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1。ELP式<ol><li> DMSOストックまたはEの寒天平板コロニーを滅菌したテリフィックブロス培地の3ミリリットルを接種T7-lacプロモーターの制御下で、所望のELPをコードするプラスミドを含有するタンパク質の発現に適した大腸菌 。適切な抗生物質を追加し、継続的に200rpmで振盪しながら37℃で一晩（O / N）でインキュベートする。 </li><li> 4リットルのフラスコ内のテリフィックブロスの滅菌培地を1リットルに、O / N培養の1ミリリットルを追加します。適切な抗生物質を追加し、200 rpmで連続振とうしながら24時間、37℃でインキュベートする。 NOTE：培養24時間インキュベートされた場合T7-lacプロモーターで見られる「漏出性」のベースライン発現は、多くのELPの高レベル発現に十分である。しかしながら、より従来のアプローチは、培養物の光学密度が0.6に達したときにタンパク質発現は、さらに0.2〜1 mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトシド（IPTG）の添加によって誘導され、使用することができる。 </li&gt; <li> 2,000 X gで15分間、4℃で1Lの遠心分離ボトルや遠心分離機に4リットルのフラスコから文化を転送します。 </li><li>上清を捨てる。 NOTE：培養物の1以上Lを成長させる場合、それらはペレットに培養物の他のリットルを添加し、工程1.3を繰り返すことにより凝縮させることができる。培養2 Lまでの単一細胞ペレットに凝縮することができる。 </li><li> 50mlコニカルチューブに細胞懸濁液と45mlの転写に到達するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、水、又は他の所望の緩衝液中にペレットを再懸濁。 </li></ol> 2 ELP精製：。準備作業と逆転移サイクリングの最初のラウンド<ol><li>氷上でサンプルを維持しながら、10 &#39;上&#39;秒、85 Wの出力電力で20秒間「オフ」のサイクルで9分間、合計再懸濁した細胞ペレットを超音波処理する。簡単に説明すると、サンプルが氷の上で冷却してからもう一度9分サイクルを繰り返すことができます。注：ELPは、非常に低いT tを有することが予測される場合</サブ&gt;「オフ」の間隔がT tを上記溶液の加熱を回避するために40秒まで増加させることができる。 </li><li> 50ミリリットルの丸底遠心管に溶解液を移す。 </li><li>文化の各リットルのための10パーセントの2ミリリットル（w / v）のポリエチレンイミン（PEI）を追加し、混合する振る。注：PEIは負に荷電した遺伝的汚染物質の凝縮を助ける正に帯電したポリマーである。 PEIはまた、ELP製品を凝縮し、削除することができように、ELPが負に帯電している場合は、この手順を実行しないでください。 </li><li> 16,000 X gで10分間4℃で遠心します。 </li><li>クリーン50ミリリットル丸底遠心管に上清を移し、ペレットを捨てる。 </li><li>オプションのステップを「ベークアウト」：タンパク質汚染物質を変性させ、ELPが完全に可溶化されるまで4℃に、または氷に転送するために10分間60℃でサンプルをインキュベートする。遠心分離機16,000 X gで10分間4℃でのサンプル。 CLに上清を移し、50ミリリットルの丸底遠心管をEAN、ペレットを捨てる。注：ペプチドまたはタンパク質は、ELPと融合させて、上昇した熱の状態で変性することが期待されている場合は、この手順を実行しないでください。これは、ELP転移が熱不可逆的になるために、または融合された部分の活性を破壊することが原因となることがあります。 </li><li>結晶性のNaCl（3Mを超えない）を加えることで、ELPの移行を誘導する。あるいは、クエン酸ナトリウム（0.3 Mを超えない）は、より高いT tをsまたは低い収率を有するELPは使用することができる。注： 塩が溶解した後、溶液は、溶液からのELPの相分離を示す、濁るべきである。高いT tをs の非常に親水性のELP ELPは、転移のこの予備誘導にELPの相分離を誘導するために、塩の添加と組み合わせて、ある程度の加熱を必要とし得る。 </li><li> 16,000 XG（ホットスピン）で10分間、室温temperatue（RT）で遠心分離する。注：ELPペレットをbすべきEそのサイズは、ELPの発現収量に依存し、観察した。このELPペレットは、最初に不透明に見えるかもしれませんが、冷却後には、半透明表示され、色が茶色である。浄化が進み、汚染物質が除去されるように、ELPペレットはより無色になります。 </li><li>上清を捨て、ペレットに必要なバッファー1-5 mLを加え。ピペッティングによりペレットを再懸濁、または4℃で回転するようにチューブを設定する NOTE：緩衝液の体積は、必要ELPペレットのサイズ、および緩衝液の十分な量のELPペレットの可溶化を可能にするために添加されるべきであるELP発現の歩留まりに依存するであろう。混入タンパク質とジスルフィド相互作用を排除するpH7の10mMトリス（2 - カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP-HCl）を含む水中での精製からの高いシステイン含量の利益を有するのELP。その電荷を中和し、エレメントを低減するために調整されたpHで精製から高い電荷コンテンツ利益を有するのELP汚染タンパク質との相互作用ctrostatic。 </li><li>新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに1mlアリコートに再懸濁したELPソリューションを転送します。 </li><li> 16,000 XG（コールドスピン）で10分間4℃で遠心します。不溶性汚染物質の小さなペレットが観察されるべきである。 </li><li>きれいなチューブに上清を移し、ペレットを捨てる。 </li></ol> 3 ELP精製：逆転移サイクリングのその後のラウンド<ol><li>熱および/またはNaClを添加したELP転移を誘導する。サンプルは、T tを超える温度で15分間ヒートブロックまたはウォーターバス中でインキュベートすることができる。場合は、しかしながら、ELPは（熱の使用を排除する）タンパク質に融合されるか、またはELPは熱のみで到達できない高いT tを有する場合には、NaClを5 M溶液を誘導するために滴下して添加することができるELP遷移。注：溶液は、溶液から、ELPの相分離を示す、曇りを有効にしてください。 </li><li&gt; 16,000 XG（ホットスピン）で10分間遠心します。熱は、ステップ3.1で使用した場合、ELP転移を誘発するために必要であった温度よりも高い温度でこの遠心分離工程を行う。一人でのNaCl、ステップ3.1で使用された場合は、室温で、この遠心分離工程を行う。注：ELPペレットを観察する必要があります。 </li><li>上清を捨て、必要なバッファーの500から750μLを加え、ピペッティングによりペレットを再懸濁または4℃で回転させるためにチューブをセット</li><li> 16,000 XG（コールドスピン）で10分間4℃で遠心します。不溶性汚染物質の小さなペレットが観察されるべきである。 </li><li>きれいなチューブに上清を移し、ペレットを捨てる。 </li><li>全く汚染物質ペレットをステップ3.4の間に観察されなくなるまで繰り返して3.5に3.1を繰り返します。 </li></ol> 4。後の精製処理（オプション） <ol><li>必要に応じて、精製されたELP溶液から過剰の塩を除去するための適当な緩衝液に対してサンプルを透析。注：凍結乾燥されるべきのELPがあるべき4℃でのddH 2オブジェクト指向/ Nに対して透析</li><li>所望であれば、前のO / Nを凍結乾燥すると30分間-80℃で溶液を凍結することによって、長期保存用のELPを凍結乾燥注：凍結乾燥が付加タンパク質とのELPには使用しないでください。 </li><li>必要に応じて、ELPタグを削除することにより、ペプチドまたはタンパク質のELP融合から遊離ペプチドまたはタンパク質を回収。 <ol><li>ビオチン化プロテアーゼ（タンパク質分解酵素供給者によって推奨されているように）、または遺伝的にペプチドまたはタンパク質とELPの間で設計されたプロテアーゼ部位に対応するプロテアーゼのELP融合を有​​するペプチドまたはタンパク質のELP融合を消化。 </li><li>該当する場合は、（プロテアーゼ供給業者により推奨されているように）、ストレプトアビジンで修飾されたビーズを用いてビオチン化プロテアーゼを削除します。 </li><li> 5 M NaCl溶液を滴下により開裂ELPおよび/またはプロテアーゼELP融合体の移行を誘導する。 </li><li> 16,000 X gで10分間、室温で遠心分離します。注：ELPペレットを観察する必要があります。 </li><li>上清を回収し、ELPペレットを捨てる。所望のバッファーに対して上清を透析または純粋なペプチドまたはタンパク質溶液から高塩濃度を除去するために緩衝液交換を行うために遠心フィルターを使用。 </li><li>ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によりELPタグから遊離ペプチドまたはタンパク質の完全な切断を確認する。 </li></ol></li></ol> 5キャラ：SDS-PAGE <ol><li> 2 - メルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液10μlに水で希釈し、ELPの10μLを混合することにより、SDS-PAGE用のELPのサンプルを準備します。 NOTE：ELP40μgのELPは、しばしば、産物のサイズおよび純度を評価するのに十分である。 </li><li> 2分間100℃でサンプルをインキュベートした後、適切なサイズのタンパク質ラダーとともにポリアクリルアミドゲルにロードします。 </li><li>色素がゲル（約45分）の底に近づくまで180 Vでゲルを実行します。 </li><li>染色ロッキングしながら、5分間、0.5MのCuCl 2溶液を用いたゲル。注： いくつかのELP配列は、この色素と相互作用しないようにのELPは、一般的に、クマ​​シーブリリアントブルー染色により可視化されていません。クマシーブリリアントブルーは、アルギニン残基と主に相互作用し、他の塩基性残基ヒスチジンおよびリジンおよび芳香族残基、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン26と弱く相互作用します。従ってELPはペプチドまたはタンパク質ELP融合体は、それらの一次配列は、これらの特定の残基の十分な数が含まれている場合のみ、クーマシーブリリアントブルーで染色することができる。 </li><li> ELPバンドのMwは、ELP遺伝子からと無関係な汚染物質のバンドが存在しないことを期待理論MWのものに対応することを確認します。注：一部のELPは、その予想されるMWの9、27よりも最大20％高い見かけの分子量で移動する。 </li></ol> 6キャラ：マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF-MS） <ol><li>約25μmのELP濃度を達成するために0.1％トリフルオロ酢酸を含む50％アセトニトリル水溶液でELP溶液を調製する。注：このソリューションは、塩があってはならないので、ELPが精製後、H 2 Oに対して透析しなければなりません。 </li><li> 0.1％トリフルオロ酢酸を含む50％アセトニトリル水溶液に飽和シナピン酸マトリックス溶液を調製する。 </li><li>約2.5ピコモル/μLのELP濃度を達成するためにマトリックス溶液9μlにELP溶液1μlを追加します。注：この混合物は、さらに、MALDI-TOF信号を最適化するために、マトリックス溶液で希釈することができる。 </li><li>金属MALDIプレート上に堆積物ELP-マトリックス混合物の1〜2μlのスポットが完全に乾燥させます。 </li><li> ELPの比（m / z）を充電し、その測定されたMWを推定するために質量を決定するためにMALDI-TOFで5-10スペクトルを得る。 </li></ol> 7。CharacterizatioN：温度プログラム比濁法および動的光散乱<ol><li>温度プログラム濁によるELPのT tを決定します。 <ol><li>使用するバッファーでELPソリューション（5〜100μmでから、 例えば ）希釈系列を用意します。 </li><li>温度制御されたUV-可視分光光度計を用いて、1℃/分の加熱速度で温度（ 例えば 、20〜80℃）の範囲にわたって350nmでの光学密度（OD）を測定する。 NOTE：ODの増加が見られない場合にはT tは 、器具の温度上限を超えることがある。見かけのT tは、NaClの添加によって減少させることができる。 1MのNaClから始まり、ELP遷移が測定可能な温度範囲内で検出されるまで、0.5 Mのステップで増加。 </li><li> 1°C /分の冷却速度で温度と同じ範囲にわたってODの減少を測定することにより、ELP転移の可逆性を確認する。 </li><li>ホモのT tを決定する濁度プロファイル（ODは、温度に対してプロット）の変曲点を識別することによって、ポリマーELP。注：この温度は容易に誘 ​​導体の最大値に対応する温度をT tと定義されるOD曲線の導関数から定義することができる。より複雑なELP·アーキテクチャは、より複雑な濁度プロファイルが表示され、セクション7.2で説明したように、さらに分析する必要があります。 </li></ol></li><li>より複雑な熱的性質（球状ミセルに自己集合、例えば 、ELPジブロックコポリマー）を表示するのELPのさらなる特徴付けは、動的光散乱（DLS）によって達成される。 <ol><li>使用するバッファーでELP液を調製し、20から450 nmの細孔径を有するフィルターを通してサンプルを渡します。 NOTE：フィルターの孔径の選択は、溶液中の任意のELPアセンブリの有無、大きさ、および安定性に依存するであろう。最小の実現可能なフィルタ孔径は、次のような汚染物質を排除することが好ましいDLS測定の質を低下させるほこり、。小さいフィルタ細孔サイズを通してELPソリューションを渡すときに大きな抵抗を経験しているとき、より大きなフィルター孔サイズを使用する必要があります。 </li><li>濁度プロファイルで識別された関心領域に対応する温度範囲にわたって流体力学的半径（R H）を測定する。注：ELPのユニマーは通常、R H &lt;10 nmのナノ粒子集合体がR、H〜20〜100 nmであり、凝集体はR、Hがある&gt; 500ナノメートルを持っています。 R Hの各増加は粒子の大きさに比例する温度の関数としてのUV-可視分光光度計により測定された350nmでのODの増加に対応すべきである。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+Chemistry+of+Biological+Free+Energy+Transduction+As+Demonstrated+by+Elastic+Protein-Based+Polymers.">Physical Chemistry of Biological Free Energy Transduction As Demonstrated by Elastic Protein-Based Polymers.</a> J. Phys. Chem. B. 101, 11007-11028 (1997).</li><li>Sallach, R. E., Conticello, V. P., Chaikof, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+elastin-like+protein+in+pichia+pastoris.">Expression of a recombinant elastin-like protein in pichia pastoris.</a> Biotechnology progress. 25, 1810-1818 (2009).</li><li>Schipperus, R., Teeuwen, R. L., Werten, M. W., Eggink, G., de Wolf, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+production+of+an+elastin-like+polypeptide+by+Pichia+pastoris.">Secreted production of an elastin-like polypeptide by Pichia pastoris.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 85, 293-301 (2009).</li><li>Schipperus, R., Eggink, G., de Wolf, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+elastin-like+polypeptides+with+different+transition+temperatures+by+Pichia+pastoris.">Secretion of elastin-like polypeptides with different transition temperatures by Pichia pastoris.</a> Biotechnology progress. 28, 242-247 (2012).</li><li>Herzog, R. W., Singh, N. K., Urry, D. W., Daniell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+synthetic+protein-based+polymer+(elastomer)+gene+in+Aspergillus+nidulans.">Expression of a synthetic protein-based polymer (elastomer) gene in Aspergillus nidulans.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 47, 368-372 (1997).</li><li>Conley, A. J., Joensuu, J. J., Jevnikar, A. M., Menassa, R., Brandle, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+elastin-like+polypeptide+fusions+for+expression+and+purification+of+recombinant+proteins+in+plants.">Optimization of elastin-like polypeptide fusions for expression and purification of recombinant proteins in plants.</a> Biotechnology and bioengineering. 103, 562-573 (2009).</li><li>Conrad, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELPylated+anti-human+TNF+therapeutic+single-domain+antibodies+for+prevention+of+lethal+septic+shock.">ELPylated anti-human TNF therapeutic single-domain antibodies for prevention of lethal septic shock.</a> Plant biotechnology journal. 9, 22-31 (2011).</li><li>Kaldis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+human+interleukin-10+fusions+in+tobacco+cell+suspension+cultures.">High-level production of human interleukin-10 fusions in tobacco cell suspension cultures.</a> Plant biotechnology journal. 11, 535-545 (2013).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation:+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system.">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3, 357-367 (2002).</li><li>McDaniel, J. R., Mackay, J. A., Quiroz, F. G., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recursive+directional+ligation+by+plasmid+reconstruction+allows+rapid+and+seamless+cloning+of+oligomeric+genes.">Recursive directional ligation by plasmid reconstruction allows rapid and seamless cloning of oligomeric genes.</a> Biomacromolecules. 11, 944-952 (2010).</li><li>Amiram, M., Quiroz, F. G., Callahan, D. J., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+parallel+method+for+synthesizing+DNA+repeats+enables+the+discovery+of+'smart'+protein+polymers.">A highly parallel method for synthesizing DNA repeats enables the discovery of 'smart' protein polymers.</a> Nat Mater. 10, 141-148 (2011).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+effects+of+chain+length+and+concentration+on+the+thermal+behavior+of+elastin-like+polypeptides.">Quantification of the effects of chain length and concentration on the thermal behavior of elastin-like polypeptides.</a> Biomacromolecules. 5, 846-851 (2004).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+of+Polypeptide+Inverse+Temperature+Transition+Depends+on+Mean+Residue+Hydrophobicity.">Temperature of Polypeptide Inverse Temperature Transition Depends on Mean Residue Hydrophobicity.</a> Journal of the American Chemical Society. 113, 4346-4348 (1991).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+change+in+Gibbs+free+energy+for+hydrophobic+association+-+Derivation+and+evaluation+by+means+of+inverse+temperature+transitions.">The change in Gibbs free energy for hydrophobic association - Derivation and evaluation by means of inverse temperature transitions.</a> Chem Phys Lett. 399, 177-183 (2004).</li><li>Cho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Hofmeister+anions+on+the+phase+transition+temperature+of+elastin-like+polypeptides.">Effects of Hofmeister anions on the phase transition temperature of elastin-like polypeptides.</a> The journal of physical chemistry. B. 112, 13765-13771 (2008).</li><li>Kim, B., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+actuation+of+inverse+phase+transition+of+a+stimulus-responsive+fusion+polypeptide+by+ligand+binding.">Allosteric actuation of inverse phase transition of a stimulus-responsive fusion polypeptide by ligand binding.</a> J Am Chem Soc. 130, 17867-17873 (2008).</li><li>Hassouneh, W., Nunalee, M. L., Shelton, M. C., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+peptide+motifs+from+calmodulin+confer+divalent+ion+selectivity+to+elastin-like+polypeptides.">Calcium binding peptide motifs from calmodulin confer divalent ion selectivity to elastin-like polypeptides.</a> Biomacromolecules. 14, 2347-2353 (2013).</li><li>Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+elastin-like+polypeptides+in+tissue+engineering.">Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering.</a> Adv Drug Deliv Rev. 62, 1479-1485 (2010).</li><li>MacEwan, S. R., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin-like+polypeptides:+biomedical+applications+of+tunable+biopolymers.">Elastin-like polypeptides: biomedical applications of tunable biopolymers.</a> Biopolymers. 94, 60-77 (2010).</li><li>McDaniel, J. R., Callahan, D. J., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+delivery+to+solid+tumors+by+elastin-like+polypeptides.">Drug delivery to solid tumors by elastin-like polypeptides.</a> Adv Drug Deliv Rev. 62, 1456-1467 (2010).</li><li>Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin-like+polypeptides+as+a+purification+tag+for+recombinant+proteins.">Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins.</a> Curr Protoc Protein Sci. , (2010).</li><li>Shamji, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+fusion+protein+between+thermally+responsive+elastin-like+polypeptide+and+interleukin-1+receptor+antagonist:+sustained+release+of+a+local+antiinflammatory+therapeutic.">Development and characterization of a fusion protein between thermally responsive elastin-like polypeptide and interleukin-1 receptor antagonist: sustained release of a local antiinflammatory therapeutic.</a> Arthritis Rheum. 56, 3650-3661 (2007).</li><li>Hassouneh, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+multivalent+display+of+proteins+by+temperature+triggered+self-assembly+of+elastin-like+polypeptide+block+copolymers.">Unexpected multivalent display of proteins by temperature triggered self-assembly of elastin-like polypeptide block copolymers.</a> Biomacromolecules. 13, 1598-1605 (2012).</li><li>Lan, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+nonchromatographic+method+for+the+purification+of+recombinant+proteins+using+elastin-like+polypeptide-tagged+proteases.">An improved nonchromatographic method for the purification of recombinant proteins using elastin-like polypeptide-tagged proteases.</a> Analytical Biochemistry. 415, 200-202 (2011).</li><li>Bellucci, J. J., Amiram, M., Bhattacharyya, J., McCafferty, D., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-in-one+chromatography-free+purification,+tag+removal,+and+site-specific+modification+of+recombinant+fusion+proteins+using+sortase+A+and+elastin-like+polypeptides.">Three-in-one chromatography-free purification, tag removal, and site-specific modification of recombinant fusion proteins using sortase A and elastin-like polypeptides.</a> Angewandte Chemie. 52, 3703-3708 (2013).</li><li>Compton, S. J., Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+dye+response+and+interference+in+the+Bradford+protein+assay.">Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.</a> Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).</li><li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP.">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein expression and purification. 7, 51-57 (1996).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nat Biotechnol. 17, 1112-1115 (1999).</li><li>McDaniel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+thermally+responsive+nanoparticles+of+a+genetically+encoded+peptide+polymer+by+drug+conjugation.">Self-assembly of thermally responsive nanoparticles of a genetically encoded peptide polymer by drug conjugation.</a> Angewandte Chemie. 52, 1683-1687 (2013).</li></ol>

著者らは、開示することなく、競合する金融利害関係はありません。

ELPは、それらの刺激応答性相挙動の利用による精製の安価ーフリーの手段を提供します。このアプローチは、Eの遺伝的にコード化されたのELPの発現後の両方で、可溶性と不溶性の汚染物質を除去するためのELPとペプチドまたはタンパク質のELP融合体のLCST挙動を利用しています大腸菌 。精製のこの容易さは、様々な用途のELPを生成するために使用することができる、またはELPポスト精製処理で除去され得る精製タグとして作用することができる組換えペプチド又はタンパク質の精製のために利用することができる。 ELPの精製は、 大腸菌を溶解する予備的な手順が含まれます大腸菌およびITCによる残留可溶性および不溶性汚染物（ 図2）を除去し、粗培養溶解物（ 図1）からのゲノムおよび不溶性細胞片を除去する。 ADDIでELP遷移をトリガした後、遠心分離熱や塩のTiONのホットスピンと呼ばれる工程では、上澄み液中の可溶性の汚染物質からELPを分離します。 ELPを再可溶化した後、溶液を不溶性汚染物ペレットを除去するためにT tを下回る温度で再度遠心分離され、ステップ冷スピンと呼ばれる。ホットとコールドスピンを交互にすることは得小さなコストで、各サイクルでのELPソリューションの純度を向上させます。精製収率は、ELP T tの長さ、および縮合ペプチドまたはタンパク質に依存して変化する。典型的に、このプロトコルは、E.リットル当たり精製ELP 100mgをもたらす大腸菌の文化は、しかし収量は500ミリグラム/ Lまで達することができるELP生成物の最終純度は、SDS-PAGE（ 図3）によって確認される。精製されたELPのMwはELP遺伝子によりコードされた理論MWと密接に一致している必要があります。しかし、いくつかのELPは、その予想されるMWの9、27よりも最大20％高い見かけの分子量をSDS-PAGEに移行します。 ELPのより正確な分析MWはまた、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）などの分析手法直交するとともにELP生成物の純度に関する追加情報を提供することができるMALDI-TOF-MSによって達成することができる。 精製後、ELP T tは、温度プログラム比濁法により測定される。温度を上昇させながら、この技術は、ELP液のODを監視します。それは、ELPの意図されたアプリケーションに関連する一連の濃度を特徴付けることをお勧めしますので、T tは濃度依存性である。 ELPは、濁度プロファイルはユニマーために、ミクロンスケールの凝集体からELP遷移に対応する単一の急激な増加（ 図4A）を示すためのホモポリマー。 T tは正確に温度に対するODの一次導関数の最大値として決定さ濁度プロファイルにおける変曲点に対応する温度として定義される。の可逆性ELPの相転移は、温度がT tを（ 図4B）の下方に下降するようにベースラインにODの減少によって確認される。温度ランプを増減した濁度プロファイルは、ELPのコアセルベートとのELP溶化の可変ヒステリシスの沈降に大きさと反応速度が異なります。ペプチドまたはタンパク質のELP融合体は、同様に、ELPに融合されたペプチドまたはタンパク質は、T Tに影響を与え、このようにLCST挙動を示す。タンパク質についてELPは、遷移が、タンパク質の融解温度未満の融合体に可逆的である。温度プログラムは、比濁法ELP製品の初期熱特性のための優れた方法であるが、このような示差走査熱量測定（DSC）などの代替技法も、ELP T tを測定するために使用することができる。 より複雑なアーキテクチャを有するELPはまた、温度PROGRAによって特徴付けることができる、より複雑な熱的挙動を示すMMED比濁法。 ELPジブロックコポリマーは、例えば、それらの臨界ミセル温度で球状ミセル中にそれらの温度トリガ型自己集合に対応する特徴濁度プロファイルを示す。このようなELPジブロックコポリマーの場合は外径は、典型的には第1より高い温度でのODの急激な増加は（最大で2.0単位のベースラインの上）ミクロンスケールの形成を示す、その後、ミセルへのユニマーからの移行を示すベースラインの上0.1〜0.5単位が増加骨材（ 図5A）。温度トリガー自己集合ELP構造に関する追加の情報は、DLS、溶液中のELPアセンブリのR Hを測定する手法で得られる。 R、Hの変化は、比濁法（ 図5B）を用いて測定し、ODの変化と密接に同意するものとします。ナノ粒子集合体は、R、H〜は20〜100nmを示し、凝集体はR、Hを発揮しながら、ELPのユニマーは通常、R H &lt;10ナノメートルを示す17、23、29により得ることができる。 ELPによる熱特性の調整可能性のために、T tをs の範囲は、様々なELPの設計によって得られる。それは、本来のT tが極端に低い、または高いT T S は 、この標準的なプロトコルほとんど修正を必要とする各ELPのための精製プロトコルの最適化に影響を与えるであろうことを心に留めておくことが重要です。非常に高い転移温度を有するELPは、この方法による精製のために不適切である。新規のELPとペプチドまたはタンパク質ELP融合体の設計は、ELPの熱応答性を損なう可能性がある場合、単純なヒスチジンタグは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによる代替的な精製のために含めることができる。さらに、ゲスト残基が荷電されている場合ELP配列の特性は、このプロトコルの変更を必要とし得る。緩衝液の操作は、汚染物質17との静電相互作用を排除する努力においてELPの全体の電荷を変化させる方法として使用することができる。適切な処置を精製プロセスが融合部分の活性を混乱させないように注意したときさらに、このプロトコルは、ペプチドおよびタンパク質を有するELP融合体の特殊な状況に適している。そのような修飾に関するプロトコルを通じてノートがT tを、電荷、または融合懸念に対して、これらの課題を提示し得るのELPの精製を導くように働く。 そのLCST挙動によるのELPの精製はのELPとEに発現されたペプチドまたはタンパク質のELP融合体の大部分を精製するために、シンプルでクロマトグラフィーのないアプローチを提示大腸菌 。ここに要約プロトコルは、浄化Oを許可ほとんどの生物学の研究室に共通している機器を使用して1日でFのELP。のELPとその融合体の精製の容易さは、我々は願って、材料科学、バイオテクノロジー、医療に新たなアプリケーションのためのELPのデザインの増え続ける多様性を奨励する。

エラスチン様ポリペプチド（ELPは）は、X、ゲスト残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸である反復ペンタペプチドVPGXGから構成される生体高分子である。 ELPは展示下限臨界溶液温度（LCST）の相転移挙動、均質ELP溶液は、一般ELP文献1における逆転移温度（T t）が呼び出され、そのLCSTに加熱すると2相に分離するような。 2相は非常に希薄ELP球相とELP豊富な土砂相から構成されている。 ELPの豊富な堆積物は、その後、合体、ミクロンサイズの粒子に、ELP鎖の凝集の際に、短い時間スケール上に形成されている。この動作は、数℃の範囲にわたり発生し、均一な溶液がT tを以下の温度に戻ったときに回復されるように、通常は可逆的である。 ELPは、典型的には、往復大腸菌（E.coli）で合成される発現プラスミドに連結する人工遺伝子をメートル。次いで、このプラスミドをE.に変換されるタンパク質発現のために最適な大腸菌細胞株。我々は、 大腸菌内のELPの多種多様の発現のためのT7-LAC pETベクターシステムを独占的に使用している大腸菌 、酵母2-4、5真菌、および植物6-8の他の発現系はまた、他の研究者によって利用されているが。多くのアプローチは、遺伝的に再帰的な方向性のライゲーション（RDL）9、プラスミドの再構築（PRE-RDL）10で再帰的に、方向性ライゲーションを含め、反復的なELP遺伝子を構築するために存在し、拡張ローリングサークル増幅（OERCA）を11に重なっている。遺伝子レベルでのELPを設計する能力は、さらなる機能を付加することができる様々なアーキテクチャ（ 例えば 、モノブロック、ジブロック、トリブロックなど）とのELPを作成するために、組換えDNA技術を使用する機会を与えるペプチドおよびタンパク質。遺伝子レベルでの制御は、各ELPが完全に単分散のバイオポリマー製品を提供し、正確な長さおよびその遺伝プラスミド鋳型によって指示組成物を用いて発現されることを保証する。 各ELPの熱特性は、その分子量（MW）とシーケンスだけでなく、その溶液中の濃度と、そのような塩などの他の共溶質の存在を含む外因性の要因として、生体高分子に固有のパラメータに依存する。 ELP 12およびそのゲスト残基の組成物の長さは1、13、14、疎水性ゲスト残基およびより長い鎖長がより低いT tをs をもたらすT tを制御するために使用することができるELPの設計における2つの直交するパラメータ、一方、親水性であるゲスト残基およびより短い鎖長は、より高いT tをs をもたらす。 ELP濃度は反比例グラムの溶液T tを、に関連しているイーターELP濃度は低いT T S 12を持っている。塩の種類と濃度はまた、塩の効果は、ホフマイスター系列15に続く ELP T tを 、影響を与える。コスモトロピックアニオン（CL -とホフマイスター系列でより高い）ELPのT tを低下させ、塩濃度を増加させると、この効果を高めます。これらの内因性および外因性パラメータは、ELPの特定の用途に必要とされる目標温度範囲内で熱的挙動を得るために調整することができる。 のELPの刺激応答挙動はバイオセンシング16、17、組織工学18、および薬物送達19、20などのアプリケーションの多様な範囲のために有用である。 ELPは、遺伝子レベルでのペプチドまたはタンパク質に融合されるとさらに、ELPは、組換え元気の精製のための安価なバッチ方法を提供する単純な精製タグとして機能することができる何ー21を必要としない潮またはタンパク質。精製プロセスの改変は、ELPに融合ペプチドまたはタンパク質の活性が維持されることを保証する。ペプチドまたはタンパク質ELP融合体は、ELPタグは22,23または代替的に、遊離ペプチドまたはタンパク質が必要とされる場合、プロテアーゼ認識部位は、ペプチドまたはタンパク質とELPとの間に挿入することができる有用である用途のために精製することができる。 ELPタグの除去は、遊離プロテアーゼまたは後者は標的ペプチド又はからELPタグとプロテアーゼELP融合体を分離することができるELP精製の最終ラウンドの処理のさらなる容易さを提供するプロテアーゼELP融合体による消化によって達成することができる単一のステップ24、25中のタンパク質。次のプロトコルは、その熱的特性によってのELPとペプチドまたはタンパク質のELP融合のための精製法について説明し、特徴づけるための基本的なテクニックについて説明しますELP製品の熱応答。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1503">
	<tbody>
		<tr>
			<td>pET-24a(+) 
			pET-25b(+)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69749-3 
			69753-3</td>
			<td>T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra BL21 (DE3) competent cells</td>
			<td>Edge BioSystems</td>
			<td>45363</td>
			<td>Competent E. coli for recombinant protein expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media</td>
			<td>MO BIO Laboratories</td>
			<td>12105</td>
			<td>Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I2481C</td>
			<td>IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) tablet</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>524650</td>
			<td>These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195444</td>
			<td>PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3138-0050</td>
			<td>These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20491</td>
			<td>A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ready Gel Tris-HCL gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 &#956;l</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>161-1105</td>
			<td>These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cupric chloride dihydrate (CuCl2-2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C454-500</td>
			<td>A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCL polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anotop 10 syringe filter: 
			0.02 &#956;m 
			0.1 &#956;m 
			0.2 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6809-1002 
			6809-1012 
			6809-1022</td>
			<td>These 10 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV filter: 
			0.45 &#956;m</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLHVX13NK</td>
			<td>These 13 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-chromatographic purification of recombinant elastin-like polypeptides and their fusions with peptides and proteins from escherichia coli

エラスチン様ポリペプチドは、特徴的な転移温度以下のような可溶性ユニマー既存およびそれらの転移温度以上のミクロンスケールのコアセルベート中に凝集、下限臨界溶液温度相転移挙動を示し、反復的なバイオポリマーである。遺伝子レベルでのエラスチン様ポリペプチドの設計は、それらの熱的性質を規定するそれらの配列と長さの正確な制御を可能にする。エラスチン様ポリペプチドは、ELPの転移温度とバイオポリマーアーキテクチャーは、関心のある特定の用途のために調整することができるバイオセンシング、組織工学、薬物送達、を含む種々の用途に使用される。さらに、エラスチン様ポリペプチドの下限臨界溶液温度相転移挙動は、コアセルベーションおよびそれらの選択的可溶化は、可溶性および不溶性の両方の汚染物質の除去を可能にするような、それらの熱応答によってそれらの精製を可能にする大腸菌で発現後のS。このアプローチは、単独で、エラスチン様ポリペプチドの精製のために、または遺伝的にエラスチン様ポリペプチドタグに付加組換えペプチドまたはタンパク質は、クロマトグラフィーなしに精製することができるペプチドまたはタンパク質融合物の精製のためのツールと​​して使用することができる。このプロトコルは、エラスチン様ポリペプチドおよびそれらのペプチドやタンパク質融合物の精製を記載し、純粋なエラスチン様ポリペプチド産物の熱挙動を評価するための基本的な特性評価技術について説明します。

ここでは、ELPホモポリマー及びELPジブロック共重合体の精製および特性評価のための代表的な結果について説明します。 Eの式の24時間に続いて大腸菌、細胞を遠心分離によって回収し、超音波処理により溶解される。一般的に、色の微妙な変化は、十分な細胞溶解（ 図1A）を確認、超音波処理後に発生します。 PEIの添加後、ゲノム成分および細胞破片を、上清中の可溶性ELP（ 図1B）からの不溶性汚染物の大規模なペレットを分離し、遠心分離によって収集される。 ELPは、さらに、可溶性および不溶性の両方の汚染物質（ 図2）28からのELPを分離するためにLCST挙動を利用し、逆転移サイクリング（ITC）により精製する。 ELPの相転移は、熱および/または塩の添加によってトリガされる。 ELP Aで構成され、チューブの底にペレットを形成する際の遠心分離の結果NDいくつかの不溶性汚染物質（ 図1C）。 ELPペレットを保持し、冷緩衝液に再懸濁されている間、この上清中にホットスピン破棄可溶性の汚染物質をステップは、と呼ばれる。再溶解ELPを4℃で再び遠心分離するこの可溶性ELPを含む上清を保持したまま冷たい不溶性夾雑物のペレットをスピン·破棄の手順は、と呼ばれる。残留ELPが遠心管の各ITCのラウンド中やピペットチップで失われているように、ホット＆コールドスピンを交互にサイクルを繰り返すことは、ELPの純度を増加させるが、やや収量が減少するコストで。 のELPとペプチドまたはタンパク質ELP融合体の精製は成功したSDS-PAGEにより確認される。精製プロセス全体を通じて行わ小分けは、 大腸菌からのELPの漸進的な精製を実証大腸菌溶解液。 ELPて粗Eに過剰発現している大腸菌溶解物および汚染物質は、ウィットを下げるITCのH連続ラウンド（ 図3）。精製されたELPは、予測された理論MWに近い単一バンドとして表示されます。 ELP T tは、温度プログラム濁度によって特徴付けられる。 ELPホモポリマーの濁度プロファイルは、（約2.0単位、25μMのELP濃度のベースライン上の）350でのODの単一の急激な増加（ 図4A）を示す。 ODは、温度がT tを（ 図4B）よりも低下したときにベースラインに戻り、冷却濁りスキャンはELP遷移の可逆性を確認する。 ELPジブロックコポリマーは、ホモポリマーのELPと比較して、より複雑な濁度プロファイルを示す。 ODは、通常、最初のベースラインの上に0.1〜0.5台に増加し、その後、ベースラインより2.0台と急激に外径が大きくなる（ 図5A）。 DLS測定は、温度に対するR Hの変化、共に関する情報を提供<html>濁度プロファイル（ 図5B）から得られた情報をrroborating。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig1highres.jpg" width="600" /> 図1。予備のELP精製。式の24時間後に、E.大腸菌細胞を遠心分離により回収し、PBS中に再懸濁する。A）細胞を、溶解物が超音波処理した後に暗くなるように微妙な色の変化を伴う超音波処理によって溶解される。B）PEIの添加後、DNA汚染物質を凝縮するために、溶解物は遠心分離し、不溶性デブリの大ペレットを上清中に可溶性ELPから分離されているC）ELP転移は、熱および/ ​​またはその塩および遠心分離の形態の添加透光ELPペレットを用いて誘導される。ANK &quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" width="600" /> 図2逆転移サイクリング。ELPは、可溶性および不溶性の両方の汚染物質からのLCST挙動により精製する。 ELP-リッチ溶解物（1）ELP転移は、熱および/またはその塩を添加して誘導され、ELPを遠心分離（ホットスピン）（2）により分離されるで始まる。溶解性汚染物質を含有する上清を廃棄しながらELPペレット（図3a）に保持される（図3b）。 ELP（4）冷緩衝液に再懸濁し、4°C（コールドスピン）〜（5）で再度遠心分離する。可溶性ELPを含有する上清を（図6b）に保持されている間に、不溶性汚染物質を含有するペレット（図6a）が廃棄される。により求められる所望の純度が達成されるまでホットとコールドスピンを交互のサイクルが繰り返されるSDS-PAGE。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" width="600" /> 図3 ELP精製産物のSDS-PAGE分析を示す。ELPの精製は成功したSDS-PAGEにより確認される。過剰発現されたELPが原油Eに明らかである超音波処理後の大腸菌溶解物（2）。いくつかのELP不溶性汚染物のペレットを捨てで失われるが、PEIの添加及び遠心分離後に可溶性ELPは、主に、上清（3）に保持される（4）。最初のホットスピン後の上清は、可溶性の汚染物質の有意なレベルが含まれている（5）。最初の冷たいスピン後の上清は、不溶性の汚染物質からのELPの良好な分離を示している（6）。ホット（7）、Cの追加のサイクル古いは、最終的なホット（9）および冷スピン（10）上清を無関係の汚染バンドを示さなくなるまで（8）ELP生成物の良好な純度を確認し、それぞれ、残留可溶性および不溶性汚染物を除去回転させる。 SKGPG - （VGVPG）の配列と、このELPホモ、80-Yは、33.37 kDaで予想される分子量を有している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" width="600" /> 図4。温度プログラム濁によるELPの単独重合体のキャラクタリゼーション 1℃/分であって、a）ELPホモポリマーの割合で温度を上昇させながら。ELPのT tは 350nmでODを監視することによって決定された単一の急激な増加を示すODそのDEFイネス所与の濃度BでのそれらのT tは ）ELP転移の可逆性は、可逆性がベースラインに戻りODによって確認される温度を低下させながら25μM溶液の350nmでのODをモニタリングすることによって確認される。このELPホモポリマーは、シーケンスSKGPG-（VGVPG）80-Yを持っています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" width="600" /> 図5昇温比濁法と動的光散乱によるELPジブロックコポリマーのキャラクタリゼーション。ELPはナノスケール自己集合を起こし、このような球状ミセル、展示より複雑な濁度プロファイルに自己集合ELPジブロックコポリマーである。 <stronODのG&gt; A）の緩やかな増加を前にミクロンスケールの凝集体にELPの完全な凝集を示し、外径が急激に増加し、ミセルのユニマーからの移行を示している。B）DLS測定は、濁度プロファイルから推測動作を確認温度に対するR、Hの変化についての情報を提供することにより、25μmとソリューションを提供します。ここでのELPユニマーは、R、H〜8ナノメートルがあり、ミセルは、R、H〜25ナノメートルを持っています。このELPジブロック共重合体は、配列を有するGCGWPG - （VGVPG）60 - （AGVPGGGVPG）30-PGGS。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

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Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

エラスチン様ポリペプチドは、組換えタンパク質の精製からの薬物送達に至るまでのアプリケーションとの刺激応答性のバイオポリマーである。このプロトコルは、クロマトグラフィーへの単純な代替手段としての下限臨界溶液温度の相転移挙動を使用して大腸菌のエラスチン様ポリペプチドおよびそれらのペプチドやタンパク質融合物の精製および特性について説明します。

からのペプチドおよびタンパク質との組換えエラスチン様ポリペプチドおよびその融合の非クロマトグラフィー精製<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

non-chromatographic-purification-recombinant-elastin-like

Research

JoVE Journal

Biology

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

21.5K ビュー.  Duke University. エラスチン様ポリペプチドは、組換えタンパク質の精製からの薬物送達に至るまでのアプリケーションとの刺激応答性のバイオポリマーである。このプロトコルは、クロマトグラフィーへの単純な代替手段としての下限臨界溶液温度の相転移挙動を使用して大腸菌のエラスチン様ポリペプチドおよびそれらのペプチドやタンパク質融合物の精製お?...

ビデオ: Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

生物学

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

アフィニティータグ組換えタンパク質のハイスループット精製

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

エレクトロ作成のための迅速なプロトコル<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;と<em&gt;コレラ菌</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

で産生された組換えジスルフィド豊富な毒タンパク質に印加される高スループット定量的発現スクリーニングおよび精製<em&gt; E.大腸菌の</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

タンパク質の共発現の多面的メリットで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein belonging to the prion family. A chromatographic method for the purification of (His)6-tagged recombinant Shadoo expressed as inclusion bodies is described. The inclusion bodies are solubilized in 8 M urea and bound to a Ni2+-charged column to perform ion affinity chromatography. Bound proteins are eluted by a gradient of imidazole. Fractions containing Shadoo protein are subjected to size exclusion chromatography to obtain a highly purified protein. In the final step purified Shadoo is desalted to remove salts, urea and imidazole. Recombinant Shadoo protein is an important reagent for biophysical and biochemical studies of protein conformation disorders occurring in prion diseases. Many reports demonstrated that prion neurodegenerative diseases originate from the deposition of stable, ordered amyloid fibrils. Sample protocols describing how to fibrillate Shadoo into amyloid fibrils at acidic and neutral/basic pHs are presented. The methods on how to produce and fibrillate Shadoo can facilitate research in laboratories working on prion diseases, since it allows for production of large amounts of protein in a rapid and low cost manner.

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.

精製とのアミロイド線維にリフォールディング（彼）<sub&gt; 6</sub&gt;内封入体として発現された組換えShadooタンパク質をタグ付き<em&gt;大腸菌</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules derived from the parental cells. EVs function as intra- and inter-species communication vectors while also contributing to the interaction between bacteria and host organisms in the context of infection and colonization. Given the multitude of functions attributed to EVs in health and disease, there is a growing interest in isolating EVs for in vitro and in vivo studies. It was hypothesized that the separation of EVs based on physical properties, namely size, would facilitate the isolation of vesicles from diverse bacterial cultures. 
The isolation workflow consists of centrifugation, filtration, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography (SEC) for the isolation of EVs from bacterial cultures. A pump-driven tangential flow filtration (TFF) step was incorporated to enhance scalability, enabling the isolation of material from liters of starting cell culture. Escherichia coli was used as a model system expressing EV-associated nanoluciferase and non-EV-associated mCherry as reporter proteins. The nanoluciferase was targeted to the EVs by fusing its N-terminus with cytolysin A. Early chromatography fractions containing 20-100 nm EVs with associated cytolysin A - nanoLuc were distinct from the later fractions containing the free proteins. The presence of EV-associated nanoluciferase was confirmed by immunogold labeling and transmission electron microscopy. This EV isolation workflow is applicable to other human gut-associated gram-negative and gram-positive bacterial species. In conclusion, combining centrifugation, filtration, ultrafiltration/TFF, and SEC enables scalable isolation of EVs from diverse bacterial species. Employing a standardized isolation workflow will facilitate comparative studies of microbial EVs across species.

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Bacteria secrete nanometer-sized extracellular vesicles (EVs) carrying bioactive biological molecules. EV research focuses on understanding their biogenesis, role in microbe-microbe and host-microbe interactions and disease, as well as their potential therapeutic applications. A workflow for scalable isolation of EVs from various bacteria is presented to facilitate standardization of EV research.

大腸菌およびその他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離および精製(英語)

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...