इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (R03DE029270, T32AI089621B), नेशनल साइंस फाउंडेशन (CBET 1511718), शिक्षा विभाग (GAANN-P200A180093), और मैरीलैंड क्रॉस-कैंपस बीज अनुदान विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था।

इस प्रोटोकॉल (पीएन 274) में सी अल्बिकन्स के साथ काम करने के लिए मैरीलैंड विश्वविद्यालय, कॉलेज पार्क, संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (आईबीसी) से अनुमोदन प्राप्त किया गया था। वर्तमान अध्ययन में सी अल्बिकन?...

<ol>
	<li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms:+Development,+regulation,+and+molecular+mechanisms.">Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).</li><li>Arya, N. R., Rafiq, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidiasis.">Candidiasis.</a> StatPearls. , (2021).</li><li>de Oliveira Santos, G. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphotericin+B-+and+fluconazole-resistant+Candida+spp.,+Aspergillus+fumigatus,+and+other+newly+emerging+pathogenic+fungi+are+susceptible+to+basic+antifungal+peptides.">Amphotericin B- and fluconazole-resistant Candida spp., Aspergillus fumigatus, and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal peptides.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (3), 702-704 (1999).</li><li>Andra, J., Berninghausen, O., Leippe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cecropins,+antibacterial+peptides+from+insects+and+mammals,+are+potently+fungicidal+against+Candida+albicans.">Cecropins, antibacterial peptides from insects and mammals, are potently fungicidal against Candida albicans.</a> Medical Microbiology and Immunology. 189, 169-173 (2001).</li><li>do Nascimento Dias, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+action+of+antimicrobial+peptides+ToAP2+and+NDBP-5.7+against+Candida+albicans+planktonic+and+biofilm+cells.">Mechanisms of action of antimicrobial peptides ToAP2 and NDBP-5.7 against Candida albicans planktonic and biofilm cells.</a> Scientific Reports. 10, 10327 (2020).</li><li>Ikonomova, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+histatin+5+modifications+on+antifungal+activity+and+kinetics+of+proteolysis.">Effects of histatin 5 modifications on antifungal activity and kinetics of proteolysis.</a> Protein Science. 29, 480-493 (2020).</li><li>Clinical Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M27-A3. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Approved standard - Third edition. , (2008).</li><li>Lupetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidacidal+activities+of+human+lactoferrin+peptides+derived+from+the+N+terminus.">Candidacidal activities of human lactoferrin peptides derived from the N terminus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (12), 3257-3263 (2000).</li><li>Han, J., Jyoti, M. A., Song, H. Y., Jang, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+activity+and+action+mechanism+of+histatin+5-halocidin+hybrid+peptides+against+Candida+ssp.">Antifungal activity and action mechanism of histatin 5-halocidin hybrid peptides against Candida ssp.</a> PLoS One. 11 (2), 0150196 (2016).</li><li>den Hertog, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidacidal+effects+of+two+antimicrobial+peptides:+histatin+5+causes+small+membrane+defects,+but+LL-37+causes+massive+disruption+of+the+cell+membrane.">Candidacidal effects of two antimicrobial peptides: histatin 5 causes small membrane defects, but LL-37 causes massive disruption of the cell membrane.</a> Biochemical Journal. 388, 689-695 (2005).</li><li>Ikonomova, S. P., Moghaddam-Taaheri, P., Jabra-Rizk, M. A., Wang, Y., Karlsson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+improved+variants+of+the+antifungal+peptide+histatin+5+with+reduced+susceptibility+to+Candida+albicans+secreted+aspartic+proteases+and+enhanced+antimicrobial+potency.">Engineering improved variants of the antifungal peptide histatin 5 with reduced susceptibility to Candida albicans secreted aspartic proteases and enhanced antimicrobial potency.</a> The FEBS Journal. 285 (1), 146-159 (2018).</li><li>Moghaddam-Taaheri, P., Leissa, J. A., Eppler, H. B., Jewell, C. M., Karlsson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histatin+5+variant+reduces+Candida+albicans+biofilm+viability+and+inhibits+biofilm+formation.">Histatin 5 variant reduces Candida albicans biofilm viability and inhibits biofilm formation.</a> Fungal Genetics and Biology. 149, 103529 (2021).</li><li>Gong, Z., Doolin, M. T., Adhikari, S., Stroka, K. M., Karlsson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+charge+and+hydrophobicity+in+translocation+of+cell-penetrating+peptides+into+Candida+albicans+cells.">Role of charge and hydrophobicity in translocation of cell-penetrating peptides into Candida albicans cells.</a> AIChE Journal. 65 (12), 16768 (2019).</li><li>Gong, Z., Karlsson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+cell-penetrating+peptides+into+Candida+fungal+pathogens.">Translocation of cell-penetrating peptides into Candida fungal pathogens.</a> Protein Science. 26 (9), 1714-1725 (2017).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth edition. 3, (2012).</li><li>Consolidated Sterilizer Systems. Laboratory and Research Autoclaves Available from: <a target="_blank" href="https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf">https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf</a> (2022)</li><li>Rodriguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Diaz-Guerra, T. M., Mellado, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+antifungal+susceptibility+variables+for+a+semiautomated+methodology.">Standardization of antifungal susceptibility variables for a semiautomated methodology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 39 (7), 2513-2517 (2001).</li><li>Mbuayama, K. R., Taute, H., Strmstedt, A. A., Bester, M. J., Gaspar, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+activity+and+mode+of+action+of+synthetic+peptides+derived+from+the+tick+OsDef2+defensin.">Antifungal activity and mode of action of synthetic peptides derived from the tick OsDef2 defensin.</a> Journal of Peptide Science. 28 (5), 3383 (2022).</li><li>Rossignol, T., Kelly, B., Dobson, C., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis-mediated+vacuolar+accumulation+of+the+human+ApoE+apolipoprotein-derived+ApoEdpL-W+antimicrobial+peptide+contributes+to+its+antifungal+activity+in+Candida+albicans.">Endocytosis-mediated vacuolar accumulation of the human ApoE apolipoprotein-derived ApoEdpL-W antimicrobial peptide contributes to its antifungal activity in Candida albicans.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (10), 4670-4681 (2011).</li><li>Helmerhorst, E. J., Reijnders, I. M., van't Hof, W., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+comparison+of+the+hemolytic+and+fungicidal+activities+of+cationic+antimicrobial+peptides.">A critical comparison of the hemolytic and fungicidal activities of cationic antimicrobial peptides.</a> FEBS Letters. 449 (2-3), 105-110 (1999).</li><li>Kerenga, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt-tolerant+antifungal+and+antibacterial+activities+of+the+corn+defensin+ZmD32.">Salt-tolerant antifungal and antibacterial activities of the corn defensin ZmD32.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 795 (2019).</li><li>Lee, I. H., Cho, Y., Lehrer, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+pH+and+salinity+on+the+antimicrobial+properties+of+clavanins.">Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins.</a> Infection and Immunity. 65 (7), 2898-2903 (1997).</li><li>Li, X. S., Reddy, M. S., Baev, D., Edgerton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+Ssa1/2p+is+the+cell+envelope+binding+protein+for+human+salivary+histatin+5.">Candida albicans Ssa1/2p is the cell envelope binding protein for human salivary histatin 5.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (31), 28553-28561 (2003).</li><li>Rothstein, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticandida+activity+is+retained+in+P-113,+a+12-amino-acid+fragment+of+histatin+5.">Anticandida activity is retained in P-113, a 12-amino-acid fragment of histatin 5.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1367-1373 (2001).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques:+Volume+transfers+with+serological+pipettes+and+micropipettors.">Aseptic laboratory techniques: Volume transfers with serological pipettes and micropipettors.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e2754 (2012).</li><li>Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+edge+effect:+A+global+problem.+The+trouble+with+culturing+cells+in+96-well+plates.">The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates.</a> Biochemistry and Biophysics Report. 26, 100987 (2021).</li><li>Goughenour, K. D., Balada-Llasat, J. M., Rappleye, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+growth+assay+for+determination+of+antifungal+susceptibility+of+Histoplasma+capsulatum+yeasts.">Quantitative microplate-based growth assay for determination of antifungal susceptibility of Histoplasma capsulatum yeasts.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3286-3295 (2015).</li></ol>

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

यह प्रोटोकॉल फंगल रोगज़नक़ सी अल्बिकन्स के खिलाफ एएमपी की एंटिफंगल गतिविधि पर मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए एक कुशल दृष्टिकोण का वर्णन करता है। पेप्टाइड्स और अन्य एंटिफंगल एजेंटों के परीक?...

कैंडिडा अल्बिकन्स मानव माइक्रोबायोटा का एक सदस्य है जो मौखिक गुहा, त्वचा, जठरांत्र संबंधी मार्ग और योनि1 सहित कई स्थानों को उपनिवेशित करता है। उन रोगियों के लिए जो मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) और इम्यूनोसप्रेसिव उपचार जैसी बीमारियों के कारण इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड हैं, सी अल्बिकन्स के उपनिवेशीकरण से स्थानीय या प्रणालीगत कैंडिडिआसिस 2,3 हो सकता है। वर्तमान में उपलब्ध छोटे-अणु एंटिफंगल चिकित्सीय, जैसे एम्फोटेरिसिन बी, एज़ोल्स, या एचिनोकैंडिन का उपयोग, घुलनशीलता और विषाक्तता के मुद्दों और चिकित्सीय 4,5 के लिए संक्रमण के प्रतिरोध से जटिल हो सकता है। वर्तमान एंटिफंगल एजेंटों की सीमाओं के कारण, शोधकर्ता लगातार सी अल्बिकन्स के खिलाफ गतिविधि के साथ नए एंटिफंगल अणुओं की खोज कर रहे हैं।
रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (एएमपी) वर्तमान छोटे-अणु एंटिफंगलएजेंट6,7,8 के लिए एक संभावित विकल्प हैं और छोटे-अणु दवाओं की तुलना में प्रतिरोध के विकास के लिए कम संवेदनशील होने का प्रस्तावहै। एएमपी पेप्टाइड्स का एक विविध सेट है, लेकिन वे अक्सर धनिक होते हैं, जिसमें गतिविधि10,11,12 का व्यापक स्पेक्ट्रम होता है। अल्बिकन्स के खिलाफ गतिविधि वाले एएमपी में हिस्टोटिन और सेक्रोपिन परिवारों13,14,15 से प्रसिद्ध पेप्टाइड्स शामिल हैं, साथ ही हाल ही में वर्णित पेप्टाइड्स जैसे टीओएपी 2, एनडीबीपी -5.7, और हिस्टाटिन 5 संस्करण के 11 आर-के 17 आर 16,17। कैंडिडा संक्रमण के इलाज के लिए उनकी क्षमता के कारण, सी अल्बिकन्स को लक्षित करने वाले नए एएमपी की पहचान करना और डिजाइन करना कई शोध समूहों के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है।
प्रभावी एएमपी (और अन्य एंटिफंगल एजेंट) विकसित करने की प्रक्रिया के हिस्से के रूप में जो सी अल्बिकन्स को लक्षित करते हैं, इन विट्रो परीक्षण का उपयोग आमतौर पर आशाजनक पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए किया जाता है। अल्बिकन्स के खिलाफ एंटिफंगल गतिविधि का परीक्षण करने के तरीकों में आमतौर पर 96-वेल प्लेटों में एएमपी (बफर या मध्यम में) के सीरियल कमजोर पड़ने वाली कोशिकाओं को शामिल किया जाता है। इनक्यूबेशन के बाद एंटिफंगल गतिविधि का आकलन करने के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं। नैदानिक प्रयोगशाला मानक संस्थान द्वारा वर्णित एक तकनीक विकास के पूर्ण निषेध के लिए न्यूनतम एकाग्रता (एमआईसी) निर्धारित करने के लिए कुओं की टर्बिडिटी के विशुद्ध रूप से दृश्य मूल्यांकन का उपयोग करती है (चयनित एंटिफंगल एजेंटों के लिए कम से कम 50% अवरोध, जैसे एज़ोल्स और एचिनोकैंडिन) और उप-एमआईसी सांद्रता18 पर विकास का कोई परिमाणीकरण प्रदान नहीं करता है। . एक अन्य आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले दृष्टिकोण में एएमपी के साथ इनक्यूबेशन के बाद व्यवहार्यता को निर्धारित करना शामिल है, जिसमें आगर प्लेटों पर कुओं की सामग्री चढ़ाना, प्लेटों को इनक्यूबेट करना और फिर प्लेट पर कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की संख्या की गणना करना शामिल है। इस विधि का उपयोग कई पेप्टाइड्स के मूल्यांकन के लिए किया गया है, जिसमें हिस्टैटिन 5-आधारित पेप्टाइड्स, एलएल -37 और मानव लैक्टोफेरिन 19,20,21 शामिल हैं। इस तकनीक के लिए अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में आगर और प्लेटों की एक उच्च संख्या की आवश्यकता होती है और इसमें प्लेटों पर सीएफयू की थकाऊ गिनती शामिल होती है। कम प्लास्टिक कचरे को उत्पन्न करते समय अधिक मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने और सीएफयू की गिनती से बचने के लिए, कुओं की सामग्री का उपयोग एक और 96-वेल प्लेट में ताजा माध्यम को टीका लगाने के लिए किया जा सकता है। नई टीका प्लेट को इनक्यूबेट करने के बाद, अवशोषण प्लेट रीडर पर 600 एनएम (ओडी600) पर ऑप्टिकल घनत्व को मापकर विकास की मात्रा निर्धारित की जा सकती है। इस विधि का उपयोग हिस्टाटिन 5 की एंटिफंगल गतिविधि और इसके अवक्रमण टुकड़े और सेल-पेनिट्रेटिंग पेप्टाइड्स 17,22,23,24,25 को निर्धारित करने के लिए किया गया है।
यह प्रोटोकॉल बताता है कि पेप्टाइड्स की एंटिफंगल गतिविधि का परीक्षण कैसे किया जाए और पेप्टाइड्स के कारण सी अल्बिकन्स की व्यवहार्यता में कमी को निर्धारित करने के लिए ओडी600 विधि का उपयोग किया जाए।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates (round bottom)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbance microplate reader</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any available microplate reader is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. albicans strain SC5314</td>
			<td>ATCC&#160;</td>
			<td>MYA-2876</td>
			<td>Other C. albicans may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2620-926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide(s)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of &#8805;95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs for multichannel pipettors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18900-320</td>
			<td>Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate, dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td>For making NaPB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate, monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>For making NaPB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV spectrophotometer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any available UV spectrophotometer is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD medium powder</td>
			<td>BD Life Sciences</td>
			<td>242820</td>
			<td>May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the antifungal activity of peptides against candida albicans

कैंडिडा अल्बिकन्स के लिए एंटिफंगल संवेदनशीलता परीक्षण करने के पारंपरिक तरीके समय लेने वाले हैं और मात्रात्मक परिणामों की कमी है। उदाहरण के लिए, एक सामान्य दृष्टिकोण आगर प्लेटों पर एंटिफंगल अणुओं की विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज की जाने वाली प्लेटिंग कोशिकाओं पर निर्भर करता है और फिर अणु एकाग्रता और विकास निषेध के बीच संबंध निर्धारित करने के लिए कॉलोनियों की गिनती करता है। इस विधि को कॉलोनियों की गिनती के लिए कई प्लेटों और पर्याप्त समय की आवश्यकता होती है। एक और सामान्य दृष्टिकोण विकास को रोकने के लिए आवश्यक न्यूनतम एकाग्रता की पहचान करने के लिए एंटिफंगल एजेंटों के साथ इलाज की गई संस्कृतियों का नेत्रहीन निरीक्षण करके प्लेटों और कॉलोनियों की गिनती को समाप्त करता है; हालांकि, दृश्य निरीक्षण केवल गुणात्मक परिणाम उत्पन्न करता है, और उप-निरोधात्मक सांद्रता में विकास पर जानकारी खो जाती है। यह प्रोटोकॉल एंटीफंगल पेप्टाइड्स के लिए सी अल्बिकन्स की संवेदनशीलता को मापने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व माप पर भरोसा करके, विधि विभिन्न पेप्टाइड सांद्रता पर संस्कृति विकास पर मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय और सामग्री को कम करती है। पेप्टाइड्स के साथ कवक का इनक्यूबेशन एक उपयुक्त बफर का उपयोग करके 96-वेल प्लेट में किया जाता है, जिसमें नियंत्रण कोई विकास निषेध और पूर्ण विकास निषेध का प्रतिनिधित्व नहीं करता है। पेप्टाइड के साथ इनक्यूबेशन के बाद, परिणामस्वरूप सेल निलंबन पेप्टाइड गतिविधि को कम करने के लिए पतला हो जाता है और फिर रात भर उगाया जाता है। रात भर के विकास के बाद, प्रत्येक कुएं के ऑप्टिकल घनत्व को मापा जाता है और प्रत्येक पेप्टाइड एकाग्रता पर परिणामी विकास अवरोध की गणना करने के लिए सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों की तुलना की जाती है। इस परख का उपयोग करने वाले परिणाम आगर प्लेटों पर संस्कृतियों को चढ़ाने की पारंपरिक विधि का उपयोग करने वाले परिणामों के बराबर हैं, लेकिन यह प्रोटोकॉल प्लास्टिक कचरे और कॉलोनियों की गिनती पर खर्च किए गए समय को कम करता है। यद्यपि इस प्रोटोकॉल के अनुप्रयोगों ने एंटिफंगल पेप्टाइड्स पर ध्यान केंद्रित किया है, विधि ज्ञात या संदिग्ध एंटिफंगल गतिविधि वाले अन्य अणुओं के परीक्षण पर भी लागू होगी।

एंटिफंगल पेप्टाइड्स के कारण विकास में कमी को मापने के लिए ओडी600 माप का उपयोग करने से नमूने चढ़ाना और सीएफयू की गिनती की तुलना में पर्याप्त समय बचता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि को तीन अलग-अलग दि?...

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Quantifying the Antifungal Activity of Peptides Against Candida albicans

यह प्रोटोकॉल कैंडिडा अल्बिकन्स के खिलाफ पेप्टाइड्स और अन्य यौगिकों, जैसे छोटे अणु एंटिफंगल एजेंटों की एंटिफंगल गतिविधि पर मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। विकास अवरोध को मापने के लिए कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों की गणना के बजाय ऑप्टिकल घनत्व का इसका उपयोग समय और संसाधनों को बचाता है।

कैंडिडा अल्बिकन्स के खिलाफ पेप्टाइड्स की एंटिफंगल गतिविधि की मात्रा निर्धारित करना

Traditional methods for performing antifungal susceptibility testing for Candida albicans are time-consuming and lack quantitative results. For example, a ...

पेप्टाइड्स का अध्ययन नए एंटिफंगल अणुओं के रूप में किया जा रहा है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग मानव कवक रोगज़नक़ कैंडिडा अल्बिकन्स के खिलाफ एंटिफंगल प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यह तकनीक अन्य तरीकों की तुलना में प्रयोगात्मक समय और प्लास्टिक कचरे को कम करते हुए एंटिफंगल गतिविधि पर मात्रात्मक डेटा प्रदान करती है, जिन्हें एगर पर बनाने की आवश्यकता होती है।कैंडिडा अल्बिकन्स के खिलाफ गतिविधि का परीक्षण करने के अलावा, इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य खमीर बनाने वाली कोशिकाओं के खिलाफ गतिविधि का परीक्षण करने और छोटे-अणु एंटिफंगल एजेंटों की गतिविधि का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, एक संस्कृति ट्यूब में 10 मिलीलीटर तरल खमीर निकालने-पेप्टोन-डेक्सट्रोज, या वाईपीडी माध्यम में वांछित कैंडिडा अल्बिकन्स तनाव को इंजेक्ट करके शुरू करें। रोटरी शेकर पर रात भर 30 डिग्री सेल्सियस और 230 आरपीएम पर संस्कृति उगाएं। उपसंस्कृति सी.अल्बिकन्स की रातोंरात संस्कृति है और 600 नैनोमीटर तरंग दैर्ध्य पर लगभग 1.0 से 1.2 के ऑप्टिकल घनत्व तक बढ़ती है।बाँझ पानी में प्रत्येक पेप्टाइड को घुलनशील करें और इसे वांछित उच्चतम सांद्रता से दोगुना पतला करें, फिर एक गोल-तल वाली 96-वेल प्लेट में प्रत्येक पंक्ति के पहले कुएं में वांछित पेप्टाइड स्टॉक समाधान के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें। इसके बाद, पेप्टाइड युक्त पंक्तियों के कॉलम 2 से 12 में बाँझ अल्ट्रा-शुद्ध पानी के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें। प्लेट में पेप्टाइड स्टॉक समाधानों को कॉलम 10 तक क्रमिक रूप से पतला करने के लिए, कॉलम 1 से कॉलम 2 तक 20 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें और इसे ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं।स्तंभ 10 तक कमजोर पड़ने की प्रक्रिया को दोहराएं जिसमें कॉलम 1 एकाग्रता के 1-से-512 कमजोर पड़ने पर पेप्टाइड समाधान के 40 माइक्रोलीटर होंगे। एक बार ऐसा करने के बाद, कॉलम 10 से पेप्टाइड समाधान के 20 माइक्रोलीटर निकालें और इसे छोड़ दें। सी अल्बिकन्स उपसंस्कृति को 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 3,900 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।सतह पर तैरने वाले को पाइपिंग या डिकेंट करके हटा दें। 2-मिलीमोलर सोडियम फॉस्फेट बफर के 1 मिलीलीटर के साथ गोली को फिर से निलंबित करें और निलंबन को 1.7-मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा कोशिकाओं को छर्रों में छीलें और सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।फिर, 2-मिलीमोलर सोडियम फॉस्फेट बफर के 1 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें और 1 मिलीलीटर सोडियम फॉस्फेट बफर में धुली हुई कोशिकाओं को छोड़ने के लिए 2 और बार धोएं। धुले हुए सेल निलंबन के सेल घनत्व को निर्धारित करें और निलंबन को 2-मिलीमोलर सोडियम फॉस्फेट बफर में प्रति मिलीलीटर 5 वीं कोशिकाओं के लिए 5 गुना 10 गुना पतला करें। पतला सी अल्बिकन्स सेल सस्पेंशन लें और प्रत्येक पंक्ति के कॉलम 1 से 10 और कॉलम 12 में 20 माइक्रोलीटर जोड़ें, फिर कॉलम 11 में 2-मिलीमोलर सोडियम फॉस्फेट बफर के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें।प्लेट 1 को कवर करें और इसे 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें। प्लेट नंबर 2 के सभी कुओं में वाईपीडी के 100 माइक्रोलीटर जोड़कर व्यवहार्यता की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक नई 96-वेल कल्चर प्लेट तैयार करें, फिर प्लेट 2 के सभी कुओं में 2-मिलीमोलर सोडियम फॉस्फेट बफर के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। प्लेट 1 में नमूनों को पतला करने के लिए, इनक्यूबेटर से प्लेट 1 को पुनः प्राप्त करें, और प्रत्येक कुएं में 1-मिलीमोलर सोडियम फॉस्फेट बफर के 280 माइक्रोलीटर जोड़ें।एक पिपेट के साथ सामग्री को अच्छी तरह से मिलाने के बाद, प्लेट 1 से प्लेट 2 के संबंधित कुएं में 8 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें। एक बार पूरा हो जाने के बाद, कवर प्लेट 2 को 350 आरपीएम पर 350 आरपीएम पर 17 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर रखें। प्लेट 2 में सभी कुओं को ऊपर और नीचे करके मिलाएं, यह सुनिश्चित करते हुए कि सभी कोशिकाएं फिर से निलंबित हो जाएं।अवशोषण प्लेट रीडर का उपयोग करके प्लेट 2 में प्रत्येक कुएं के लिए 600 नैनोमीटर तरंग दैर्ध्य पर ऑप्टिकल घनत्व रीडिंग प्राप्त करें। विकास निषेध प्रतिशत की गणना करने और सी.अल्बिकन्स विकास पर पेप्टाइड्स के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए पेप्टाइड एकाग्रता के एक कार्य के रूप में व्यवहार्यता में कमी को प्लॉट करें। सी.अल्बिकन्स कोशिकाओं के साथ पेप्टाइड्स को इनक्यूबेट करने के बाद, एंटीफंगल गतिविधि को कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों, या सीएफयू गिनती विधि और ऑप्टिकल घनत्व माप को शामिल करने वाले वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके निर्धारित किया गया था।ऑप्टिकल घनत्व रीडिंग का उपयोग करने वाले डेटा अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य थे जैसा कि प्रतिकृति के छोटे मानक विचलन द्वारा इंगित किया गया है। इस प्रोटोकॉल को करने में, 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करके खमीर रूप में कैंडिडा अल्बिकन्स कोशिकाओं को बनाए रखें क्योंकि ऑप्टिकल घनत्व माप हाइफल कोशिकाओं में विश्वसनीय नहीं हैं। इस विधि की दक्षता ने शोधकर्ताओं को पेप्टाइड्स और पेप्टाइड सांद्रता की बड़ी संख्या का परीक्षण करके पेप्टाइड गतिविधि पर उच्च ट्रिपल अध्ययन करने की अनुमति दी है।

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Research

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Biology

Quantifying the Antifungal Activity of Peptides Against Candida albicans

2.0K Views.  University of Maryland. Peptides are being studied as novel antifungal molecules. This protocol can be used to study the antifungal efficacy against the human fungal pathogen Candida albicans. This technique provides quantitative data on antifungal activity while reducing experimental time and plastic waste compared to the other methods that require creating on agar.In addition to testing the activity against Candida albicans, this protocol can be used to test the activity against other yeast-forming cells an...