Bu protokol, pluripotent kök hücrelerden insan kan damarı organoidleri üretmemizi özetlemektedir. Bu teknoloji, vaskülogenez, anjiyogenez, vasküler hastalık ve vasküler patolojilerin yönlerini incelemek için kullanılabilir. Tekrarlanabilirlik ve yüksek verim doğasının yanı sıra birçok farklı kök hücre hattındaki tutarlılığı, bu tekniğin güçlü avantajlarıdır.
Uygulamaları açısından, önceki araştırmalarımızdan bazıları, diyabetik hasta vaskülatürü için morfolojik değişiklikleri incelemek için kan damarı organoidlerinin kullanımını özetlemekte ve diyabetik vaskülopati için ilaç tedavisi yollarını araştırmaktadır. İlk kök hücre popülasyonunu düzgün bir şekilde korumak, agregaların kümelenmesini önlemek ve homojen agrega çapına yakın sağlamak, bunlar iyi kan damarı organoidleri üretmek için gerekli faktörlerdir. % 70 akıcılığa sahip kültürlü insan pluripotent kök hücreleri veya hPSC'leri kullanarak agrega üretimine başlayın.
Bir pipet veya vakum sistemi kullanarak, kültür ortamını aspire edin ve hücreleri 37 santigrat derecede beş dakika boyunca inkübe etmeden önce bir mililitre hücre ayrışma reaktifi ile değiştirin. Bu arada, metin makalesinde belirtilen formülasyonu izleyerek, 15 mililitrelik bir konik tüpte gerekli miktarda toplama ortamını hazırlayın. Hücreleri inkübe ettikten sonra, hücreleri bir mililitre toplama ortamında askıya almadan önce hücre ayrışma reaktifini aspire edin.
Tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için içeriği yavaşça yukarı ve aşağı pipetin. Otomatik bir hücre sayma cihazı kullanarak veya mikroskop altında hücreleri sayın ve agrega oluşumu için gereken toplam hücre sayısını hesaplayın. Hücre canlılığı okuması, kümelerin düşük olduğu veya hiç olmadığı tek hücreli süspansiyonu gösterir.
Süpernatantı tüpten aspire edin ve hücre süspansiyonunun uygun hacmini 15 mililitrelik yüksek berraklıktaki polipropilen konik tüpteki toplama ortamına ekleyin ve homojen bir hücre dağılımı sağlamak için seyreltilmiş hücre süspansiyonunu hafifçe yukarı ve aşağı pipetin. Seyreltilmiş hücre süspansiyonunun üç mililitresini altı kuyucuklu ultra düşük bağlantı kültürü plakasının istenen her bir kuyucuğuna pipetin. Plakayı inkübatöre yerleştirin ve agregaların boyutunu ve şeklini korumak için herhangi bir rahatsızlığı en aza indirin.
Mezoderm ortamını metin makalesinde açıklandığı gibi hazırlayın. Hücrelerin tohumlanmasından 24 saat sonra, kültür plakasını inkübatörden çıkarın. Agregaları her bir kuyucuğun ortasında biriktirmek için plakayı dairesel bir hareketle döndürün.
Bir mililitrelik bir pipet kullanarak, agregaları ortamla birlikte her bir kuyucuktan ilgili konik tüpe yavaşça aktarın. Agregaların konik tüplerde oda sıcaklığında bir saat boyunca çökelmesine izin verin. Tortullandıktan sonra, süpernatantı bir pipet veya yüksek hassasiyetli bir aspire pompası ile, yerleşmiş agregaları rahatsız etmeden dikkatli bir şekilde aspire edin.
İki mililitre mezoderm indüksiyon ortamı ekleyerek her tüpteki agregaları tekrar askıya alın. Daha sonra, süspansiyonu her bir tüpten ultra düşük ataşman altı delikli kültür plakasının ilgili kuyucuğuna geri aktarın. Plakayı inkübatöre 37 santigrat derecede yerleştirin ve dördüncü güne kadar bırakın.
Dördüncü günde, kültür plakasını inkübatörden çıkarın, ardından her bir kuyucuğun ortasındaki agregaları toplamak için plakayı dairesel bir hareketle sallayın. Bir mililitrelik bir pipet kullanarak, agregaları çevreleyen ortamla birlikte her bir kuyucuktan ilgili konik tüpe nazikçe aktarın. Agregaların tüplerde çökelmesine izin vermek için 30 dakika boyunca bir zamanlayıcı ayarlayın.
Agregalar çökeldikten sonra, kültür plakalarını daha önce gösterildiği gibi hazırlayın ve altıncı güne kadar 37 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin. Agrega gömme ve kap filiz indüksiyonu için, buz üzerinde çalışırken hücre dışı matris çözeltisinin istenen son hacmini hazırlayın. ECM sandviçinin ilk katmanını oluşturmak için ECM'nin 500 mikrolitresini 12 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna pipetin.
İlk ECM tabakasının etkili polimerizasyonunu sağlamak için, plakayı iki saat boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. İki saatlik inkübasyonun sonuna doğru, kültür plakasındaki agregalarla çalışmaya başlayın. Agregaları ve ortamı her bir kuyucuktan karşılık gelen 15 mililitrelik bir konik tüpe nazikçe aktarmak için bir mililitrelik bir pipet kullanmadan önce agregaları her bir kuyucuğun ortasında toplayın.
Süpernatanı aspire etmeden önce agregaların 10 ila 15 dakika boyunca yerleşmesine izin verin. Bunu takiben, agregaları içeren konik tüpleri beş dakika boyunca buz üzerinde tutun. Hızlı ve dikkatli bir şekilde çalışarak, agregaları kabarcık oluşumu olmadan 500 mikrolitre ECM'de yeniden askıya alın.
Bir pipet kullanarak, ECM agrega süspansiyonunu, 12 delikli plakadaki kuyunun içindeki zaten polimerize edilmiş ilk ECM katmanının üzerine yerleştirin. Bu arada, filizlenme ortamını metin makalesinde açıklandığı gibi hazırlayın. 37 santigrat derecede iki saatlik inkübasyondan sonra, kan damarı farklılaşmasını sağlamak için kuyuya 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış bir mililitre filizlenme ortamı ekleyin.
Steril koşullar altında çalışırken, vasküler ağları içeren ECM filizlenme matrisini gevşetmek için steril bir spatulanın yuvarlak ucunu kullanın. Daha sonra, steril forseps ve steril bir spatulanın yuvarlak ucunu kullanarak, gevşetilmiş jel diski dikkatlice 10 santimetrelik bir kültür kabının kapağına aktarın. Jeli, istenen büyütme ve odaklanmaya ayarlanmış bir stereo mikroskop altında kapağın üzerine yerleştirin ve işlemde elde edilen vaskülarize olmayan ECM miktarını sınırlamaya çalışarak tek kan damarı ağlarını kesmek için steril iğneler kullanın.
İzole edilmiş organoidleri, üç mililitre filizlenme ortamı içeren ultra düşük bir bağlantı altı delikli plakanın bir kuyucuğuna yavaşça geri aktarın. Daha sonra, bir mililitrelik bir pipet kullanarak, tek organoidleri ultra düşük bir bağlantı 96 delikli plakadaki uygun sayıda kuyucuğa aktarın. Aktarıldıktan sonra, 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 200 mikrolitre önceden ısıtılmış filizlenme ortamı ekleyin.
96 kuyucuklu plakada izolasyondan dört ila altı gün sonra, organoidlerin onları düzeltmeye ve lekelemeye devam etmeden önce yuvarlak ve sağlıklı bir morfolojiye sahip olduklarından emin olun. İnsan kan damarı organoidinin veya hBVO'nun hPSC'lerden kademeli olarak ilerlemesinin görüntüleri parlak alan altında yakalandı. Sıfır gününde, hPSC kültüründen çapı 30 ila 100 mikron arasında değişen agregalar üretildi.
Agregaların büyüklüğünde ve şeklindeki ince değişiklikler, birinci günde mezoderm indüksiyonu sırasında gözlendi, bu da agregalar vasküler astarlamaya tabi tutuldukça dördüncü günde daha da değişti. Neredeyse radyal simetrik erken damar filizlenmesi, agregaların filizlenme matrisine gömülmesinden bir gün sonra, yedinci günde gözlemlenebilir. Sağlıklı organoid morfolojisi ve devam eden damar filizlenmesi, dokuzuncu günde görüldü ve organoid merkezdeki yoğun hücre yapılarının neredeyse ortadan kalktığı 10. günde filizlenen geç evre damarlara ilerledi.
Olgun insan kan damarı organoidlerinin tipik morfolojisi 15. günde açıkça gözlendi. 15. günde olgun hBVO'ların tüm montaj boyaması, CD31-pozitif olan ve PDGFR-beta-pozitif parazitler ve SMA-pozitif alfa-düz kas aktini ile çevrili geniş ve bağlı endotel ağı sergiledi. Endotel damar ağlarını kapsülleyen PDGFR-beta-pozitif ve SMA-pozitif duvar hücreleri iyi gözlenmiştir.
Damar ağlarını saran sürekli bir kollajen IV-pozitif bazal membran da gözlendi. Gömme adımı sırasında hücre dışı matrisin uygun bir polimerizasyonunun sağlanması, etkili kan damarı filizlenmesi için kritik öneme sahiptir. Araştırmacılar, kan damarı organoid teknolojimizi, daha önce avasküler olan beyin ve böbrek gibi önceden kurulmuş organoid modellerde erken vasküler bölmeler oluşturmak için kullandılar.
