contesto della codifica sensoriale. Qui, dimostriamo una dissezione che produce un vivo preparazione franco in cui i neuroni AOB rimangono funzionalmente collegati agli ingressi periferici, facilitando la ricerca di elaborazione delle informazioni dei feromoni mouse e cairomoni.

Ex Vivo preparati della lampadina vomeronasale Organo e accessori olfattivo intatto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

ex-vivo-preparations-intact-vomeronasal-organ-accessory-olfactory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

10.7K Views.  UT Southwestern Medical Center.  L'accessorio bulbo olfattivo mouse (AOB) è stato difficile studiare nel contesto della codifica sensoriale. Qui, dimostriamo una dissezione che produce un vivo preparazione franco in cui i neuroni AOB rimangono funzionalmente collegati agli ingressi periferici, facilitando la ricerca di elaborazione delle informazioni dei feromoni mouse e cairomoni. 

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Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Array registrazioni Multielectrode dell&#39;epitelio Vomeronasal

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Ricerca

Neuroscienze

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-cellula Imaging di cellule sensoriali Precursore in Organo intatto Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Targeting neuroni bulbo olfattivo utilizzo combinato In Vivo Elettroporazione e GAL4-Based Enhancer Trappola Linee Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

Le attività di imaging Odore-Evocati nel bulbo olfattivo del mouse utilizzando riflettanza ottica e segnali autofluorescenza

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Le risposte di imaging neuronale in preparazione Fetta di organo vomeronasale Esprimere un sensore di calcio geneticamente codificato

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Il sistema olfattivo come modello per studiare gli schemi di crescita assonale e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

L&#39;osservazione del movimento ciliare delle cellule epiteliali del plesso coroide<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Registrazione neuronale attività Temperatura indotta attraverso il monitoraggio dei cambiamenti di calcio nel bulbo olfattivo di<em&gt; Laevis Xenopus</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Approfondita fisiologica Analisi di popolazioni di cellule definite nel acuta del tessuto Fette del mouse Vomeronasal Organo

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Quadrupla Immunostaining della lampadina olfattiva per la visualizzazione di codici di identificazione molecolare Axon sensoriale olfattiva

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...