Yazarlar Giulio Cossu, Martina Ragazzi ve tüm laboratuvara yararlı tartışma ve destek için ve Jeff Chamberlain'e MyoD-ER vektörünü nazik olarak sağladığı için teşekkür ediyor. Canlı hayvanları içeren tüm deneyler, ilgili tüm düzenleyici ve kurumsal kurumlara, yönetmeliklere ve yönergelere uygun ve uygun olarak tamamlanmıştır. Yazarlar laboratuvarındaki çalışmalar İngiltere Tıbbi Araştırma Konseyi, Avrupa Topluluğu 7th Framework projeleri Optistem ve Biodesign ve İtalyan Duchenne Ebeveyn Projesi tarafından desteklenmektedir.

1. Miyojenik ve Engraftment Potansiyelinin Değerlendirilmesi
<ol><li>
In vitro: MYOD kaynaklı farklılaşma<ol>
<li>Enfeksiyonun çokluğunu titreterek tamoksifen indüklenen MyoD-ER lentiviral vektör ile transdüklenmiş kararlı bir IDEM hücre hattı oluşturun (MOI; örneğin 1, 5 ve 50) 1.1.9 'da (MyHC) açıklanan lekeyi prosedürün verimliliğinin bir sonucu olarak kullanmak.</li>
		<li>3,5 cm'lik bir yemeği 1 ml% 1 Matrigel ile kaplayın ve 37 ° C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Plakayı orta, tohum 1 x 105 MyoD-ER transdüklenmiş IDEM'lerle 3,5 cm doku kültürü çanağı ile iki kez yıkayın ve büyüme ortamında 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Hücrelerin bir veya iki gün içinde birleştiği yerde olmasını bekleyin ve ardından büyüme ortamına 1 μM 4OH-tamoksifen ekleyin (1st doz).</li>
		<li>24 saat sonra, büyüme ortamını 1 μM 4OH-tamoksifen (2nd ve son doz) ile desteklenmiş farklılaşma ortamı ile değiştirin.</li>
		<li>Ortamın yarısını her gün taze farklılaşma ortamıyla değiştirin.</li>
		<li>Myotube oluşumu için günlük kültürleri inceleyin.</li>
		<li>Bir hafta sonra (farklılaşma ortamında 5 gün), plakaları PBS ile hafifçe yıkayın ve RT'de 5 dakika boyunca % 4 paraformaldehit ile sabitlayın.</li>
		<li>Miyotütlerin varlığını doğrulamak için miyosin ağır zincirine (MyHC) karşı antikorlarla immünoresans lekesi gerçekleştirin. Nükleer boya ile karşı çekim(örneğin Hoechst).</li>
	</ol>
</li>
</ol>Farklılaşmanın verimliliği MyHC pozitif hücrelerin içindeki çekirdek yüzdesi olarak değerlendirilir: verimlilik% >50 ise bir sonraki adıma geçin.
<ol start="2"><li>
In vivo: akut kas rejenerasyon modelinde engraftment MyoD-ER IDEM'lerin kas yenilenmesine in vivo katkısını değerlendirmek için, hücreler daha önce yeşil floresan protein (GFP) için doku içinde onları izlemeyi sağlayacak bir vektör kodlaması ile etiketlenmiştir. MyoD-ER GFP IDEM'leri daha önce bir miyotoksin (örneğin kardiyotoksin) ile yaralanan yetişkin murine kaslarına enjekteedilir. Ksenogeneik (HIDEM'ler gibi) veya genetik olarak manipüle edilmiş/düzeltilmiş hücrelere karşı bağışıklık reddini önlemek için immün yetmezlikli veya bağışıklığı baskılanmış fareler kullanmak gerekir.<ol>
<li>Nakilden 24 saat önce 3,5 μl/g 10 mg/ml tamoksifen (liposoluble form) periton içi enjeksiyon ile hayvanları ön işlemden geçirdi ve transplantasyon gününden önce büyüme ortamına 1 μM 4OH-tamoksifen (sulu form) ekleyerek hücreleri ön işlemden geçirdi.</li>
		<li>Hayvan tesisindeki cerrahi prosedürleri düzenleyen özel yönergeleri izleyerek fareye anestezi ve analjezi uygulayın.</li>
		<li>25 μl 100 μM kardiyotoksin enjekte edin (CTX; Naja mossambica mossambica'dan); DİkKAT: potansiyel olarak zararlı madde) tibialis ön (TA) kaslarında.</li>
		<li>Tamoksifen ve CTX ile hayvanları tedavi ettikten 24 saat sonra, hücreleri trypsinization ve count ile ayırın.</li>
		<li>Hücreleri 5 dakika boyunca 232 x g'da santrifüj edin.</li>
		<li>Hücre peletini Ca2+ve Mg2+içermeyen PBS, santrifüj ve ardından hücre peletini Ca2+ve Mg2+içermeyen PBS'de, her enjeksiyonun son hacmi olacak 106 hücre/30 μl'lik son konsantrasyona hafifçe yeniden boşaltın.</li>
		<li>29 veya 30 G iğneli bir şırınga kullanarak daha önce yaralanan kaslara 30 μl hücre süspansiyonu enjekte edin. İğneyi kastan çıkarırken özellikle dikkat edin. Hücre süspansiyonu iğnenin yolundan dökülmekten kaçınarak yavaşça yapın. Kontralasyon ta'yı nakletmeyin ve kontrol olarak kullanmayın, nakledilenin koşullarını çoğaltmak için30 μlCa 2 + ve   Mg2 +içermeyen PBS enjekte edin.</li>
		<li>Hayvanları altı gün boyunca tamoksifen ile tedavi edin ve iki ek gün boyunca analjezi(örneğin Carprofen) verin.</li>
		<li>Nakilden sonraki 14 günden itibaren kasları dışarı dökin. Protokol 4 ve 5'te ayrıntılı olarak belirtildiği gibi örnekleri işleyin ve analiz edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Kas Distrofisinin Fare Modellerinde Transplantasyon
Bu transplantasyon testi, kas distrofisinin fare modellerinde IDEM'lerin engrafmentinin kapsamının değerlendirilmesini sağlar. Aşağıdaki gibi tedavi edilen hayvanlar, hastalık fenotipinin fonksiyonel iyileştiriciliği için de değerlendirilebilir. Transplantasyondan sonraki iki haftadan itibaren fonksiyonel testler yapılabilir. Engraftasyon geliştirmek için 3x(yani toplam 3 enjeksiyon / kas için) için her üç haftada bir ön-iletim koşu bandı egzersizi (Protokol 3'te açıklandığı gibi) ve / veya seri hücre enjeksiyonları yapmayı düşünün.
<ol><li>Kas içi transplantasyon<ol>
<li>Nakilden 24 saat önce 3,5 μl/g 10 mg/ml tamoksifen (liposoluble formülasyonu) periton içi enjeksiyon ile hayvanları ön işlemden geçirdi ve transplantasyon gününden önce büyüme ortamına 1 μM 4OH-tamoksifen (sulu formülasyon) ekleyerek ön işlem hücrelerine başvurdu.</li>
		<li>Trypsinization ile ayırın, hücreleri 5 dakika boyunca 232 x g'da sayın ve santrifüj edin.</li>
		<li>Hücre peletini Ca2+ve Mg2+içermeyen PBS, santrifüj ve ardından peleti Ca2+ve Mg2+içermeyen PBS'de 106 hücre/30 μl konsantrasyonda yeniden biriktirin.</li>
		<li>Analjeziyi uygulayın ve hayvanın cildini (isteğe bağlı) povidon iyot veya klorexidin bazlı bir dezenfektanla dezenfekte edin. Bu aynı zamanda tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GC) ve kuadriseps femoris (QC; özellikle vastus intermedius) kaslarını lokalize etmeye yardımcı olacaktır.</li>
		<li>29 veya 30 G iğneli bir şırınga kullanarak kaslara 30 μl hücre süspansiyonu enjekte edin. TA için, iğnenin 5 mm'sini tibiaya göre 15° eğimli proksimal tendonun (kraniosaudal yön) yerleştirilmesinin 2 mm altına yerleştirin ve iğneyi geri alırken hücre süspansiyonunu yavaşça enjekte edin (şırıngayı hala kasın içinde 2 mm iğne ile boşaltın). GC ve QC için, TA için ayrıntılı olarak aynı prosedürü tekrarlayın, ana fark, iğnenin GC için Aşil tendonunun miyotendinöz kavşağından 2 mm ve QC için distal tendonun 2 mm üzerinde kaudokranial yerleştirilmesidir (uyluk kemiğine göre 15 ° eğim). Hücre süspansiyonun iğnenin yolundan dökülmemesi için iğneyi kastan çıkarırken dikkat edin. SORUN GİDERME: Düşük engraftment durumunda, 3 x 10 5 hücre/10 μl ile7 yavru (1-2 haftalık) farelere enjekte etmeyi düşünün (bu durumda tamoksifen'in deri altından uygulanması gerektiğini unutmayın).</li>
	</ol></li>
	<li>İntra-arteriyel transplantasyon Protokolün bu kısmı, MİDEM'lerin ve HIDEM'lerin arteriyel dolaşımda teslim edilebilmelerinin değerlendirilmesine, damar duvarını geçmesine ve enjeksiyon bölgesine kadar olan kaslarda iskelet kaslarının yenilenmesine katkıda bulunmasını sağlar.<ol>
<li>2.1.1 adımında yukarıda açıklandığı gibi hayvanları ve hücreleri ön işlemden geçin.</li>
		<li>40 μm hücre süzgeçli trypsinization ve filtre ile ayırın (tamoksifen'e bir gecede maruz kalmanın bitişik hücrelerden füzyon ve miyotüp oluşumunu yönlendirebileceği olası bir durumda kümeleri hücre süspansiyonundan çıkarmak için) hücreleri 5 dakika boyunca 232 x g'da sayar ve santrifüjler</li>
		<li>Hücre peletini Ca2+- ve Mg2+içermeyen PBS, santrifüjde yıkayın ve ardından peleti Ca2+ve Mg2+içermeyen PBS'de 0.2 International ile yeniden satın Sodyum heparin birimleri (isteğe bağlı) 106 hücre/50 μl nihai hücre konsantrasyonuna. Hücre süspansiyonunun dağılımını görselleştirmek için çözeltiye %10 Patent mavi boyası (son konsantrasyon: normal salin veya Ca2+- ve Mg 2+ içermeyen PBS'de1,25mg/ml) ekleyin.</li>
		<li>Belirli kurumsal hayvan tesisinde cerrahi prosedürleri düzenleyen yönergelere göre fareye anestezi ve analjezi uygulayın.</li>
		<li>Kasık bölgesini tıraş edin (femoral veya Scarpa üçgeni olarak da bilin) ve cildi povidon iyot veya klorheksidin bazlı bir dezenfektanla dezenfekte edin.</li>
		<li>5-7 mm'lik bir kesi yapın ve femoral demeti lokalize edin: damar, arter ve sinir (sinir atardamara ve damara medial olarak yanal olarak uzanır).</li>
		<li>Paketi tostikülle kaplayan bağ fasyasını yavaşça çıkarın.</li>
		<li>Femoral damarı ve siniri, aralarındaki bir tostisin (veya 30 G iğnenin) ucunu hafifçe sokarak ve deliği kademeli olarak büyüterek arterden ayırın. SORUN GİDERME: Femoral damar kırılgandır: femoral arterden ayırması sırasında tokmaklarla sıkıştırmamaya dikkat edin. Kanama durumunda, kanı steril gazlı bezle boşaltın ve hemostazı kolaylaştırmak için bir mikro koterizatör kullanın.</li>
		<li>Atardamarı bir ucuyla kaldırıp diğer ucuyla sıkıştırın.</li>
		<li>Atardamarı 30 G iğne ile donatılmış bir şırınga ile delin. Yaklaşık 5 μl/sn infüzyon hızında, kenetlenmiş bölgenin aşağısına 50 μl hücre süspansiyonu enjekte edin. SORUN GİDERME: Enjeksiyondan önce şırınnadaki hücreleri dikkatlice yeniden biriktirin: Şırındının içindeki hücrelerin çökeltmelerini ve hava kabarcığı oluşumunu önlemek hayati önem taşır. Femoral arterin çapı 30 G'lık bir iğneden biraz daha küçüktür: iğneyi yerleştirirken atardamarı kesilmemeye dikkat edin. Patent mavi boyası enjeksiyonun etkinliğini tanımaya izin verir: doğru enjekte edilirse, tüm uzuv hızla açık maviye döner.</li>
		<li>Uzuvdaki kan dolaşımını geri kazanmak için iğneyi ve tokaları yavaşça atardamardan çıkarın.</li>
		<li>Kanamayı önlemek ve/veya gerektiği gibi dağlamak için steril gazlı bezle basınç uygulayın.</li>
		<li>Yarayı dikin ve anesteziden iyileşene kadar hayvanları izleyin.</li>
		<li>Analjeziyi 3 gün boyunca uygulayın ve yarayı günlük olarak inceleyin (yara enfeksiyonu durumunda bunu hayvan tesisi personeliyle tartışın ve gerektiği gibi antibiyotikler sürün).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Nakledilen Distrofik Hayvanlarda Sonuç Önlemleri: Koşu Bandı Testi
Hücre naklinden sonraki iki haftadan başlayarak, tedavi edilen farelerin motor kapasitesinin fonksiyonel olarak iyilaştırılmasını koşu bandı testleri ile değerlendirmek mümkündür. Bu test, tedavi edilen farelerin egzersiz toleransının / dayanıklılığının değerlendirilmesini sağlar. Bir fare, 3 ardışık mekanik uyaran serisinden (her 5 saniyede bir) sonra koşu bandını yeniden kurmaya çalışmadan, 5 saniyeden fazla dinlenme alanında uzandığında yorgun olarak kabul edilir. Temel ölçümler tedaviden yaklaşık bir ay önce başlar ve test edilen her bir hayvanın iyileştirilmesini değerlendirmek için kullanılır. Bu testi lif kırılganlığı, kuvvet iyileştirme, engraftasyon, nakledilen hücrelerin farklılaşması ve nakledilen kasların morfolojik ameliorasyonunu izlemek için ek testler takip edebilir (bkz. Tartışma).
<ol><li>hayvanları (genellikle üç grup: tedavi edilmiş, işlenmemiş ve vahşi tip / distrofik olmayan kontroller) ilk ölçümden önce egzersize alıştırın: koşu bandını 10 dakika boyunca 6 m / dak hızında ayarlayın. İşlemi bir hafta boyunca her gün tekrarlayın. SORUN GİDERME: Sirkadiyen döngüler nedeniyle önyargıları önlemek için tüm ölçümleri günün aynı saatinde kaydedin.</li>
	<li>Hayvanları daha önce 10 ° eğimle kurulmuş olan koşu bandına yerleştirin.</li>
	<li>Koşu bandını 6 m / dk başlangıç hızıyla açın (hayvanların egzersize başlamak istememesi durumunda hafif bir mekanik uyaran sağlayın).</li>
	<li>Zamanlayıcıyı başlatın ve hızı her 2 dakikada bir 2 m/dk artırın.</li>
	<li>Bir hayvan koşu bandını yeniden birleştirmeye çalışmadan 5 saniyeden fazla dinlenme alanında uzanır uzanmaz, egzersizin yeniden başlatılmasını teşvik etmek için bir çubukla hafifçe dokunun (yukarıya bakın).</li>
	<li>Her hayvanın performansını (zaman ve veya mesafe) kaydedin.</li>
	<li>Ölçümleri haftalık olarak veya her 10 günde bir en az 3x boyunca tekrarlayın.</li>
	<li>Transplantasyondan sonra aynı işlemi tekrarlayın.</li>
	<li>Her hayvanın ölçümünü temel performansıyla karşılaştırarak performans verilerini analiz edin. Grafikteki değerleri taban çizgisine göre ortalama motor kapasitesinin yüzdesi olarak çizmeyi ve grupları karşılaştırmak için uygun test sonrası uygun bir anova testi ile analiz etmeyi öneriyoruz.</li>
</ol>SORUN GİDERME: en az 5 yaş, genotip ve cinsiyete uygun hayvan/grup kullanın ve nakilden sonra ölçümleri en az 3 kat tekrarlayın.
4. Nakledilen Kaslarda Hücre Engraftasyonu ve Farklılaşmanın Değerlendirilmesi
Nakledilen ve kontrol kasları uygun zaman noktasında toplanır (kısa süreli engraftasyon analizi için <2 gün, orta vadeli için 2-3 hafta ve uzun süreli analiz için >1 ay). Nakledilen hücreler GFP ile etiketlenmişse, yeni izole edilmiş kaslardaki engrafitasyon UV donanımlı bir stereomikroskop altında doğrudan floresan ile değerlendirilebilir.
<ol><li>Tragachanth sakızında dikey eksen boyunca yeni izole edilmiş kasları döşeyin ve yönlendirin (%6 w/v)</li>
	<li>Numuneleri önlüklü izopentan içinde bir dakika susuz bırak, sıvı nitrojende en az 2 dakika dondurun ve depolama için hemen -80 ° C'ye yerleştirin.</li>
	<li>Polarize slaytlarda 7 μm kalınlığında bölüm elde etmek için numuneleri kriyostatla işleyin. 30-40 bölüm / slayt ile yaklaşık 8-10 slayt toplayarak, slaytlarda kasların çoğunu örnekleyin. Moleküler biyoloji/ biyokimya tahlilleri yapmak için 1,5 ml'lik bir tüpe bir dizi bölüm toplanması tavsiye edilir.</li>
	<li>Deneysel kuruluma bağlı olarak hücre engraftmentini farklı immünofluoresan lekeleme ile değerlendirin. Örneğin, Sgca-null/scid/bg farelerde HIDEM nakli durumunda, leke bölümleri: a) Aşılanmış insan hücre çekirdeklerini tespit etmek için Lamin A/C'ye karşı bir antikor; b) Kasın genel yapısını görselleştirmek için Laminin'e karşı bir antikor; ve c) Distrofik hayvanda bulunmayan proteinin donör türevi restorasyonu tespit etmek için Sgca'ya karşı bir antikor.</li>
	<li>Floresan mikroskobu kullanarak, kas liflerinin içindeki ve dışındaki kas bölümü başına donör çekirdeği sayısını ve kesit başına donör türevli iskelet miyofiberlerinin sayısını ölçün.</li>
</ol>5. Kas Histopatolojisi
Histopatolojik analizler nakledilen kasın morfolojik yapısının değerlendirilmesini sağlar. Hücre tedavisi yaklaşımının bir sonucu olarak doku yapısında mimari iyileşme bekmektedir.
<ol><li>Yeni izole edilmiş kasları 4 °C'de 1 saat boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitle.</li>
	<li>Numuneleri artan bir sakkaroz gradyanı ile susuzluktan arındırın(örneğin% 7.5-15-30 w/v).</li>
	<li>Kasları gece boyunca en yüksek sakkaroz çözeltisinde bırakın.</li>
	<li>Örnekleri Doku Tek OCT'ye gömün, OCT katılaşana kadar ön izopente yerleştirin (numunelerin tamamen batırılmasını önleyerek), en az 2 dakika sıvı nitrojende dondurun ve depolama için hemen -80 °C'ye yerleştirin.</li>
	<li>Yukarıda açıklandığı gibi 7 μm kalınlığında bölüm elde etmek için numuneleri kriyostatla işleyin.</li>
	<li>Bölümleri standart üretici protokollerine göre hematoksilin ve eozin veya Masson'un üç renkli ile lekelenin.</li>
</ol>Hematoksilin ve eozin boyama, aşağıdakiler gibi yenileyici kasların ayırt edici özelliklerinin hesaplanmasına olanak tanır: a) miyofiberlerin sayısı; b) kesit alanı; c) merkezi bir çekirdek içeren miyofiberlerin sayısı. Masson'un üç renklisi, iskelet miyofiberlerinin kapladığı toplam alanı görüntünün toplam alanından çıkararak fibrotik indeksi hesaplamak için kullanılır: ortaya çıkan alan esas olarak kasın bağ ve yağ sızmasını yansıtır. Görüntülerdeki tüm analizler, ölçüm aracı ve hücre sayacı eklentisi ile ImageJ yazılımı (NIH) kullanılarak gerçekleştirilebilir.

<ol>
	<li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+of+human+skeletal+muscle+are+myogenic+precursors+distinct+from+satellite+cells.">Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).</li><li>Minasi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meso-angioblast:+a+multipotent,+self-renewing+cell+that+originates+from+the+dorsal+aorta+and+differentiates+into+most+mesodermal+tissues.">The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues.</a> Development. 129, 2773-2783 (2002).</li><li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+resident+in+postnatal+skeletal+muscle+differentiate+into+muscle+fibres+and+generate+satellite+cells.">Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells.</a> Nat. Commun. 2, 499 (2011).</li><li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repairing+skeletal+muscle:+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).</li><li>Sampaolesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+of+alpha-sarcoglycan+null+dystrophic+mice+through+intra-arterial+delivery+of+mesoangioblasts.">Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts.</a> Science. 301, 487-492 (2003).</li><li>Sampaolesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoangioblast+stem+cells+ameliorate+muscle+function+in+dystrophic+dogs.">Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs.</a> Nature. 444, 574-579 (2006).</li><li>Tedesco, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Genetically+Corrected+Human+iPSC-Derived+Progenitors+in+Mice+with+Limb-Girdle+Muscular+Dystrophy.">Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Tedesco, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-mediated+transfer+of+a+human+artificial+chromosome+ameliorates+muscular+dystrophy.">Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy.</a> Sci. Transl. Med. 3, (2011).</li><li>Lattanzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+myogenic+conversion+of+human+fibroblasts+by+adenoviral+vector-mediated+MyoD+gene+transfer.+An+alternative+strategy+for+ex+vivo+gene+therapy+of+primary+myopathies.">High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies.</a> J. Clin. Invest. 101, 2119-2128 (1998).</li><li>Chaouch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+skin+fibroblasts+expressing+conditional+MyoD+as+a+renewable+and+reliable+source+of+converted+human+muscle+cells+to+assess+therapeutic+strategies+for+muscular+dystrophies:+validation+of+an+exon-skipping+approach+to+restore+dystrophin+in+Duchenne+muscular+dystrophy+cells.">Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells.</a> Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).</li><li>Kimura, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-lineage+regulated+myogenesis+for+dystrophin+replacement:+a+novel+therapeutic+approach+for+treatment+of+muscular+dystrophy.">Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2507-2517 (2008).</li><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+past,+present,+and+future.">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).</li><li>Wu, S. M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+potential+of+induced+pluripotent+stem+cells+for+regenerative+medicine.">Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine.</a> Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).</li></ol>

F.S.T. uluslararası patent başvurusunda bulunmuştur (hayır. PCT/GB2013/050112) bu makalede açıklanan stratejinin bir bölümünü içerir. Promimetic ve DWC ltd. tarafından araştırmaları için fon aldı.

iPSC'ler, kendi kendini yenileme potansiyellerini korurken süresiz olarak genişletilebilir ve böylece çok çeşitli hücre soylarına farklılaşmaya yönlendirilebilir12. Bu ve diğer nedenlerle iPSC türevi kök/progenitör hücreler otolog gen için umut verici bir kaynak olarak kabul edilir ve hücre tedavisi yaklaşır13. Authors'ın daha önce yayınlanan bir çalışması, perisit türevi MAB'lerin (IDEM'ler)kine benzer bir fenotipe sahip iPSC'lerden fare ve insan miyojenik atalarının n...

Mezoangioblastlar (MAB'ler) perisitlerin bir alt kümesinden elde edilen damarla ilişkili kas progenitörleridir1-3. MAB'lerin uydu hücreleri4 gibi kanonik kas progenitörlerine göre temel avantajı, intra-arteriyel olarak teslim edildiğinde damar duvarını geçme yeteneklerinde bulunur ve bu nedenle hücre tedavisi protokollerinde iskelet kası yenilenmesine katkıda bulunur. Bu özellik kas distrofisinin hem murine hem de köpek modellerinde değerlendirilmiş ve onaylanmıştır1,5,6. Bu preklinik çalışmalar, Duchenne musküler distrofisi olan çocuklarda donör HLA-özdeş MAB'lerin intra-arteriyel nakline dayanan ilk in-man faz I/II klinik çalışmasının temellerini oluşturmuştur (EudraCT no. 2011-000176-33; şu anda İtalya Milano San Raffaele Hastanesi'nde devam etmektedir). Tüm vücudun kasını tedavi etmek için milyarlarca hücreye ihtiyaç duyulan hücre tedavisi yaklaşımlarının ana engellerinden biri, "tıbbi ürünün" (hücreler) sınırlı proliferatif potansiyelidir. Ayrıca son zamanlarda, uzuv-korse kas distrofisi 2D'de (LGMD2D) ortaya çıktığı için bazı kas distrofisi formlarından etkilenen hastalardan MAB elde etmenin mümkün olmadığı gösterilmiştir; OMIM #608099)7.
Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, MAB benzeri kök / progenitör hücreleri insan ve murine iPSC'lerden türetmek için bir protokol yakın zamanda kurulmuştur7. Bu prosedür, yetişkin kas türevi MAB'lere oldukça benzeyen vasküler gen imzası ve immünofenotip ile kolayca genişletilebilir hücre popülasyonları oluşturur. Miyojenik düzenleyici faktör MyoD'nin ifade edilmesi üzerine, hem murin hem de insan IDEM'leri (sırasıyla MİDEM'ler ve HIDEM'ler) terminal iskelet kas farklılaşmasına uğrar. Bu amaca ulaşmak için IDEM'ler, MyoD ekspresyonünü, yaklaşık olarak veya8-10indüklenebilir bir şekilde yönlendirebilen vektörlerle transdüklenebilir. Östrojen reseptörü (MyoD-ER) ile kaynaşmış MyoD cDNA içeren bir lentiviral vektör kullanılır, böylece tamoksifen (östrojen analogu) uygulama11üzerinde nükleer translokasyonuna izin verir. Bu strateji, yüksek verimli7ile hipertrofik çok noktayaükle edilmiş miyotütlerin oluşumuyla sonuçlanır. Özellikle, IDEM'ler nontumorijeniktir, transplantasyon sırasında konak kaslarının içinde yer alabilir ve farklı vektörler(örneğin lentivirüsler veya insan yapay kromozomları) kullanılarak genetik olarak düzeltilebilir ve gelecekteki otolog terapötik stratejilerin önünü açabilir. IDEM'lerin türetmesi, karakterizasyonu ve nakli yukarıdaki yayında açıklanmıştır7. Bu protokol makalesi, IDEM'lerin in vitro miyojenik farklılığını değerlendirmek için yapılan tahlilleri ve daha sonra yapılan sonuç ölçümlerini, kas yenilenmesinin fare modellerinde transplantasyonlarının etkinliğini test etmek için detaylandırmaktadır.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MegaCell DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0090L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Calcium/Magnesium free</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutammine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilline/Streptomicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS (Insulin-Transferrin-Selenium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fer-In-Sol</td>
			<td>Mead Johnson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferlixit</td>
			<td>Aventis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01257-10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5900-10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human bFGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>AA 10-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grow factors-reduced Matrigel</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium heparin</td>
			<td>Mayne Pharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>HARMFUL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patent blue dye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>19, 821-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>P001</td>
			<td>HARMFUL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OH Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLv-CMV-MyoD-ER(T)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>26809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiotoxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9759</td>
			<td>HARMFUL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragachant gum</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>104792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopenthane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24,872,323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27,480,294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarized glass slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HHS32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson&#39;s trichrome</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>04-010802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>MF20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti Lamin A/C antibody</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NLC-LAM-A/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4/11/13</td>
			<td>Cappel</td>
			<td>559762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma fluka</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti Laminin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MATERIALS AND EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adsorbable antibacteric suture 4-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>vcp310h</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G needle syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treadmill</td>
			<td>Columbus instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steromicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane unit</td>
			<td>Harvad Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optics</td>
			<td>Euromecs (Holland)</td>
			<td>EK1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Vet Tech</td>
			<td>C17A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>11REF050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td></td>
			<td>5/45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High temperature cauteriser</td>
			<td>Bovie Medical</td>
			<td>AA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MEDIA COMPOSITION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Media composition is detailed below. 
			HIDEMs growth medium:
			<ul>
				<li>MegaCell Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (MegaCell DMEM)</li>
				<li>5% fetal bovine serum (FBS)</li>
				<li>2 mM glutamine</li>
				<li>0.1 mM &#946;-mercaptoethanol</li>
				<li>1% non essential amino acids</li>
				<li>5 ng / ml human basic fibroblast growth factor (bFGF)</li>
				<li>100 IU ml penicillin</li>
				<li>100 mg / ml streptomycin</li>
			</ul>
			Alternatively, if some of the above reagents are not available, HIDEMs can be grown in:
			<ul>
				<li>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</li>
				<li>10 % FBS</li>
				<li>2 mM glutamine</li>
				<li>0.1 mM &#946;-mercaptoethanol</li>
				<li>1% Non essential amino acids (NEAA)</li>
				<li>1% ITS (insulin / transferrin / selenium)</li>
				<li>5 ng / ml human bFGF</li>
				<li>100 IU ml penicillin</li>
				<li>100 mg / ml streptomycin</li>
				<li>0.5 &#956;M oleic and linoleic acids</li>
				<li>1.5 &#956;M Fe2+ (Fer-In-Sol)</li>
				<li>0.12 &#956;M Fe3+ (Ferlixit)</li>
			</ul>
			MIDEMs growth medium:
			<ul>
				<li>DMEM</li>
				<li>20 % FBS</li>
				<li>2 mM glutamine</li>
				<li>5 ng / ml human bFGF</li>
				<li>100 IU ml penicillin</li>
				<li>100 mg / ml streptomycin</li>
			</ul>
			Differentiation medium:
			<ul>
				<li>DMEM</li>
				<li>2 % Horse Serum (HS)</li>
				<li>100 IU ml penicillin</li>
				<li>100 mg / ml streptomycin</li>
				<li>2 mM glutamine</li>
			</ul>
			 
			 
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media.

transplantation of induced pluripotent stem cell-derived mesoangioblast-like myogenic progenitors in mouse models of muscle regeneration

Hasta kaynaklı iPSC'ler, gelecekteki otolog hücre tedavisi protokolleri için paha biçilmez bir hücre kaynağı olabilir. Perisit türevi mezoangioblastlara benzer iPSC türevi miyojenik kök/progenitör hücreler (iPSC türevi mezoangioblast benzeri kök/progenitör hücreler: IDEM'ler) farklı kas distrofisi formlarından etkilenen hastalardan oluşturulan iPSC'lerden kurulabilir. Hastaya özgü IDEM'ler genetik olarak farklı stratejilerle düzeltilebilir(örneğin lentiviral vektörler, insan yapay kromozomları) ve miyojenik farklılaşma potansiyellerinde miyogenez regülatörü MyoD'nin aşırı ifade edilmesi üzerine geliştirilebilir. Bu miyojenik potansiyel daha sonra spesifik farklılaşma tahlilleri ile in vitro olarak değerlendirilir ve immünofolüoresans ile analiz edilir. IDEM'lerin rejeneratif potansiyeli in vivoolarak daha da değerlendirilir Akut ve kronik kas yenilenmesini gösteren iki temsili fare modelinde intramüsküler ve intra-arteriyel transplantasyon üzerine. İDEM'lerin konak iskelet kasına katkısı daha sonra nakledilen farelerde farklı fonksiyonel testlerle doğrulanır. Özellikle, hayvanların motor kapasitesinin iyilaştırılması koşu bandı testleri ile çalışılmaktadır. Hücre engraftasyonu ve farklılaşması daha sonra nakledilen kaslarda bir dizi histolojik ve immünofluoresans tahlilleri ile değerlendirilir. Genel olarak, bu makalede IDEM'lerin farklılaşma kapasitesini değerlendirmek için şu anda kullanılan tahliller ve araçlar açıklanmaktadır, hücre naklinin etkinliğini analiz etmek için transplantasyon yöntemlerine ve sonraki sonuç önlemlerine odaklanmaktadır.

Bildirilen temsili sonuçlar, Şekil 1'deiş akışında gösterilen ana in vitro / in vivo testlerini izler. 4OH-tamoksifen uygulamasından sonra 48 saat MyoD pozitif çekirdekler, kültürdeki MyoD-ER transdüklenmiş IDEM'lerde tanımlanabilir (Şekil 2A). Hücreler daha sonra kaynaştırılır ve çok noktaya çok yönlü miyotüplere farklılaştırılır (Şekil 2B). Akut kas yaralanmasının bir murine modeline intramüsküler olarak nakledildiğinde, IDE...

Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration at JoVE.com

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi miyojenik progenitörler, kas distrofilerini tedavi etmek için hücre tedavisi stratejileri için adaylar vaat ediyor. Bu protokol, akut ve kronik kas yenilenmesinin fare modellerinde iPSC türevi mezoangioblastların (bir tür kas progenitörleri) engraftasyonunu ve farklılaşmasını değerlendirmek için gereken transplantasyon ve fonksiyonel ölçümleri açıklar.

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

transplantation-induced-pluripotent-stem-cell-derived-mesoangioblast

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.4K Görüntüleme.  University College London. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi miyojenik progenitörler, kas distrofilerini tedavi etmek için hücre tedavisi stratejileri için adaylar vaat ediyor. Bu protokol, akut ve kronik kas yenilenmesinin fare modellerinde iPSC türevi mezoangioblastların (bir tür kas progenitörleri) engraftasyonunu ve farklılaşmasını değerlendirmek için gereken transplantasyon ve fonksiyonel ölçümleri açıklar.

Video: Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

Kemik Rejenerasyon için İnsan perivasküler Kök Hücre kullanın

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Biyomühendislik

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Geliştirme, Genişleme ve<em&gt; In vivo</em&gt; İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) den İnsan NK Hücrelerinin İzleme ve ve Bağlı Pluripotent Kök Hücre (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Doku Seviyesi Mekaniğinin Kontrol Altına Almak İçin Uyumlu Yüzeylerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kolonilerinin Geometrisinin Desenlemi

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable diseases, for the reconstitution and regeneration of injured tissues and for the development of new drugs. Despite all the advantages related to the use of iPSCs, such as the low risk of rejection, the lessened ethical issues, and the possibility to obtain them from both young and old patients without any difference in their reprogramming potential, problems to overcome are still numerous. In fact, cell reprogramming conducted with viral and integrating viruses can cause infections and the introduction of required genes can induce a genomic instability of the recipient cell, impairing their use in clinic. In particular, there are many concerns about the use of c-Myc gene, well-known from several studies for its mutation-inducing activity. Fibroblasts have emerged as the suitable cell population for cellular reprogramming as they are easy to isolate and culture and are harvested by a minimally invasive skin punch biopsy. The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the whole procedure, from sample processing to obtain cell cultures, choice of reagents and supplies, cleaning and preparation, to cell reprogramming by the means of a commercial non-modified RNAs (NM-RNAs)-based reprogramming kit. The chosen reprogramming kit allows an effective reprogramming of human dermal fibroblast to iPSCs and small colonies can be seen as early as 24 h after the first transfection, even with modifications with the respect to the standard datasheet. The reprogramming procedure used in this protocol offers the advantage of a safe reprogramming, without the risk of infections caused by viral vector-based methods, reduces the cellular defense mechanisms, and allows the generation of xeno-free iPSCs, all critical features that are mandatory for further clinical applications.

Cell reprogramming requires the introduction of key genes, which regulate and maintain the pluripotent cell state. The protocol described enables the formation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) colonies from human dermal fibroblasts without viral/integrating methods but using non-modified RNAs (NM-RNAs) combined with immune evasion factors reducing cellular defense mechanisms.

Erişkin İnsan Dermal Fibroblastlarının Abdominal Deriden İzolasyon ve İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerin Indüklenen Alacalı Kök Hücrelerin Indükleyici Olmayan Yöntemle Üretilmesi

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney disease and eventual end-stage renal failure are often caused by the damage to the glomerular podocytes, which are the highly specialized epithelial cells that function together with endothelial cells and the glomerular basement membrane to form the kidney&#8217;s filtration barrier. Advances in renal medicine have been hindered by the limited availability of primary tissues and the lack of robust methods for the derivation of functional human kidney cells, such as podocytes. The ability to derive podocytes from renewable sources, such as stem cells, could help advance current understanding of the mechanisms of human kidney development and disease, as well as provide new tools for therapeutic discovery. The goal of this protocol was to develop a method to derive mature, post-mitotic podocytes from human induced pluripotent stem (hiPS) cells with high efficiency and specificity, and under chemically defined conditions. The hiPS cell-derived podocytes produced by this method express lineage-specific markers (including nephrin, podocin, and Wilm&#8217;s Tumor 1) and exhibit the specialized morphological characteristics (including primary and secondary foot processes) associated with mature and functional podocytes. Intriguingly, these specialized features are notably absent in the immortalized podocyte cell line widely used in the field, which suggests that the protocol described herein produces human kidney podocytes that have a developmentally more mature phenotype than the existing podocyte cell lines typically used to study human kidney biology.

Presented here is a chemically defined protocol for the derivation of human kidney podocytes from induced pluripotent stem cells with high efficiency (&#62;90%) and independent of genetic manipulations or subpopulation selection. This protocol produces the desired cell type within 26 days and could be useful for nephrotoxicity testing and disease modeling.

Olgun Böbrek Podositlerinin Kimyasal Olarak Tanımlanmış Koşullar Altında İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Rehberli Farklılaşması

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of functional models that can accurately predict human biological responses and nephrotoxicity. Advancements in kidney precision medicine could help overcome these limitations. However, previously established in vitro models of the human kidney glomerulus-the primary site for blood filtration and a key target of many diseases and drug toxicities-typically employ heterogeneous cell populations with limited functional characteristics and unmatched genetic backgrounds. These characteristics significantly limit their application for patient-specific disease modeling and therapeutic discovery. 
This paper presents a protocol that integrates human induced pluripotent stem (iPS) cell-derived glomerular epithelium (podocytes) and vascular endothelium from a single patient to engineer an isogenic and vascularized microfluidic kidney glomerulus chip. The resulting glomerulus chip is comprised of stem cell-derived endothelial and epithelial cell layers that express lineage-specific markers, produce basement membrane proteins, and form a tissue-tissue interface resembling the kidney's glomerular filtration barrier. The engineered glomerulus chip selectively filters molecules and recapitulates drug-induced kidney injury. The ability to reconstitute the structure and function of the kidney glomerulus using isogenic cell types creates the opportunity to model kidney disease with patient specificity and advance the utility of organs-on-chips for kidney precision medicine and related applications.

Presented here is a protocol to engineer a personalized organ-on-a-chip system that recapitulates the structure and function of the kidney glomerular filtration barrier by integrating genetically matched epithelial and vascular endothelial cells differentiated from human induced pluripotent stem cells. This bioengineered system can advance kidney precision medicine and related applications.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Üretilen İzojenik Böbrek Glomerulus Çipi

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used in regulatory submissions. Here, we extend their use to cardiac medical device safety or performance assessments. We developed a novel method to evaluate cardiac medical device contractile properties in robustly contracting 2D hiPSC-CMs monolayers plated on a flexible extracellular matrix (ECM)-based hydrogel substrate. This tool enables the quantification of the effects of cardiac electrophysiology device signals on human cardiac function (e.g., contractile properties) with standard laboratory equipment. The 2D hiPSC-CM monolayers were cultured for 2-4 days on a flexible hydrogel substrate in a 48-well format.
The hiPSC-CMs were exposed to standard cardiac contractility modulation (CCM) medical device electrical signals and compared to control (i.e., pacing only) hiPSC-CMs. The baseline contractile properties of the 2D hiPSC-CMs were quantified by video-based detection analysis based on pixel displacement. The CCM-stimulated 2D hiPSC-CMs plated on the flexible hydrogel substrate displayed significantly enhanced contractile properties relative to baseline (i.e., before CCM stimulation), including an increased peak contraction amplitude and accelerated contraction and relaxation kinetics. Furthermore, the utilization of the flexible hydrogel substrate enables the multiplexing of the video-based cardiac-excitation contraction coupling readouts (i.e., electrophysiology, calcium handling, and contraction) in healthy and diseased hiPSC-CMs. The accurate detection and quantification of the effects of cardiac electrophysiological signals on human cardiac contraction is vital for cardiac medical device development, optimization, and de-risking. This method enables the robust visualization and quantification of the contractile properties of the cardiac syncytium, which should be valuable for nonclinical cardiac medical device safety or effectiveness testing. This paper describes, in detail, the methodology to generate 2D hiPSC-CM hydrogel substrate monolayers.

Here, we demonstrate a non-invasive cardiac medical device contractility evaluation method using 2D human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) monolayers, plated on a flexible substrate, coupled with video-based microscopy. This tool will be useful for the in vitro evaluation of the contractile properties of cardiac electrophysiology devices.

2D İnsan Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositlerde Kardiyak Kontraktilite Modülasyon Tedavisinin Değerlendirilmesi

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study defined aspects of that organ in a tissue culture dish. The breadth and application of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived organoid research have advanced significantly to include the brain, retina, tear duct, heart, lung, intestine, pancreas, kidney, and blood vessels, among several other tissues. The development of methods for the generation of human microvessels, specifically, has opened the way for modeling human blood vessel development and disease in vitro and for the testing and analysis of new drugs or tissue tropism in virus infections, including SARS-CoV-2. Complex and lengthy protocols lacking visual guidance hamper the reproducibility of many stem cell-derived organoids. Additionally, the inherent stochasticity of organoid formation processes and self-organization necessitates the generation of optical protocols to advance the understanding of cell fate acquisition and programming. Here, a visually guided protocol is presented for the generation of 3D human blood vessel organoids (BVOs) engineered from hPSCs. Presenting a continuous basement membrane, vascular endothelial cells, and organized articulation with mural cells, BVOs exhibit the functional, morphological, and molecular features of human microvasculature. BVO formation is initiated through aggregate formation, followed by mesoderm and vascular induction. Vascular maturation and network formation are initiated and supported by embedding aggregates in a 3D collagen and solubilized basement membrane matrix. Human vessel networks form within 2-3 weeks and can be further grown in scalable culture systems. Importantly, BVOs transplanted into immunocompromised mice anastomose with the endogenous mouse circulation and specify into functional arteries, veins, and arterioles. The present visually guided protocol will advance human organoid research, particularly in relation to blood vessels in normal development, tissue vascularization, and disease.

This protocol describes the generation of self-organizing blood vessels from human pluripotent and induced pluripotent stem cells. These blood vessel networks exhibit an extensive and connected endothelial network surrounded by pericytes, smooth muscle actin, and a continuous basement membrane.

Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Kan Damarı Organoidlerinin Üretimi

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We recently published a cost-effective strategy for the massive expansion of hiPSC-CMs in two dimensions (2D). Two major limitations are cell immaturity and a lack of three-dimensional (3D) arrangement and scalability in high-throughput screening (HTS) platforms. To overcome these limitations, the expanded cardiomyocytes form an ideal cell source for the generation of 3D cardiac cell culture and tissue engineering techniques. The latter holds great potential in the cardiovascular field, providing more advanced and physiologically relevant HTS. Here, we describe an HTS-compatible workflow with easy scalability for the generation, maintenance, and optical analysis of cardiac spheroids (CSs) in a 96-well-format. These small CSs are essential to fill the gap present in current in vitro disease models and/or generation for 3D tissue engineering platforms. The CSs present a highly structured morphology, size, and cellular composition. Furthermore, hiPSC-CMs cultured as CSs display increased maturation and several functional features of the human heart, such as spontaneous calcium handling and contractile activity. By automatization of the complete workflow, from the generation of CSs to functional analysis, we increase intra- and inter-batch reproducibility as demonstrated by high-throughput (HT) imaging and calcium handling analysis. The described protocol allows modeling of cardiac diseases and assessing drug/therapeutic effects at the single-cell level within a complex 3D cell environment in a fully automated HTS workflow. In addition, the study describes a straightforward procedure for long-term preservation and biobanking of whole-spheroids, thereby providing researchers the opportunity to create next-generation functional tissue storage. HTS combined with long-term storage will substantially contribute to translational research in a wide range of areas, including drug discovery and testing, regenerative medicine, and the development of personalized therapies.

Presented here is a set of protocols for the generation and cryopreservation of cardiac spheroids (CSs) from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured in a high-throughput, multidimensional format. This three-dimensional model functions as a robust platform for disease modeling, high-throughput screenings, and maintains its functionality after cryopreservation.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyak Sferoidlerin Üretimi, Yüksek Verimli Taraması ve Biyobankacılığı

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...