当社は、資金調達の一部を提供するための米国国土安全保障省に感謝します。

1。細菌株およびDNAテンプレートの調製<ol><li> Eの細菌株を育てる大腸菌 O157：H7、非O157、一晩振とうしながら、このような37℃でのサルモネラや赤痢菌などの他の病原性種、。 </li><li>適切なキット（材料の表を参照）を使用して、メーカーの指示に従って細菌培養物からDNAを抽出する。 </li><li>分光光度計を用いてDNA濃度を測定する光学密度（OD 260）を測定する。 </li></ol> 2。定量PCRアッセイ用のプライマーおよびプローブの設計<ol><li> 大腸菌 O157：H7配列は、GenBank登録番号AE00517411からのものである。設計プライマーおよび（詳細は材料の表を参照）リアルタイムPCRのためのプライマーおよびプローブ設計のための適切なソフトウェアを用いてプローブ。 プライマーおよびプローブの配列は以下の通りである。Z3276フォワード（F）5&#39;-TATTCCGCGATGCTTGTTTTT-3 &#39; Z3276-リバース（R）5&#39;-ATTATCTCACCAGCAAACTGGCGG-3 &#39; Z3276-プローブ、FAM-CCGCAATCTTTCC-MGBNFQ </li><li>プライマー作業液として10μMの濃度で、その結果、水によるプライマ粉末を再構成する。 </li><li>プローブ作業ソリューションとして10μMのプローブを希釈します。標識プローブは、バッチで効力が異なります。そのため、最適な定量PCRパフォーマンスを使用する前に、標識プローブの各バッチを滴定。 </li></ol> 3。定量PCRアッセイ条件の設定<ol><li> 2回のリアルタイムPCRマスターミックスの25.0μlを、フォワードプライマー、200nMのリバースプライマー、200 nMの、および100nMのプローブから構成され、反応混合物を調製する。 </li><li> 50μlの最終容量に到達するために5サンプルDNA（100 PG）のμLと水の適切な量を追加します。 </li><li>非テンプレートコントロールのために、DNAサンプルを置き換えるために水5μlを使用する。 </li><li>変性のために10秒、60＆、95℃の40サイクル、続いて95°CでのTaqManの活性化のため10分間以下のように定量PCR条件を設定する＃176;℃アニーリング/伸長のための1分間。 </li></ol> 4。定量PCR感度テスト<ol><li> （;メッキにより約1.5×10 8 CFU / mlのOD 600 = 0.5）中期指数期の培養物から連続10倍希釈を作る。 </li><li>三連で96ウェルプレートに細胞希釈の100ミリリットルを追加します。 </li><li> 10分間2500×gでプレートを遠心分離する。 </li><li>各ウェルにDNA抽出溶液50mlを加える。 </li><li>マルチチャンネルピペットで再懸濁細胞ペレット。 </li><li> 10分間水浴中でプレートを沸かし、フィルムでプレートをシールし、2分間2500×gで遠心する。 </li></ol> 5。 PMA処理のための生死細胞混合物の準備<ol><li> Eの10ミリリットルを育てる大腸菌 O157：中期指数期まで37℃でH7および2つのアリコートに文化を分ける。 </li><li>死細胞のための水浴中で10分間の細胞の1アリコートを沸かし、生細胞のための他の分量にしておきます。 </li><li>確認する再LB寒天プレート上に細胞をプレーティングすることによって熱殺菌アリコートからの生細胞ません。 </li><li>ライブおよび熱殺菌細胞の2ミリリットルを取り、8の濃度に調整×10 6 CFU / LB培地でミリリットル。 8×10 は0〜8×10 6 CFU / mlの範囲の細胞希釈の4セットを作成。 </li><li> PMAまたは未処理で処理された生細胞の細胞希釈液の最初の2セットを使用してください。 </li><li>ライブや死細胞の混合物を作るために-細胞希釈の第3および第4のセットに、各細胞希釈（8×10 6 8×10 0）に8×10 6死細胞を追加します。 </li><li> PMAで希釈の第三のセットを扱い、制御のための希釈液の第4セットを使用する。 </li></ol> 6。 PMAで細胞を処理すること<ol><li> 10mMストック溶液と暗所で-20℃で保存を行うためにジメチルスルホキシド（または水）中にPMAを溶解する。 </li><li>生細胞、死細胞、および生細胞と死細胞中の混合物のアリコートを400μl3つの別々のマイクロチューブ。 </li><li> 50μMの最終濃度をそれぞれの細胞アリコートに10 mMのPMAの2.0ミリリットルを追加します。 </li><li>穏やかに数回、3秒毎に時間振とう、暗所で5分間、周囲温度でサンプルをインキュベートする。 </li><li> 96ウェルプレート上のサンプルを100μlを加える。 </li><li>光学フィルムでプレートをシールし、氷の上にプレートを置く。 </li><li> 20センチメートル650 Wのハロゲン光源からのプレートをセットし、露光用2分間さらす。 </li><li> 10分間2500×gでプレートを遠心し、静かに上清を廃棄し、慎重に吸収紙の上にプレートを排出。 </li><li> DNA抽出液50μlに再懸濁した細胞ペレットにピペッティングすることにより、マルチチャンネルピペットマンで20回ダウン。 </li><li>水浴中で10分間沸騰させ、フィルムでプレートをシールし、2分間2500×gで遠心分離します。プレート内の上澄み液は、PMAおよび定量PCRの準備ができてで処理した細胞からのDNAである。 </li><li> descriとして定量PCRを行う上記ベッド、DNAの5μLを使用。 </li></ol>

<ol>
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著者らは、開示することは何もありません。

研究の主な目的は、EにORF Z3276、独特の使用を含む大腸菌 O157：H7、定量PCRアッセイのための唯一のバイオマーカーとして。現在では、ほとんどのqPCRアッセイはそのようなのStx1、STX2、及びEAEA 1,2,5,6またはそのようにuidA 3,4、rfbEとはfliC遺伝子 の8,9などの共有表現型の遺伝子、病原性遺伝子をターゲットとしている。これらの遺伝子は、異なる種に存在しているかだけでなく、16の株として時折、種または株は間違いなく、このようなSTX 1およびSTX 2遺伝子として、病原性遺伝子（S）によって識別することができません。標的遺伝子についてrfbEとはfliCを使用して、両方の遺伝子は、完全な17の識別のために使用することが必要である。バイオマーカーとしてのORF Z3276を用いて、この定量PCRアッセイは高感度かつ特異的なアッセイ（ 表1）であることが実証されている。このアッセイは、O157を含む、ストリンジェントな包括性および排他性試験に供された：H7株（n = 3のサルモネラや赤痢菌など67）、100以上の非O157の菌株、および他の病原性種、。すべてO157：H7株を調べ正に検出され、交差反応性は、ORF Z3276は、E.を検出するための固有かつ強力なバイオマーカーであることを示す、非O157株（ 表1）から見られなかった大腸菌 O157：H7。 試験の他の目的は、選択的にDNA抽出の前にPMA処理により死細胞から生細胞を検出することである。 PMAは妥協膜と死細胞に浸透し、DNAに結合し、したがって、PCR 13における死細胞のDNA増幅を阻害することができます。我々は、PMA-処理手順を修飾し、手順96ウェルプレートフォーマットに適応している。露光の右強度は、最適な架橋効果を得ることが不可欠である。以前は、マイクロチューブは、このステップ13〜15で使用されている。しかし、別々のマイクロチューブライトEXで取り扱いが困難であるposure工程、これらのチューブは、最高のクロス好みを得ることは絶対に透過的ではありません。 96ウェルプレートを用いて、PMA-処理の効率を向上させる。これらの変化は、いくつかの方法でアッセイに影響を与える可能性がある：それらは、特に、多数のサンプルを用いて、より簡単に徹底的かつ均一な架橋効果を得ることが、処理された試料は、多数の検出のためのそれを可能にするために別のプレートから移動させることができるサンプルで、彼らは、全体のプロセスのための自動化の可能性と、このPMA-定量PCRアッセイを提供する。このPMA-定量PCRアッセイの制限は、PMA処理が幾分PCRアッセイのコストを増加させ、わずかにPCRアッセイの感度を減少させることである。

PCRは、E.の検出のための一般的な技術である大腸菌 O157：食品や環境サンプルからH7。 E.のための具体的なバイオマーカーを同定大腸菌 O157：H7はPCRアッセイで成功を検出するための重要な要因の一つである。 E.共通の検出のためのPCRアッセイに用いられるバイオマーカー大腸菌 O157：H7は、志賀毒素（STX 1及びSTX 2）1,2、 のuidA 3,4、EAEA 5,6、rfbE 7、およびはfliC遺伝子8,9が含まれています。これらのバイオマーカーを同定するための変数効率を提供することができるが、バイオマーカーのほとんどは、 大腸菌の検出のためのユニークなバイオマーカーとして使用することができない大腸菌 O157：H7。標的遺伝子の分化能力のこの不備は、E.の同定のためのより特異的かつ強力なバイオマーカー（単数または複数）を要求する大腸菌 O157：H7の10。 Eの遺伝子または仮想的なオープンリーディングフレーム（ORF）のための多数のプローブ大腸菌のO157：H7 11は我々の研究室からのDNAジェノタイピングマイクロアレイから国立バイオテクノロジー情報センターのGenBankデータベース内で検索して手がかりをもとに定量PCRアッセイのために設計されていた。線毛遺伝子11であるZ3276 ORFの配列は、定量PCR分析のために選択した。続いて、定量PCRアッセイは、このようなプライマーおよびプローブの濃度、ならびにアニーリングおよび伸長温度（データは図示せず）のようなPCRパラメータに関する多数の試験により開発された。例えば大腸菌などの参照株に対するインセンティブ包括と排他性試験後大腸菌 O157：H7のqPCRにおいて、非O157や赤痢菌の菌株、ORF Z3276を大腸菌の同定に特異的かつ強力な遺伝子マーカーとして同定された大腸菌 O157：H7。その後、我々はE.を識別するためのユニークなバイオマーカーを使用して、新しい定量PCR法を開発大腸菌 O157：H7。 Eの検出に別の課題大腸菌 O157：H7にfoを汚染ODSと環境サンプルからの生きた細胞の正確な決定である。死細胞およびPCRアッセイで生存能力を差別化することができないことからのDNAの拡張プレゼンス検出の生細胞数の過大評価、その結果、偽陽性測定値を引き起こす可能性があります。その結果、これは食中毒病原体12の正確な検出にPCRの使用量を制限します。死細胞のDNAを区別するための新しいアプローチは、ここ数年13〜15にPCR法でプロピジウムモノアジド（PMA）処理を組み合わせることによって行われています。 PMAは、死細胞の内側に移動して、光にさらされると、DNAにインターカレートすることができますが、それは生きた細胞のDNAと反応させるために生きている細胞の中に入ることはできません。このようにして、生細胞と死細胞のPMA処理混合物中で、死んだ細胞のDNAをPCR 13で増幅することができません。我々は選択的にライブEを検出するために、新たに開発された定量PCRアッセイでPMA処理を組み合わせた大腸菌 O157：H7の細胞。さらに、当社は、PMA-QPCR Aを行ったハイスループット検出が可能ssay。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="901">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">AB 7900HT Fast Real-time PCR system</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">2 x Universal master mix</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td align="right" style="width:171px;">4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">PrepMan Ultra</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td align="right" style="width:171px;">4318930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Primer Express</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="58" rowspan="2" style="height:58px;width:249px;">Probes</td>
			<td rowspan="2" style="width:164px;">ABI</td>
			<td>Top of Form</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">4316033 Bottom of Form</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">PMA</td>
			<td style="width:164px;">Biodium</td>
			<td align="right" style="width:171px;">40013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="87" rowspan="3" style="height:87px;width:249px;">Puregen cell and tissue kit</td>
			<td rowspan="3" style="width:164px;">Qiagene</td>
			<td>Top of Form</td>
			<td rowspan="3"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td align="right" height="29" style="height:29px;">158622</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">Bottom of Form</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">DU530 spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">Beckman</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">NanoDrop Technology</td>
			<td style="width:171px;">&#160;ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">650 w halogen light source</td>
			<td style="width:164px;">Britek</td>
			<td style="width:171px;">H8061S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Otptical Adhesive film</td>
			<td>ABI</td>
			<td align="right">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Optical 96-well reaction plate</td>
			<td>ABI</td>
			<td align="right">4316813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of live escherichia coli o157:h7 cells by pma-qpcr

ユニークなオープンリーディングフレーム（ORF）を、E. Z3276に特異的な遺伝子マーカーとして同定された大腸菌 O157：H7。定量PCRアッセイは、E.の検出のために開発された大腸菌 O157：ORF Z3276をターゲットにH7。このアッセイでは、我々は、 大腸菌のDNAのゲノムのいくつかのコピーと低く、検出することができます大腸菌 O157：H7。アッセイの感度および特異性は、E.、多数の集中的な検証テストにより確認された大腸菌 O157：H7株た（n = 369）および非O157菌株た（n = 112）。さらに、我々は死細胞から生細胞を選択的に検出するため新たに開発された定量PCRプロトコルでプロピジウムモノアジド（PMA）の手順を組み合わせている。 PMA処理死細胞からのDNAの増幅がほぼ完全にPMA処理生細胞からのDNAのほとんど影響増幅とは対照的に阻害された。さらに、プロトコルは変更され、多数のサンプルの容易かつ一貫性のある操作のための96ウェルプレートフォーマットに適合されている。 T彼の方法は、正確な微生物学および食品安全性、環境光源の疫学的監視に影響を与えることが期待される。

Eの検出大腸菌 O157：ORF Z3276を使用して定量PCRによりH7 このアッセイの重要な要因の一つは、定量PCRに用いられるZ3276プローブの感度および特異性である。それは、 大腸菌のDNAのゲノムのいくつかのコピーと低く、検出することができます大腸菌 O157：H7、図1Aに示すように、 6主要な非O157 STEC株、O104を含め、検討120非O157菌株の表1に示したように、H4株、 サルモネラ 、 赤痢菌株 、交差反応性は、認められなかった。 定量PCRとのPMA処理の組み合わせインキュベーションE.大腸菌 O157：H7、暗所で5分間PMA（50 mM）を有する細胞、2分間光に曝すは、PMA処理条件のために選択した。さらに、当社は、PMA処理手順を変更しました。架橋工程において使用される種々の透明なマイクロチューブと比較して、96ウェルプレートを、より効率的であることが見出された最適な架橋効果と、露光プロセス中に試料管を多数取り扱いよりも便利に達する。 定量PCRでのPMA処理生細胞と死細胞からのDNAの増幅この定量PCRアッセイに死細胞からのDNAの増幅のPMA媒介性阻害の効果は、2つの連続10倍生または死細胞由来のDNAの希釈液を用いて、図1に示した。結果は、PMA（赤い曲線）およびPMAなし（青の曲線）で処理した生細胞から生成された曲線は線形で互いにほぼ同じに見えることを示している。わずかなCT値の差は、PMA処理は、定量PCRにおける生細胞のDNAの増幅にほとんど影響を及ぼさなかったことを示唆し、そしてPMAでPMA（ 図1A）なしで処理した生細胞の間に示された。しかし、15 - CT値差（32,000倍）は、PMAで処理された死細胞間およびPMA、デモなしで示されたPMA処理を効率的に死滅した細胞（ 図1B）からのDNA増幅を抑制することがnstrating。 定量PCRに住んでいて、死んだ細胞混合物からの生細胞の検出生細胞希釈（8×10 0から 8×10 6 CFU）の2つのセットは、生/死細胞の混合物から生細胞を検出するために、PMAでまたはPMAなしで処理した。定量PCRの結果（ 図2A）は、未処理サンプル（青いバー）ように処理生細胞（紫色のバー）の数に関連するものとしてのCT値の並列逆進歩的な傾向を示した。処理された生細胞は、未処理の生細胞のものよりも幾分高いCT値が得られた。 CT値で同様の逆プログレッシブな傾向は、 図2（b）にも同様のPMA（緑色のバー）で処置した生/死細胞の混合物中の生細胞の実数で観察された。また、CT値のこの減少傾向であった106死細胞の存在にもかかわらず、混合物中の生細胞数で観察した。これらの結果は、死細胞からのDNAの増幅が効率的にPMA処理により抑制されたのに対し、生/死細胞混合物のCT値は、単独で生細胞からDNAを表したことを示した。しかし、PMAで処理された生/死細胞混合物のCT値が変動し、 図2（b）の混合物中の生細胞数（黄色のバー）に反映しなかったし。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50967/50967fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50967/50967fig1.jpg" /> 図1。生細胞と死細胞をPMAで、または定量PCRアッセイにおけるPMAなしで処理した。（A）のシリアルは、ライブEを 10倍に希釈した大腸菌 O157：H7の細胞希釈（8×10 0から 8×10 6 CFU）は、PMAでまたはPMAなしで処理した。CT値は、定量PCRアッセイにおける三つ組の平均CT値を表す。 （B）Q比較定量PCRアッセイでPMAでとPMAなしで処理生細胞と死細胞のDNA増幅の比較。 ΔRnのは、強度変化を蛍光に言及。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50967/50967fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50967/50967fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50967/50967fig2.jpg" /> 図2。 。PMA-qPCRの細胞培養の10倍希釈液（8×10 0から 8×10 6 CFU）の4組によるライブ/死細胞の混合物からの生細胞の分化が示されているように行われました。第二の細胞希釈DNA抽出の前にあったか、または未処理の細胞希釈物（A）第一セットは、PMAで処理した。（B）8×10 6個の死んだ細胞を示すように生/死細胞混合物の二組を作るために細胞希釈の第3および第4のセットと混合した。細胞混合物の一組は、PMAで処理し、他のセットは、DNA抽出の前に、PMAなしで処理した。各バーは、±SD三連の実験の平均CT値を表す。 <table><tbody><tr><td> 生体 </td><td> 血清型 </td><td> 試験した株の数 </td></tr><tr><td rowspan="15"> E.コリ </td><td> 2006ほうれん草O157：H7アウトブレイクの分離株</td><td> 186 </td></tr><tr><td> 2006タコベルO157：H7の分離株</td><td> 58 </td></tr><tr><td> 2006タコスジョンO157：H7の分離株</td><td> 11 </td></tr><tr><td>他のO157からDMB株コレクション：H7のアウトブレイク</td><td> 112 </td></tr><tr><td> O104：H4 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> O26 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> O103 </td><td> 13 </td></tr><tr><td> O111 </td><td> 24 </td></tr><tr><td> O121 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> O45 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> O145 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> O113 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> O91 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> O55 </td><td> 9 </td></tr><tr><td>その他</td><td> 19 </td></tr><tr><td rowspan="2"> サルモネラ </td><td>チフス菌</td><td> 1 </td></tr><tr><td>ニューポート</td><td> 2 </td></tr><tr><td> 志賀赤痢菌 </td><td> 6 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 赤痢ソンネ </td><td>不明</td><td> 2 </td></tr><tr><td> 赤痢菌 </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 赤痢菌boydii </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2">合計</td><td> 481 </td></tr></tbody></table> TE.同定するためのリアルタイムPCRアッセイで検証するために使用できる1。 株大腸菌 O157：H7。

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Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

定量PCRアッセイは、 大腸菌 O157を検出するために開発されました：H7は、固有の遺伝子マーカー、Z3276をターゲットに。定量PCRは、生細胞を検出するためのプロピジウムモノアジド（PMA）処理と合わせた。このプロトコルは、多数のサンプルの容易かつ一貫性のある操作のための96ウェルプレートフォーマットに変更され、適応されてい

ライブの検出<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt; O157：PMA-qPCRによりH7細胞

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

16.5K ビュー.  Food and Drug Administration. 定量PCRアッセイは、 大腸菌 O157を検出するために開発されました：H7は、固有の遺伝子マーカー、Z3276をターゲットに。定量PCRは、生細胞を検出するためのプロピジウムモノアジド（PMA）処理と合わせた。このプロトコルは、多数のサンプルの容易かつ一貫性のある操作のための96ウェルプレートフォーマットに変更され、適応されてい

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An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

の活性を測定するアッセイ大腸菌誘導性リジンDecarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

生物学

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

エレクトロ作成のための迅速なプロトコル<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;と<em&gt;コレラ菌</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

実装するためのプロトコル<em&gt;エシェリヒア·コリ</em合成生物学のための&gt;に基づくTX-TLの無細胞発現系

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

からのペプチドおよびタンパク質との組換えエラスチン様ポリペプチドおよびその融合の非クロマトグラフィー精製<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

タンパク質の共発現の多面的メリットで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

高感度免疫組織化学を使用してシトシンの修飾された形態の検出

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.