Name: population and single-cell analysis of antibiotic persistence in escherichia coli
Uploaded: 2023-03-24T13:50:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli at JoVE.com

ヴァンメルダーレンラボでの作業は、ARCアクション2018-2023、国立科学研究センター財団(FNRS CDR J.0182.21F)によってサポートされています。T.O.はULBフェローシップによってサポートされています。T.S.はFRIAフェローシップ(FNRS)によってサポートされています。JCは、ポスドクフェローシップ「シャルジェデレシェルシュ」(FNRS)によってサポートされています。

<ol>
	<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitions+and+guidelines+for+research+on+antibiotic+persistence.">Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (7), 441-448 (2019).</li><li>Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+between+resistance,+tolerance+and+persistence+to+antibiotic+treatment.">Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).</li><li>Pribis, J. P., Zhai, Y., Hastings, P. J., Rosenberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+mutagenesis,+gambler+cells,+and+stealth+targeting+antibiotic-induced+evolution.">Stress-induced mutagenesis, gambler cells, and stealth targeting antibiotic-induced evolution.</a> mBio. 13 (3), 01074 (2022).</li><li>Molina-Quiroz, R. C., Lazinski, D. W., Camilli, A., Levy, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-sequencing+analysis+unveils+novel+genes+involved+in+the+generation+of+persister+cells+in+uropathogenic+Escherichia+coli.">Transposon-sequencing analysis unveils novel genes involved in the generation of persister cells in uropathogenic Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6907-6910 (2016).</li><li>Cameron, D. R., Shan, Y., Zalis, E. A., Isabella, V., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+determinant+of+persister+cell+formation+in+bacterial+pathogens.">A genetic determinant of persister cell formation in bacterial pathogens.</a> Journal of Bacteriology. 200 (17), 00303-00318 (2018).</li><li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+involved+in+bacteriostatic+antibiotic-induced+persister+formation.">Identification of genes involved in bacteriostatic antibiotic-induced persister formation.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 413 (2018).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+genes+involved+in+Escherichia+coli+persistence+to+tosufloxacin.">Identification of novel genes involved in Escherichia coli persistence to tosufloxacin.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 581986 (2020).</li><li>Verstraeten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obg+and+membrane+depolarization+are+part+of+a+microbial+bet-hedging+strategy+that+leads+to+antibiotic+tolerance.">Obg and membrane depolarization are part of a microbial bet-hedging strategy that leads to antibiotic tolerance.</a> Molecular Cell. 59 (1), 9-21 (2015).</li><li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli.">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 25 (2013).</li><li>Huemer, M., Mairpady Shambat, S., Brugger, S. D., Zinkernagel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+and+persistence-Implications+for+human+health+and+treatment+perspectives.">Antibiotic resistance and persistence-Implications for human health and treatment perspectives.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51034 (2020).</li><li>Wilmaerts, D., Windels, E. M., Verstraeten, N., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+mechanisms+leading+to+persister+formation+and+awakening.">General mechanisms leading to persister formation and awakening.</a> Trends in Genetics. 35 (6), 401-411 (2019).</li><li>Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+is+an+important+determinant+of+fluoroquinolone+persister+survival.">Ploidy is an important determinant of fluoroquinolone persister survival.</a> Current Biology. 31 (10), 2039-2050 (2021).</li><li>Lemma, A. S., Soto-Echevarria, N., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroquinolone+persistence+in+Escherichia+coli+requires+DNA+repair+despite+differing+between+starving+populations.">Fluoroquinolone persistence in Escherichia coli requires DNA repair despite differing between starving populations.</a> Microorganisms. 10 (2), 286 (2022).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Morawska, L. P., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+tolerance+in+environmentally+stressed+Bacillus+subtilis:+Physical+barriers+and+induction+of+a+viable+but+nonculturable+state.">Antibiotic tolerance in environmentally stressed Bacillus subtilis: Physical barriers and induction of a viable but nonculturable state.</a> microLife. 3, (2022).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+persisters+enabled+by+a+&#223;-lactam-induced+filamentation+method+reveals+their+stochastic+single-cell+awakening.">Enrichment of persisters enabled by a &#223;-lactam-induced filamentation method reveals their stochastic single-cell awakening.</a> Communications Biology. 2 (1), 426 (2019).</li><li>Leygeber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+microbial+population+heterogeneity-Expanding+the+toolbox+of+microfluidic+single-cell+cultivations.">Analyzing microbial population heterogeneity-Expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (23), 4569-4588 (2019).</li><li>Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Escherichia+coli+growth+rate+to+osmotic+shock.">Response of Escherichia coli growth rate to osmotic shock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7807-7812 (2014).</li><li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starvation+induces+shrinkage+of+the+bacterial+cytoplasm.">Starvation induces shrinkage of the bacterial cytoplasm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (24), 2104686118 (2021).</li><li>Goode, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+Escherichia+coli+cells+have+a+lower+intracellular+pH+than+susceptible+cells+but+maintain+their+pH+in+response+to+antibiotic+treatment.">Persister Escherichia coli cells have a lower intracellular pH than susceptible cells but maintain their pH in response to antibiotic treatment.</a> mBio. 12 (4), 00909-00921 (2021).</li><li>Manuse, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persisters+are+a+stochastically+formed+subpopulation+of+low-energy+cells.">Bacterial persisters are a stochastically formed subpopulation of low-energy cells.</a> PLoS Biology. 19 (4), 3001194 (2021).</li><li>Fisher, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+imaging+of+E.+coli+nucleoid+organization+and+dynamics+in+living+cells.">Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells.</a> Cell. 153 (4), 882-895 (2013).</li><li>Cabral, D., Wurster, J., Belenky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+persistence+as+a+metabolic+adaptation:+Stress,+metabolism,+the+host,+and+new+directions.">Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions.</a> Pharmaceuticals. 11 (1), 14 (2018).</li><li>Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar+and+broth+dilution+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+(MIC)+of+antimicrobial+substances.">Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).</li><li>Goormaghtigh, F., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+and+characterization+of+Escherichia+coli+persister+cells+to+ofloxacin+in+exponential+cultures.">Single-cell imaging and characterization of Escherichia coli persister cells to ofloxacin in exponential cultures.</a> Science Advances. 5 (6), (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).</li><li>Odsbu, I., Skarstad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+compaction+in+the+early+part+of+the+SOS+response+is+dependent+on+RecN+and+RecA.">DNA compaction in the early part of the SOS response is dependent on RecN and RecA.</a> Microbiology. 160 (5), 872-882 (2014).</li><li>Pham, T. D. M., Ziora, Z. M., Blaskovich, M. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinolone+antibiotics.">Quinolone antibiotics.</a> MedChemComm. 10 (10), 1719-1739 (2019).</li><li>Drlica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinolones:+Action+and+resistance+updated.">Quinolones: Action and resistance updated.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 9 (11), 981-998 (2009).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+antibiotics+kill+bacteria:+From+targets+to+networks.">How antibiotics kill bacteria: From targets to networks.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 423-435 (2010).</li><li>Reyes-Lamothe, R., Sherratt, D. J., Leake, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+and+architecture+of+active+DNA+replication+machinery+in+Escherichia+coli.">Stoichiometry and architecture of active DNA replication machinery in Escherichia coli.</a> Science. 328 (5977), 498-501 (2010).</li><li>Lesterlin, C., Ball, G., Schermelleh, L., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+bundles+mediate+homology+pairing+between+distant+sisters+during+DNA+break+repair.">RecA bundles mediate homology pairing between distant sisters during DNA break repair.</a> Nature. 506 (7487), 249-253 (2014).</li><li>Alexeeva, S., Gadella, T. W. J., Verheul, J., Verhoeven, G. S., Den Blaauwen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+interactions+of+early+and+late+assembling+division+proteins+in+Escherichia+coli+cells+resolved+by+FRET:+Bacterial+division+studied+by+spectral+FRET.">Direct interactions of early and late assembling division proteins in Escherichia coli cells resolved by FRET: Bacterial division studied by spectral FRET.</a> Molecular Microbiology. 77 (2), 384-398 (2010).</li><li>Miesenb&#246;ck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Yaginuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+ATP+concentrations+in+a+single+bacterial+cell+population+revealed+by+quantitative+single-cell+imaging.">Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging.</a> Scientific Reports. 4, 6522 (2014).</li><li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222 (2014).</li><li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAPI:+A+DNA-specific+fluorescent+probe.">DAPI: A DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).</li></ol>

著者は競合する利益を宣言しません。

この論文で提示されたプロトコルは、集団および単一細胞レベルでの抗生物質治療に応答して観察された持続表現型の分析を可能にします。実験は、化学的に定義された培地(MOPSグリセロール0.4%)で増殖させた大腸菌MG1655株を用いて行った。タイムキルアッセイおよび顕微鏡実験は、指数相培養で実施した。フルオロキノロンであるOFXを5 μg・mL−1の濃度で使用し、持続性細胞を明らかにしました。ここで説明するアプローチは、他の殺菌性抗生物質、例えばβ−ラクタム、アミノグリコシド、または抗菌化合物に適用することができる31。したがって、他の細菌株、培地、または増殖条件を使用することができる。ここで説明したものと同様の設定で異なる蛍光融合をモニタリングすることは、抗生物質治療の前、最中、および後に、DNA複製32、DNA修復25、33、および細胞分裂34などの細胞プロセスを追跡するのに役立ちます。同様に、蛍光レポーターを利用して、細胞内pH35、ATP36、またはROS37レベルなどの細胞生理学の異なる側面を調べることができます。蛍光融合の代わりに、化学染料も適用できます。例えば、hupA-mCherry融合は、DNA38を染色する蛍光色素である4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)に置き換えることができます。ただし、このような蛍光色素と組み合わせてタイムラプス顕微鏡を行うことは、これらの染色技術がタイムラプス実験中の細胞周期のダイナミクスを乱す可能性があるため、避ける必要があります。あるいは、そのような実験は、関連する時点でのスナップショット画像の時間経過分析に置き換えることができる。
このような蛍光レポーターは役に立ちますが、位相差画像の解析で抽出できる情報量も無視してはなりません。ここでは、増殖、OFX処理、および回復段階を通じて細胞長の進化を監視しました。細胞幅、位相差強度、細菌細胞の曲率など、位相差画像に基づく他のパラメータも、MicrobeJ27などの適切なソフトウェアを使用して簡単に抽出できます。
要約すると、ここで説明する手順は、変化する環境またはストレッサーに対する細胞応答をモニターするために、他の条件および細菌種に適用することができる18、19。他の蛍光レポーター(転写および翻訳レポーター、化学色素)をフローサイトメトリー/FACSなどのポピュレーション解析と組み合わせて使用 することにより、興味深い質問にマルチスケールフレームワークで対処できます。

このプロトコルは、単一細胞および集団レベルでの特定の抗生物質治療に応答した細菌持続表現型を分析することを目的としています。持続性とは、同質遺伝子集団内の小さな亜集団が高用量の殺菌性抗生物質(フルオロキノロン、アミノグリコシド、βラクタムなど)に耐える能力を表し、いわゆる持続性細胞の最小阻害濃度(MIC)は集団の大部分と同じです。抗生物質の存在下で細菌の生存を経時的に測定する場合、二相性殺傷動態は、非持続性細胞の最初の急速な根絶、続いて持続性細胞のはるかに遅い殺傷率を伴う、一過性の薬剤耐性細胞の存在を明らかにする。抗生物質を除去すると、これらの細胞は遺伝的に同一の集団を生じさせ、同じ抗生物質で処理した場合と同様の殺傷動態を示します1,2。持続性とは対照的に、抗生物質耐性は集団レベルで定義され、一般にde novo変異または耐性付与プラスミド3の水平遺伝子導入のいずれかの結果です。耐性の原因となる変異は、主に薬物の標的または薬物排出ポンプのプロモーター領域にありますが、ゲノムワイドおよび標的変異体解析アプローチによって特定された持続頻度を変化させる遺伝子は、多数かつ多様であることが証明されています2,3,4,5,6,7,8 .したがって、細菌細胞は複数の経路9,10,11を介して持続性状態に入る可能性があり、これらの持続性細胞の生理機能を特徴付けるには、単一細胞レベルで持続現象を調べるアプローチが必要です。
蛍光顕微鏡と組み合わせて使用されるマイクロ流体ツールの最近の開発は、持続性表現型の特性評価への道を開き、染色体複製12、DNA修復13、細胞分裂14などの重要な細胞プロセスの役割を強調しました。この論文では、高用量のオフロキサシンで処理された指数関数的に成長する大腸菌培養物で生成された持続性細胞を特徴付けるために、古典的な微生物学アッセイとシングルセルライブイメージングを組み合わせた統合アプローチについて説明します。ここで説明するプロトコルは、枯草菌などの他の細菌種における抗生物質持続現象を研究するために適用することができ15、または条件(例えば、βラクタム治療後の抗生物質持続性16)を研究することができ、表現型の不均一性を含む多くの現象を調査するために容易に変更することができる17、18、19.さらに、この論文に記載されているセットアップを他の蛍光レポーターと組み合わせて、単一細胞レベルでのpH20またはATP21の細胞内レベルなど、関心のある明確な細胞パラメーターを調べることができ、抗生物質の持続現象に関する新しい洞察を生み出す可能性があります。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axio Observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2.2H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX Microfluidic System&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CAX2-S0000&#160;</td>
			<td>Microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 FG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ONIX2 1.0.1&#160;</td>
			<td>Microfluidic software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 Manifold Basic&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CAX2-MBC20</td>
			<td>Manifold system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2.6H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02539.0100</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4.5H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02790.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td>Carbon source for MOPS glucose 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+)</td>
			<td></td>
			<td>BE10</td>
			<td>wt reference strain, lab strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT</td>
			<td></td>
			<td>BE16</td>
			<td>HU-mCherry fusion integrated via P1 transduction at the native locus, lab strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4.7H2O&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>24244.232</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://fiji.sc/&#160;</td>
			<td>Image software; Schindelin et al. if used in publication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56815</td>
			<td>Carbon source for MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#174; multiwell culture plate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8812-100EA</td>
			<td>24-well clear flat bottom 2ml volume culture plate for automated plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-1KG</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 digital camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td>Digital Image Acqusition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05099.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05029.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05153.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth agar medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700041</td>
			<td>Growth medium for plating assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12780029</td>
			<td>Growth medium for MIC determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05832.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>Dilution solution for bacterial survival assay used at 10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicrobeJ&#160;</td>
			<td>Imagej/Fiji plugin</td>
			<td>https://www.microbej.com/</td>
			<td>Microscopy image analysis plugin. Ducret et al.for in publication; Detection settings: For bacteria : Area (&#956;m2): 0,1-max; Length (&#956;m): 0,5-max; Width (&#956;m): 0,6-max; Range (&#956;m): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Plates CellASIC ONIX</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B04A-03-5PK&#160;</td>
			<td>Plate for microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2.4H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05927.0100</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, Free Acid ULTROL&#174; Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>475898-500GM</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>SIgma-Aldrich</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6Mo7O24.4H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01180.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01145.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ofloxacin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>82419-36-1</td>
			<td>Fluoroquinolone antibiotic used to treat the bacterial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4, 1x</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Dilution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENESYS 10S UV-Visible Spectrophotometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>&#160;840-208200</td>
			<td>UV-Visible Spectrophotometer, Single/Six Cell Holder with PrinterMeasurement of optical density OD600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-[Tris(hydroxym&#233;thyl)-m&#233;thyl]-glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08602.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss&#174; immersion Oil 518F</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Immersion oil to increase resolution of microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen3.2 Pro</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscopic image acquisition and processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08883.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

population and single-cell analysis of antibiotic persistence in escherichia coli

抗生物質の持続性とは、少量の細菌亜集団が高用量の殺菌性抗生物質に一時的に耐える能力を指します。.殺菌性抗生物質処理により、細菌集団の大部分は急速に殺されます。この最初の急速な殺傷段階に続いて、持続性細胞が生存し続けるにつれて、殺傷率が大幅に低下します。古典的には、持続性は、高用量の抗生物質で、定義された曝露時間に対して実行される時間/キルアッセイによって集団レベルで決定されます。この方法は、持続性細胞のレベルと殺傷動態に関する情報を提供しますが、持続性現象の根底にある固有の細胞間の不均一性を反映していません。ここで説明するプロトコルは、従来のTime/Killアッセイとリアルタイム蛍光顕微鏡を使用したシングルセル分析を組み合わせたものです。適切な蛍光レポーターを使用することにより、生細胞の顕微鏡イメージングは、染色体の複製と分配、細胞伸長、細胞分裂などの細胞プロセスに対する抗生物質の影響に関する情報を提供できます。集団解析とシングルセル解析を組み合わせることで、持続性表現型の分子的および細胞的特性評価が可能になります。

Watch this Scientific Journal Video about Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli at JoVE.com

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

抗生物質の持続性は、敏感な同質遺伝子集団内の小さな亜集団が高用量の殺菌性抗生物質に一時的に耐える能力を表します。.本プロトコルは、 大腸菌 を致死量のオフロキサシンに曝露した後の分子および細胞レベルで抗生物質持続表現型を特徴付けるためのアプローチを組み合わせたものです。

大腸菌における抗生物質持続性の集団および単一細胞解析

Antibiotic persistence refers to the capacity of small bacterial subpopulations to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. Upon ...

ここで説明するプロトコルは、高オフロキサシン処理後の大腸菌持続細胞を特徴付けるために、古典的な微生物学アッセイとシングルセルライブイメージングを組み合わせた統合方法を提供します。この手法の主な利点は、集団および単一細胞レベルで持続現象を解析できることです。集団解析とシングルセル解析を組み合わせることで、持続性表現型の分子的および細胞的特性評価が可能になります。まず、LB寒天プレート上の凍結グリセロールストックから目的の細菌株をストリークし、摂氏37度で一晩15〜19時間インキュベートして、単一のコロニーを取得します。単離したコロニーを、0.4%グルコースを添加した5ミリリットルのMOPS増殖培地を含むガラス管に接種し、必要に応じて選択的抗生物質を培地に加えます。チューブを摂氏37度、180rpmで一晩振とうインキュベーターに入れます。翌日、培養液1ミリリットルを2,300gで3分間遠心分離して細胞をペレット化し、ペレットを同容量のPBSで穏やかに再懸濁した。600ナノメートルでODを測定し、2ミリリットルの最終体積で0.01の初期OD600に必要な体積を計算します。次に、透明底24ウェルプレートのウェルに2ミリリットルのMOPSグリセロール0.4%培地を加え、計算した一晩培養量を接種します。24ウェルプレートを自動マイクロプレートリーダーに入れて、OD600を24時間監視します。マイクロプレートリーダーを、摂氏37度の温度と140rpmの高い軌道回転で15分ごとにOD600を測定するように設定します。100ミリリットルのLB寒天を溶かし、固化を避けるために摂氏55度でフラスコをストックします。6つの小さなガラスフラスコを準備し、滅菌ピペットを使用して5ミリリットルの液体LB寒天培地を各フラスコにピペットで入れます。5ミリグラム/ミリリットルのロキサシン原液を10マイクロリットル取り、90マイクロリットルの超純水で希釈する。LB寒天培地を含む6つのガラスフラスコのそれぞれに希釈オフロキサシンの量を増やして、オフロキサシン1ミリリットルあたり0〜0.1マイクログラムの最終濃度を得る。フラスコを数回回転させて溶液を混合し、抗生物質を添加したLB寒天培地を6ウェル培養プレートに注ぎます。寒天が固まるまで冷まし、プレートを乾かしてからご使用ください。一晩の細菌培養物をPBSで1ミリリットルあたり10〜7分の1のCFUの最終細胞密度に希釈します。乾燥した6ウェルプレートのすべてのウェルに2マイクロリットルの希釈培養物を見つけます。プレートを摂氏37度のインキュベーターに一晩入れる前に、スポットを乾かします。翌日、どのオフロキサシン濃度で細菌コロニーの増殖が阻害されているかを確認します。準備したLB寒天約25ミリリットルをペトリ皿に注ぎます。次に、5〜8個の滅菌ガラスビーズを各固化および乾燥プレートに追加します。プレートを反転してラベルを付けます。次に、900マイクロリットルの0.01モル硫酸マグネシウム溶液を含む10倍段階希釈ガラス管を調製する。ガラス管で、新鮮な温度調整培地で一晩培養を最終OD600約0000に希釈し、培養液をインキュベーターで一晩増殖させます。翌日、OD600が0.3に達したら、スポットアッセイデータに従って希釈用の培養液100マイクロリットルを移す。細菌培養物の10倍連続希釈を行う。次に、調製したLB寒天プレート上に100マイクロリットルの希釈培養液をプレート化する。所望の濃度のオフロキサシンを細菌培養物に加え、振とうしながら摂氏37度でインキュベートを続けます。関連する時点で、100マイクロリットルの培養液を回収し、スポットアッセイデータに応じて培養液を希釈します。希釈培養液を100マイクロリットルのLB寒天プレート上にプレート化する。翌日、一晩インキュベートしたプレートのコロニーを、コロニーを検出できる2つの最も高い希釈率でカウントします。T0でのミリリットルあたりのCFUで各時点でのミリリットルあたりのCFUを正規化して生存率を計算し、時間の関数として正規化された対数ベース10の値をプロットします。マイクロ流体プレートのすべてのウェルから保存液を取り出し、新鮮な培地と交換します。マニホールドシステムでマイクロ流体プレートをシールするには、シールボタンをクリックするか、マイクロ流体ソフトウェアを使用します。次に、マイクロ流体ソフトウェアインターフェースで、[液体プライミングシーケンスの実行]をクリックして最初のプライミングシーケンスを実行します。顕微鏡イメージングを開始する前に、顕微鏡の恒温槽内で摂氏37度で最低2時間インキュベートします。次に、実験を開始する前に、2回目の液体プライミングシーケンスの実行を開始します。マイクロ流体ソフトウェアインターフェースのプレートのシール解除をクリックして、マイクロ流体プレートをシールします。ウェル内の培地を、200マイクロリットルの新鮮な培地、抗生物質を含む新鮮な培地、および新鮮な培地中の0.01 OD希釈培養サンプルと交換します。前述のようにマイクロ流体プレートを密封した後、顕微鏡キャビネット内の顕微鏡対物レンズにプレートを置きます。マイクロ流体ソフトウェアで、細胞ローディングシーケンスの実行をクリックして、細胞をマイクロ流体プレートにロードできるようにします。透過光モードを使用して最適な焦点を設定し、フィールドあたり最大300セルの適切なセル数を観察できるいくつかの関心領域を選択します。マイクロ流体ソフトウェアで、カスタムシーケンスの実行を編集して、ウェル1と2に6.9キロパスカルの新鮮な培地を6時間注入し、続いて抗生物質を含む培地を6.9キロパスカルまたは6時間でウェル3に注入し、最後に新鮮な培地を6.9キロパスカルでウェル4と5に24時間注入します。透過光と蛍光レポーターの励起光源を用いて、15分毎に1フレームのタイムラプスモードで顕微鏡イメージングを行い、マイクロ流体プログラムを開始します。コンピューターでImageJまたはFijiソフトウェアを開き、ハイパースタックタイムラプス顕微鏡画像をフィジーのローディングバーにドラッグします。[イメージ]、[カラー]、[合成の作成] の順に使用して、ハイパースタックのさまざまなチャネルを融合します。「画像」、「カラー」を使用し、チャンネルが目的の色に対応していない場合は「チャンネルを配置」を使用します。MicrobeJプラグインを開き、手動編集インターフェイスを使用して細菌細胞を検出します。自動的に検出されたセルを削除し、目的の永続セルの輪郭をフレームごとに手動で作成します。検出後、MicrobeJ 手動編集インターフェイスの結果アイコンを使用して、ResultJ テーブルを生成します。ResultJ 表を使用して、単一セル解析の対象となるさまざまなパラメータに関する洞察を得て、ResultJ ファイルを保存します。両株のオフロキサシンのMICは0.06マイクログラム/ミリリットルと決定され、hupA-mCherry融合は同質遺伝子野生株と比較してオフロキサシンの感受性に影響を及ぼさないことが示された。スポットアッセイは、時間経過に伴う適切な希釈、例えば時間ゼロにおける10〜負の第5希釈で単離されたクローンを示した。タイムキルアッセイでは、最初の傾きが非持続性集団の急速な殺傷を反映する典型的な二相性曲線が観察されました。第2段階では殺傷速度が遅くなり、薬剤耐性持続細胞の存在が明らかになりました。特に、タイムキル曲線は、hupA-mCherry融合タンパク質がタイムキル動態に影響を及ぼさないことを示しています。マイクロ流体実験では、最初の増殖期は、細胞がオフロキサシン処理前に生存し、分裂していたことを示しています。この最初の成長段階の後、抗生物質が細胞に到達するとすぐに細胞分裂がブロックされました。オフロキサシン処理後、新鮮な培地で灌流すると、大多数の細胞は増殖を再開することができなかった。対照的に、小さな亜集団は伸長し、持続性細胞として定義される糸状細胞を生成する可能性があります。分裂持続性フィラメントは複数の娘細胞を生成し、そのほとんどは未処理の細胞と同様に成長し、分裂し始めました。細胞長の増加は、総mCherry蛍光強度の増加と相関しており、これは複製の再開と核様体存在量の増加を反映しています。細胞内レポーターを含む株を使用して持続性を研究する場合、レポーターの存在が野生株と比較して成長、MIC、および殺傷を妨げないことは帝国です。ここで説明する手順は、変化する環境またはストレスに対する細胞応答をモニターするために、他の条件および細菌種に適用することができる。同じ設定で他の蛍光レポーターを使用することにより、持続性細胞の生理機能に関する新しい洞察を調べることができます。

Research

JoVE Journal

Biology

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

の活性を測定するアッセイ大腸菌誘導性リジンDecarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

エレクトロ作成のための迅速なプロトコル<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;と<em&gt;コレラ菌</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

ライブの検出<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt; O157：PMA-qPCRによりH7細胞

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

からのペプチドおよびタンパク質との組換えエラスチン様ポリペプチドおよびその融合の非クロマトグラフィー精製<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

タンパク質の共発現の多面的メリットで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...