Este método demuestra el uso de células AML-12 que permitirán la construcción de modelos e investigar los efectos protectores de la platycodin D en NAFLD. La dependencia excesiva del uso de modelos animales aumenta la carga del desarrollo de fármacos terapéuticos. El uso de modelos celulares en la etapa temprana del desarrollo de fármacos NAFLD es más práctico y rentable.
Este modelo de MTC puede ayudar a mejorar la comprensión de la función biológica de la platycodin D y ayudar a estudiar el uso de otra MTC para el tratamiento de NAFLD. Comience sembrando un mililitro de células AML-12 por pocillo en placas de 12 pocillos. Luego divida la placa de 12 pocillos en cuatro grupos de tratamiento diferentes y etiquételos como control, tratado con EP, PA tratado y PA más grupo tratado con EP.
Agregue un mililitro del medio de cultivo celular normal por pocillo al grupo de control y al grupo tratado con EP. Agregue un mililitro del medio de cultivo celular normal suplementado con 300 micromolares de ácido palmítico al grupo tratado con PA y PA más PD tratado. Después de 24 horas de incubación, retire el medio de cultivo de las células y luego lave las células con un mililitro de medios sin suero dos veces.
A continuación, agregue un mililitro de medios de cultivo celular normales suplementados con un vehículo al grupo de control y un mililitro de medios de cultivo celular normales suplementados con un platycodin D micromolar al grupo tratado con EP. Agregue un mililitro de medios de cultivo celular normales suplementados con 300 micromolares de ácido palmítico al grupo tratado con PA y un mililitro de medios de cultivo celular normales suplementados con 300 micromolares de ácido palmítico y un micromolar platycodin D al grupo tratado con PA más DP. Después de tratar las células durante 24 horas, lave las células con un mililitro de 1X PBS por pocillo tres veces.
Luego tiñe las células con 100 microlitros de 10 micromolares DCFH-DA por pocillo. Incubar las células en la oscuridad durante 30 minutos. Después de la incubación, lave las células con 1X PBS tres veces y agregue un mililitro de 1X PBS a cada pocillo.
Coloque la placa de 12 pocillos en la etapa del microscopio y use un objetivo 20X para observar la morfología de las células con un aumento de 200X. Para medir el potencial de la membrana mitocondrial, lave las células tratadas preparadas anteriormente con un mililitro de 1X PBS por pocillo tres veces. Luego tiñe las células con 100 microlitros de cinco microgramos por mililitro de solución de trabajo JC-1 e incubar las células durante 30 minutos a 37 grados centígrados en la oscuridad.
Luego lave las celdas con 1X PBS tres veces y agregue un mililitro de 1X PBS a cada pozo. Coloque la placa de 12 pocillos en la etapa del microscopio y use un objetivo 20X para observar la morfología de las células con un aumento de 200X. Lise las células tratadas y recoja el lisado celular en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Centrifugar los tubos a 12, 000 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Luego agregue un tampón de carga de muestra 5X SDS-PAGE al sobrenadante de lisado celular a una relación de volumen de uno a cuatro. A continuación, coloque el gel SDS-PAGE preparado al 12% con 12 pocillos en el tanque de electroforesis y agregue 1X SDS hasta el tampón de muestra diluido con agua ultrapura al límite de altura recomendado.
Después de la electroforesis SDS-PAGE, llevar a cabo la electrotransferencia de las proteínas a una membrana de PVDF de 0,45 micras. Incubar la membrana en cinco mililitros de los anticuerpos primarios diluidos en tampón de bloqueo. Use anticuerpos específicos para LC-III, p62 y beta-actina.
Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Luego incubar la membrana de PVDF con anticuerpo secundario LGG HRP anti-ratón de conejo diluido de uno a 10, 000 en tampón de bloqueo. Incubar la membrana a temperatura ambiente protegida de la luz durante dos horas.
Después de la incubación, coloque la membrana de PVDF en una envoltura de plástico. Agregue una cantidad adecuada de solución de trabajo ECL e incube durante dos minutos. A continuación, retire la solución de trabajo ECL y exponga la membrana de PVDF en el sistema de imágenes para el desarrollo de imágenes.
La tinción DCFH-DA mostró que la platycodin D podría reducir significativamente el nivel de ROS intracelular en las células ALM-12, lo que indica que este tratamiento puede reducir el estrés oxidativo celular. Además, la fluorescencia verde que representa los monómeros JC-1 o las mitocondrias despolarizadas fue mayor en las células tratadas con ácido palmítico que en las células no tratadas, mientras que la fluorescencia roja que representa los dímeros JC-1 o las mitocondrias polarizadas fue menor en las células tratadas con ácido palmítico que en las células no tratadas, lo que indica la despolarización MMP inducida por ácido palmítico. Además, en comparación con el grupo modelo, la proporción de monómeros JC-1 a dímeros disminuyó en el grupo de tratamiento con platycodin D, lo que indica que podría mejorar la MMP inducida por ácido palmítico.
Los niveles de expresión proteica de las proteínas LC-III y p62 relacionadas con la autofagia se investigaron mediante western blotting. La proporción de LC-32 a LC-31 disminuyó significativamente y el nivel de expresión de proteínas de p62 aumentó después de ser tratado con ácido palmítico. Por otro lado, la platycodin D redujo significativamente el nivel de expresión de proteínas de p62 y aumentó la proporción de LC-32 a LC-31, lo que indica la restauración del flujo autofágico inducido por el ácido palmítico.
Si el valor de fluorescencia de las células en el grupo de control negativo es relativamente alto, las concentraciones de trabajo de las sondas fluorescentes se pueden ajustar según sea necesario.
