The authors acknowledge the funding support from the Ministry of Education, Singapore, grant number MOE2010-IF-1-025.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de cuidado y uso de animales de la Facultad de Ciencias Aplicadas, Temasek Polytechnic. 1. Preparación de DMN <ol><li> Pipetear 200 l de DMN (1 g / ml de solución madre) y añadir 19,8 ml de PBS para preparar la solución de DMN 10 mg / ml para la inyección. Nota: DMN es cancerígeno. Utilizar una campana de extracción para preparar el DMN y realizar las inyecciones de animales. </li></ol> 2. inyección intraperitoneal de DMN <ol><li> Usar ratas Wistar macho con un peso promedio de 150 a 200 g. Aclimatar ratas para 4 - 7 días antes del inicio del experimento. </li><li> Mantener las ratas a temperatura ambiente de 22 ± 1 ° C, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad ciclos. Proporcionar comida para ratas y agua ad libitum. </li><li> Medir la ingesta diaria de alimentos y agua. Medir el peso corporal semanal. </li><li> Calcular la cantidad de DMN para cada rata basado en una dosis de 10 mg / kg de peso. Utilice una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 25 to dibujar el volumen calculado de la solución de DMN en la jeringa. </li><li> Frenar la rata de inyección intraperitoneal 21. </li><li> Con la rata correctamente sujetos, introducir la aguja en el cuadrante inferior derecho del abdomen, retroceder el émbolo de la jeringa (nada debe ser aspirado) para comprobar la correcta colocación de la aguja dentro de la cavidad abdominal e inyecte lentamente solución DMN. </li><li> Cuando se ha administrado la dosis de DMN, retirar lentamente la aguja y disponer en el contenedor de objetos punzantes. </li><li> Llevar a cabo las inyecciones intraperitoneales de DMN durante 3 días consecutivos por semana durante 4 semanas. Administrar las inyecciones en la misma hora cada día. Re-calcular la dosis basándose en el peso corporal al comienzo de cada semana de inyecciones. </li><li> Recoger la sangre de la vena de la cola semanalmente para medir parámetros bioquímicos: alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) 22. </li><li> Medida de la ALT sérica y AST usando un veterinario comercialPrueba del aparato Química. </li></ol> 3. El examen macroscópico y cosecha de hígado <ol><li> La eutanasia a las ratas por inyección intraperitoneal de pentobarbital en una dosis de 100 mg / kg de peso. Asegurar la muerte mediante la comprobación de la falta de latido del corazón. </li><li> Prepararse para el post-mortem y evaluar la condición del animal como se describe por el Parkinson et al. 23 Place ratas muertas a bordo de la disección en decúbito dorsal con el abdomen hacia arriba. </li><li> Desinfectar y humedecer la piel con etanol al 70%. </li><li> Con unas tijeras, haga una incisión en la piel de toda la longitud de la zona ventral desde el ano hasta la barbilla, y reflejan la piel. Con las tijeras, una incisión en la pared abdominal desde el ano hasta el cartílago xifoides, para exponer las vísceras abdominales. </li><li> Examinar los órganos abdominales in situ para verificar cualquier anomalía. Tenga en cuenta los cambios en el color, el tamaño, la ubicación de los órganos y la presencia de líquido en la cavidad peritoneal. Examinarla consistencia de los órganos y tenga en cuenta la presencia de cualquier olor. </li><li> El uso de tijeras y pinzas, diseccionar todo el hígado libre de sus ligamentos y los archivos adjuntos. <ol><li> Comience en el hilio donde se une a la membrana y trabajar para liberar a todos los lóbulos del hígado de los archivos adjuntos. Corte con cuidado todos los ligamentos y los vasos sanguíneos. </li></ol></li><li> Transferir el hígado en una placa de petri y se pesa el hígado. </li><li> El uso de un bisturí, cortar 2 - 5 mm de espesor secciones de lóbulos hepáticos. Por coherencia, siempre tomar muestras de la misma lóbulo hepático. Tome una cuña de 5 mm de diámetro de grosor, desde el lóbulo lateral derecho 24 de aproximadamente 1 cm desde el borde del lugar lobe.Immediately en 10% de formalina tamponada para la fijación. Asegúrese de que el tejido al volumen de formalina es de 1:10 o más. </li><li> Cosecha e inmediatamente congelar porciones (utilizando nitrógeno líquido) de los lóbulos del hígado en este punto, si es necesario para otros estudios. En cuanto a (3,8), muestra del mismo lóbulo hepático para la consistencia. </li></ol><ol><li> Fijar las muestras de hígado en 10% de formalina tamponada durante un mínimo de 24 hr. </li><li> Después de la fijación, recortar el hígado, colocar en casetes y cargarlos en el cesto del procesador automatizado de tejidos. </li><li> Coloque la cesta con cintas en la primera estación, que contiene 10% de formalina tamponada. Asegúrese de que los casetes están completamente sumergidos. Pueden permanecer en esta cámara durante un máximo de 12 horas hasta que comience el ciclo. </li><li> Programar el procesador de tejidos para girar las cassettes para 1 hr cada uno, a través de estaciones sucesivas que contienen las siguientes soluciones: etanol a concentraciones de 50%, 70%, 90%, 100% (2 estaciones), xileno (2 estaciones) y parafina líquida ( 2 estaciones). </li><li> La transferencia de las muestras de hígado en el baño de cera de la estación de incrustación. Asegúrese de que la máquina de incrustación se conecta al menos una hora antes. </li><li> Utilizando unas pinzas pre-calentado (65 ° C), retire cada cassette de la wBaño de hacha y lugar sobre la placa caliente (65 ° C) de la máquina de incrustación. Dispense cantidad suficiente de parafina líquida en el molde base de acero inoxidable (pre-calentado a 65 ° C) hasta la mitad. La transferencia de la sección del hígado de la casete en el molde. Asegúrese de que la muestra se coloca con la superficie de corte (que se examinaron microscópicamente) plana en la parte inferior del molde. </li><li> Llenar el molde por completo con parafina líquida, montar el casete vacía en la parte superior y colocar el molde sobre la placa 4 ° C de la máquina de incrustación que se enfríe durante al menos 30 minutos. </li><li> Compruebe que la cera se haya enfriado y solidificado, y retire el bloque de parafina del molde. El bloque debe salir fácilmente y no se adhieren o se romperá. Si esto sucede, derretir el bloque y repetir este paso. El bloque de parafina puede ser seccionado, una vez que se solidifica. Los bloques pueden ser almacenados a temperatura ambiente durante muchos años. </li><li> Coloque el bloque de parafina en el microtomo y la sección a las 10 micras de espesor hasta que la capa de cerase retira suficientemente para que el tejido hepático incorporado para ser visible. </li><li> Cambie el ajuste en el micrótomo para cortar a las 5 micras de espesor. Con unas pinzas, recoger una sección bien cortado tomándolo por el borde y flotar con cuidado la sección en el baño de agua a una temperatura de 40 ° C. </li><li> Con cuidado, coloque un portaobjetos de vidrio limpio en la sección flotante y levantarlo sobre la superficie de la lámina de vidrio. Colocar el portaobjetos en un calentador de portaobjetos a 37 ° C durante la noche. </li></ol> 5. Masson Trichrome tinción <ol><li> Antes de aplicar las manchas, el tratamiento de las diapositivas para eliminar la cera y rehidratar los tejidos de la siguiente manera: <ol><li> Sumergir las secciones en xileno durante 5 min. Repetir 2x. </li><li> Sumergir las secciones en 100% de etanol durante 3 min. Repita 1x. </li><li> Sumergir las secciones durante 1 min cada uno en las siguientes soluciones de etanol: 90%, 80% y 70%. </li></ol></li><li> Enjuague el portaobjetos bajo el agua del grifo para eliminar todo el etanol existentes en la diapositiva. </li><li> Sumergir los portaobjetos en hierro hematoxilina durante 10 min para teñir el núcleo. </li><li> Enjuagar los portaobjetos con agua para eliminar el exceso de tinte de la diapositiva. </li><li> Sumergir los portaobjetos en Biebrich Scarlet-fucsina ácida durante 2 minutos para teñir el citoplasma. </li><li> Enjuague los portaobjetos con agua. </li><li> Colocar los portaobjetos en solución de ácido fosfotúngstico / fosfomolíbdico durante 10 minutos para promover la absorción de Azul de anilina. Cambie la solución de ácido fosfotúngstico / fosfomolíbdico después de 2 rondas de uso. </li><li> Colocar los portaobjetos en solución de azul de anilina de 10 min para teñir las fibras de colágeno. </li><li> Enjuague el exceso de colorante con agua y colocar los portaobjetos en la solución de ácido acético al 1% durante 1 min para permitir la diferenciación se lleve a cabo para hacer que el color de la corredera más delicado y transparente. </li><li> Enjuague los portaobjetos con agua y proceder a deshidratar los cortes de tejido. Las etapas de deshidratación son los siguientes: </li><li> Sumergir los portaobjetos sucesivamente durante 10 s cada vez, en el siguiente concentrations de etanol: 70%, 80%, 95% y 100%. </li><li> Sumergir los portaobjetos durante 30 seg en 100% de etanol. Repita 1x. </li><li> Enjuagar los portaobjetos a través de 3 estaciones de xileno durante 5 minutos cada uno para eliminar el etanol. </li><li> Montar una hoja de cubierta de vidrio sobre la muestra con medio de montaje (por ejemplo, medio de montaje DPX) y dejar secar. Nota: DPX es una resina sintética que se seca rápidamente, conserva mancha y protege la sección de tejido. </li></ol> 6. La fibrosis que alcanzaron en las secciones Trichome manchadas de Masson de Hígado <ol><li> Tener un patólogo veterinario evaluar la gravedad de la fibrosis de acuerdo con la fibrosis puntos 25. Sería óptimo si la puntuación de la fibrosis se realiza por dos o tres patólogos de forma independiente en una forma ciega. En tal escenario, obtener una puntuación final después de la discusión y el Grupo de Revisión de resolver cualquier diferencia en la puntuación. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Puntuación </td><td> Descripción </td></tr><tr><td> 0 </td><td> sin la fibrosis </td></tr><tr><td> 1 </td><td> expansión fibrosa de algunas áreas del portal, con o sin septos fibrosos corta </td></tr><tr><td> 2 </td><td> expansión fibrosa de la mayoría de las áreas del portal, con o sin septos fibrosos corta </td></tr><tr><td> 3 </td><td> expansión fibrosa de la mayoría de las áreas del portal, portal de vez en cuando al portal (PP) de puente </td></tr><tr><td> 4 </td><td> expansión fibrosa de áreas de portal con marcado de puente (portal a portal (PP), así como portal a la central (PC) </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Marcado puente (PP y / o PC) con nódulos ocasionales (cirrosis incompleta) </td></tr><tr><td> 6 </td><td> Cirrosis, probable o definitiva </td></tr></tbody></table> Tabla 1: puntuación de Fibrosis utiliza para leer las secciones Trichome manchado hígado del 25 Masson.

<ol>
	<li>Magee, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+liver+injury;+the+metabolism+of+dimethylnitrosamine.">Toxic liver injury; the metabolism of dimethylnitrosamine.</a> Biochem J. 64 (4), 676-682 (1956).</li><li>Pritchard, D. J., Butler, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-the+mechanism+of+cell+death+in+dimethylnitrosamine-induced+hepatotoxicity.">Apoptosis-the mechanism of cell death in dimethylnitrosamine-induced hepatotoxicity.</a> J Pathol. 158 (3), 253-260 (1989).</li><li>Madden, J. W., Gertman, P. M., Peacock, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimethylnitrosamine-induced+hepatic+cirrhosis:+a+new+canine+model+of+an+ancient+human+disease.">Dimethylnitrosamine-induced hepatic cirrhosis: a new canine model of an ancient human disease.</a> Surgery. 68 (1), 260-267 (1970).</li><li>Jenkins, S. A., Grandison, A., Baxter, J. N., Day, D. W., Taylor, I., Shields, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dimethylnitrosamine-induced+model+of+cirrhosis+and+portal+hypertension+in+the+rat.">A dimethylnitrosamine-induced model of cirrhosis and portal hypertension in the rat.</a> J Hepatol. 1 (5), 489-499 (1985).</li><li>J&#233;z&#233;quel, A. M., Mancini, R., Rinaldesi, M. L., Macarri, G., Venturini, C., Orlandi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphological+study+of+the+early+stages+of+hepatic+fibrosis+induced+by+low+doses+of+dimethylnitrosamine+in+the+rat.">A morphological study of the early stages of hepatic fibrosis induced by low doses of dimethylnitrosamine in the rat.</a> J Hepatol. 5 (2), 174-181 (1987).</li><li>George, J., Chandrakasan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characteristics+of+dimethylnitrosamine+induced+fibrotic+liver+collagen.">Molecular characteristics of dimethylnitrosamine induced fibrotic liver collagen.</a> Biochim Biophys Acta, Protein Struct Mol Enzymol. 1292 (2), 215-222 (1996).</li><li>Winwood, P. J., Arthur, M. 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II. Electron immunohistochemical studies in rats with CCl4-induced cirrhosis.</a> Lab Invest. 53 (2), 166-186 (1985).</li><li>Pritchard, M. T., Apte, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+to+Study+Liver+Regeneration.">Models to Study Liver Regeneration.</a> Liver Regeneration. , 15-40 (2015).</li><li>Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+bile+duct+obstruction:+a+new+experimental+model+for+cirrhosis+in+the+rat.">Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat.</a> Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).</li><li>Marques, T. 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(54), (2011).</li><li>Ruehl-Fehlert, C., Kittel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).</li><li>Ishak, K., Baptista, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+grading+and+staging+of+chronic+hepatitis.">Histological grading and staging of chronic hepatitis.</a> J Hepatol. 22 (6), 696-699 (1995).</li><li>Sant'Anna, L. B., Sant'Anna, N., Parolini, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+computer+assisted+image+analysis+for+identifying+and+quantifying+liver+fibrosis+in+a+experimental+model.">Application of computer assisted image analysis for identifying and quantifying liver fibrosis in a experimental model.</a> J Comput Interdiscip Sci. 2 (2), 139-148 (2011).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Hemos descrito un método para hacer un modelo animal de fibrosis hepática y para evaluar la severidad de la fibrosis hepática. Es importante aplicar la dosis correcta de DMN y cumplir con el programa de inyecciones intraperitoneales semanales. A medida que avanza el experimento, es crucial sopesar las ratas y volver a calcular la dosis al comienzo de cada semana de inyecciones DMN. Tenga en cuenta que DMN es tóxico y debe ser manejada en el armario de humos. Llevamos a cabo las inyecciones intraperitoneales en el ar...

DMN es una toxina específica potente hígado. Su metabolismo, distribución en los tejidos, y la capacidad de causar lesiones en los hígados de ratas se informó por Magee 1, y el mecanismo de daño de hepatocitos y la muerte celular por apoptosis fue descrito por Pritchard y Butler 2. Se informó de administración intermitente de este compuesto para inducir la fibrosis hepática en perros y ratas 3,4. Los mecanismos y los cambios morfológicos de la fibrosis hepática se han investigado ampliamente el uso de este modelo. En los primeros estudios que utilizan la rata, el tratamiento de 3 semanas con DMN produce necrosis hemorrágica centrolobulillar seguido de cirrosis micronodular sin esteatosis 5. Se demostró que en la fibrosis temprana, el colágeno formado era más reticulado con el tipo III es más prominente que tipo I 6. En común con otras causas, cambios fibróticos DMN inducida se asociaron con un aumento en las células de Kupffer; macrófagos hepáticos que residen in los sinusoides. Estas células se transforman en miofibroblastos y producen cantidades excesivas de matriz extracelular que es el principal problema en la fibrosis 7. En términos de la señalización celular, Nakamura et al. Demostró que el TGF-β juega un papel crítico en la progresión de la fibrosis hepática 8. Utilizaron un adenovirus que expresa un receptor TGF-β truncado de tipo II, para inhibir específicamente la señalización de TGF-β. La fibrosis hepática en estas ratas se detuvo espectacularmente durante el tratamiento DMN en comparación con grupos de control. Otros estudios han confirmado que la supresión de TGF-β conduce a la reducción de la del desarrollo de la fibrosis hepática 9,10. El modelo también se utilizó en un estudio global perfiles de genes para identificar otros marcadores de fibrosis y proteínas que podrían ser utilizados como dianas de fármacos para la terapia anti-fibrótico 11. Otros agentes químicos utilizados para inducir la fibrosis del hígado son: tioacetamida (TAA) yctetracloruro de Arbon (CCl4). TAA fue utilizado por primera vez en ratas y luego en ratones 12. Las ventajas de este modelo incluyen: facilidad de administración químico en el agua, la reproducibilidad del modelo con característica cirrosis micronodular y cambios bioquímicos potable. Las desventajas incluyen: el largo período de tiempo de 3 meses para la fibrosis hepática para desarrollar y la falta de comprensión del mecanismo molecular para la inducción de la fibrosis hepática. En cuanto a la CCL 4, su uso ha disminuido por las siguientes razones: que no imita la enfermedad de hígado humano, tienen efectos nocivos sobre la capa de ozono, causa dolor y angustia a los animales, es muy tóxica para los seres humanos y requiere precauciones adicionales en su manejo y eliminación 13,14. Prolongada obstrucción del conducto biliar (por la intervención quirúrgica) como modelo experimental para la cirrosis hepática se informó por primera vez por Kountouras et al. 15. Este método no es tóxico para los seres humanos y animales. MARIDOin embargo, el tiempo requerido para la fibrosis hepática de desarrollar varía. Una revisión de 30 informes por Marques et al. 16, encontró que se necesitaba de siete días a cuatro semanas después de la cirugía para la fibrosis hepática se desarrolle. Los cambios patológicos descritos son similares a los de la fibrosis biliar crónica humana y el modelo serían más adecuados para los investigadores interesados ​​en esta área. En resumen, la administración intermitente de una dosis constante de DMN en la rata durante 4 semanas produce la fibrosis hepática que imita la enfermedad humana. Las ratas que recibieron muestran el desarrollo progresivo del daño hepático y la fibrosis del parénquima 4,17. La progresión y la gravedad de la enfermedad pueden ser controlados a través de muestras de sangre o sacrificio de los animales en puntos específicos de tiempo y el efecto es altamente reproducible 18. Así, el modelo se ha utilizado ampliamente para estudiar los mecanismos de la fibrosis hepática y la cirrosis así como para la detección de potenciales agentes anti-fibróticos 10,19,20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dimethylnitrosamine</td>
			<td>Wako</td>
			<td>147-03781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Sinopharm chemicals</td>
			<td>F63257009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson trichome stains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline Blue</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>#42755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Fuschin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT42685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scarlet Red</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>#26905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic Acid Hydrate</td>
			<td>ALFA AESAR</td>
			<td>ALFA40116.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphomolybdic Acid Hydrate</td>
			<td>Sigma SG</td>
			<td>221856-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigert&#39;s Iron Hematoxilyn</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.15973.0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mounting Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HX066873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica TP 1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding machine</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>&#160;Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica RM 2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet Test Analyzer</td>
			<td>Idexx</td>
			<td>Vet Test 8008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the dimethylnitrosamine induced liver fibrosis model in the rat

De cuatro a seis semanas de edad, ratas Wistar machos fueron usados ​​para producir modelos animales de fibrosis hepática. El proceso requiere cuatro semanas de la administración de 10 mg / kg dimetilnitrosamina (DMN), dada por vía intraperitoneal durante tres días consecutivos por semana. Las inyecciones intraperitoneales se realizaron en la campana de humos como DMN es una hepatoxin conocida y carcinógeno. El modelo tiene varias ventajas. En primer lugar, cambios en el hígado pueden ser estudiadas de forma secuencial o en etapas particulares de interés. En segundo lugar, la etapa de la enfermedad hepática se puede controlar mediante la medición de aminotransferasa en suero de alanina (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) enzimas. En tercer lugar, la gravedad del daño hepático en diferentes etapas puede ser confirmada por el sacrificio de los animales en puntos de tiempo designados, seguido por el examen histológico de los tejidos del hígado Trichome manchadas de Masson. Después de cuatro semanas de administración de DMN, la puntuación de la fibrosis típica es de 5 a 6 en la escala de Ishak. El modelo puede ser reproducida de manera consistente y ha sidoampliamente utilizado para evaluar la eficacia de los posibles agentes anti-fibróticos.

DMN ratas tratadas pierden peso y se vuelven menos vigorosa con la capa del pelo rizado. Hay una pérdida significativa en el peso corporal medio de las ratas tratadas con DMN; primera detectable después de 2 semanas de tratamiento DMN, y esta diferencia se mantiene a través de las semanas 3 y 4 después del tratamiento DMN (Figura 1a). A medida que las ratas reciben DMN sobre sucesivas semanas, daño al hígado hace que se vuelva más pequeño. El índice de hígado; ...

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The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

La fibrosis hepática Modelo dimetilnitrosamina inducida en la rata

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

11.9K vistas.  Temasek Polytechnic. We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

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A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to affect the function of several organs and tissues and to contribute to the development of the many complications associated with obesity and the metabolic syndrome, including type 2 diabetes. To study the mechanisms by which excessive levels of glucose and fatty acids affect the pancreatic beta-cell and the secretion of insulin, we have established a chronic nutrient infusion model in the rat. The procedure consists of catheterizing the right jugular vein and left carotid artery under general anesthesia; allowing a 7-day recuperation period; connecting the catheters to the pumps using a swivel and counterweight system that enables the animal to move freely in the cage; and infusing glucose and/or Intralipid (a soybean oil emulsion which generates a mixture of approximately 80% unsaturated/20% saturated fatty acids when infused with heparin) for 72 hr. This model offers several advantages, including the possibility to finely modulate the target levels of circulating glucose and fatty acids; the option to co-infuse pharmacological compounds; and the relatively short time frame as opposed to dietary models. It can be used to examine the mechanisms of nutrient-induced dysfunction in a variety of organs and to test the effectiveness of drugs in this context.

A protocol for chronic infusions of glucose and Intralipid in rats is described. This model can be used to study the impact of nutrient excess on organ function and physiological parameters.

Un modelo de infusión de nutrientes crónica en la rata

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to  affect the function of several organs and tissues and to contribute to the  ...

Investigación

Medicina

Tibial Nerve Transection - A Standardized Model for Denervation-induced Skeletal Muscle Atrophy in Mice

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. Although originally developed and used extensively in the rat due to its larger size, the tibial nerve in mice is big enough that it can be easily manipulated with either crush or transection, leaving the peroneal and sural nerve branches of the sciatic nerve intact and thereby preserving their target muscles. Thus, this model offers the advantages of inducing less morbidity and impediment of ambulation than the sciatic nerve transection model and also allows investigators to study the physiologic, cellular and molecular biologic mechanisms regulating the process of muscle atrophy in genetically engineered mice. The tibial nerve supplies the gastrocnemius, soleus and plantaris muscles, so its transection permits the study of denervated skeletal muscle composed of fast twitch type II fibers and/or slow twitch type I fibers. Here we demonstrate the tibial nerve transection model in the C57Black6 mouse. We assess the atrophy of the gastrocnemius muscle, as a representative muscle, at 1, 2, and 4 weeks post-denervation by measuring muscle weights and fiber type specific cross-sectional area on paraffin-embedded histologic sections immunostained for fast twitch myosin.

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of skeletal muscle atrophy. The model surgical protocol is described and demonstrated in C57Black6 mice. &#160;

Transección del nervio tibial - Un modelo normalizado para la atrofia del músculo esquelético denervación inducida en ratones

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. ...

Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ischemia/reperfusion (I/R) injury with myriad negative consequences. Potential I/R injury in marginal organs destined for liver transplantation contributes to the current donor shortage secondary to a decreased organ utilization rate. A significant need exists to explore hepatic I/R injury in order to mediate its impact on graft function in transplantation. Rat liver hilar clamp models are used to investigate the impact of different molecules on hepatic I/R injury. Depending on the model, these molecules have been delivered using inhalation, epidural infusion, intraperitoneal injection, intravenous administration or injection into the peripheral superior mesenteric vein. A rat liver hilar clamp model has been developed for use in studying the impact of pharmacologic molecules in ameliorating I/R injury. The described model for rat liver hilar clamp includes direct cannulation of the portal supply to the ischemic hepatic segment via a side branch of the portal vein, allowing for direct segmental hepatic delivery. Our approach is to induce ischemia in the left lateral and median lobes for 60 min, during which time the substance under study is infused. In this case, pegylated-superoxide dismutase (PEG-SOD), a free radical scavenger, is infused directly into the ischemic segment. This series of experiments demonstrates that infusion of PEG-SOD is protective against hepatic I/R injury. Advantages of this approach include direct injection of the molecule into the ischemic segment with consequent decrease in volume of distribution and reduction in systemic side effects.

A unique rat liver hilar clamp model was developed for studying the impact of pharmacologic molecules in ameliorating ischemia-reperfusion injury. This model includes direct cannulation of the portal supply to the ischemic liver segment via a branch of the portal vein, allowing for direct hepatic delivery.

Método de la entrega directa segmentaria intra-hepática utilizando un modelo de hígado de rata hiliar abrazadera

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ...

Rat Model of the Associating Liver Partition and Portal Vein Ligation for Staged Hepatectomy (ALPPS) Procedure

Recent clinical data support an aggressive surgical approach to both primary and metastatic liver tumors. For some indications, like colorectal liver metastases, the amount of liver tissue left behind after liver resection has become the main limiting factor of resectability of large or multiple liver tumors. A minimal amount of functional tissue is required to avoid the severe complication of post-hepatectomy liver failure, which has high morbidity and mortality. Inducing liver growth of the prospective remnant prior to resection has become more established in liver surgery, either in the form of portal vein embolization by interventional radiologists or in the form of portal vein ligation several weeks prior to resection. Recently, it was shown that liver regeneration is more extensive and rapid, when the parenchymal transection is added to portal vein ligation in a first stage and then, after only one week of waiting, resection performed in a second stage (Associating Liver Partition and Portal vein ligation for Staged hepatectomy = ALPPS). ALPPS has rapidly become popular across the world, but has been criticized for its high perioperative mortality. The mechanism of accelerated and extensive growth induced by this procedure has not been well understood. Animal models have been developed to explore both the physiological and molecular mechanisms of accelerated liver regeneration in ALPPS. This protocol presents a rat model that allows mechanistic exploration of accelerated regeneration.

Rat Model of the Associating Liver Partition and Portal Vein Ligation for Staged Hepatectomy ALPPS Procedure

Inducing rapid liver hypertrophy using Associating Liver Partition and Portal vein ligation for a Staged hepatectomy (ALPPS) has been proposed for resection of borderline resectable liver tumors. This model may elucidate mechanisms involved in rapid hypertrophy and allows testing of drugs that promote or block the acceleration of regeneration.

Modelo de la rata de la Asociación de partición hepática y ligadura de la vena porta para procedimiento efectuado hepatectomía (ALPPS)

Recent clinical data support an aggressive surgical approach to both primary and metastatic liver tumors. For some indications, like colorectal liver ...

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. To better understand the mechanism behind these surgical procedures, a rat partial liver transplantation (PLTx) model was established for relevant surgical studies. Because of the complexity of the rat PLTx model, a protocol with detailed descriptions is required. An article published previously reported a protocol in which ex vivo hepatectomy was used to achieve 50% rat PLTx. In contrast to this protocol, we introduced a re-arterialized PLTx with an in vivo 70% hepatectomy. An updated vessel-oriented hepatectomy was incorporated into the rat PLTx to refine the microsurgical procedure. The portal veins and hepatic arteries of the left lateral lobe and the median lobe were individually dissected and ligated before removal of the liver parenchyma, thereby decreasing the probability of bleeding in the remnant liver stump. Furthermore, an end-to-side vessel anastomosis between the common hepatic artery and the enlarged proper hepatic artery was introduced to re-arterialize the hepatic artery. By using this end-to-side vessel anastomosis technique, the diameter of the anastomosis was enlarged, thereby decreasing the difficulty of hand suture and maintaining a high rate of anastomotic patency. Moreover, the cuff anastomosis of the infrahepatic vena cava was slightly modified. A section of circumferential liver parenchyma around the vena cava of a recipient was preserved during cuff anastomosis to maintain the three-dimensional shape of the vascular lumen. This section of liver parenchyma was removed after completing the anastomosis. With this modification, the step involving placement of stay sutures was omitted, thereby further shortening the cuff anastomosis time. By using this protocol of rat PLTx, a low liver enzyme level, an intact liver lobular architecture and a high survival rate were achieved after microsurgery.

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Here, a protocol involving re-arterialized rat partial liver transplantation is presented. Specifically, 70% liver was resected in vivo by using an updated technique of vessel-oriented hepatectomy. The hepatic artery was reconstructed in an end-to-side manner. The cuff technique was modified to shorten the anastomosis time of the infrahepatic vena cava.

Volver a arterializada rata parcial trasplante del hígado con una en vivo orientada al barco 70% hepatectomía

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Left Atrial Stenosis Induced Pulmonary Venous Arterialization and Group 2 Pulmonary Hypertension in Rat

The mechanism of mitral stenosis-induced pulmonary venous arterialization and group 2 pulmonary hypertension (PH) is unclear. There is no rodent model of group 2 PH, due to mitral stenosis (MS), to facilitate the investigation of disease mechanisms and potential therapeutic strategies. We present a novel rat model of pulmonary venous congestion-induced pulmonary venous arterialization and group 2 PH caused by left atrial stenosis (LAS). LAS is achieved by constricting the left atrium using a half-closed titanium clip. After the LAS surgery, a rat model with a transmitral inflow velocity greater than or equal to 2.0 m/s on echocardiography gradually develops pulmonary venous arterialization and group 2 PH over an 8- to 10-week period. In this protocol, we provide the step-by-step procedure of how to perform the LAS surgery. The presented LAS rat model mimics MS in humans and is useful for studying the underlying molecular mechanism of pulmonary venous arterialization and for the preclinical evaluation of therapies for group 2 PH.

Left atrial stenosis (LAS) is a novel surgical technique used for studying group 2 pulmonary hypertension (PH) and mechanisms underlying pulmonary venous arterialization. Here, we present a protocol to constrict the left atrium using a titanium clip to cause pulmonary venous arterialization and moderate PH in a rat.

Estenosis Atrial izquierda inducido arterialización venosa pulmonar y el grupo 2 la hipertensión pulmonar en rata

The mechanism of mitral stenosis-induced pulmonary venous arterialization and group 2 pulmonary hypertension (PH) is unclear. There is no rodent model of ...

Reduced Complications after Arterial Reconnection in a Rat Model of Orthotopic Liver Transplantation

The rat orthotopic liver transplantation (OLT) model is a powerful tool to study acute and chronic rejection. However, it is not a complete representation of human liver transplantation due to the absence of arterial reconnection. Described here is a modified transplantation procedure that includes the incorporation of hepatic artery (HA) reconnection, leading to a marked improvement in transplant outcomes. With a mean anhepatic time of 12 min and 14 s, HA reconnection results in improved perfusion of the transplanted liver and an increase in long-term recipient survival from 37.5% to 88.2%. This protocol includes the use of 3D-printed cuffs and holders to connect the portal vein and infrahepatic inferior vena cava. It can be implemented for studying multiple aspects of liver transplantation, from immune response and infection to technical aspects of the procedure. By incorporating a simple and practical method for arterial reconnection using a microvascular technique, this modified rat OLT protocol closely mimics aspects of human liver transplantation and will serve as a valuable and clinically relevant research model.

The goal of this study is to modify the rat orthotopic liver transplant model to better represent human liver transplantation and improve recipient survival. The presented method reestablishes hepatic arterial inflow by connecting the donor liver&#39;s common hepatic artery to the recipient liver&#39;s proper hepatic artery.

Reducción de las complicaciones después de la reconexión arterial en un modelo de rata de trasplante hepático ortotópico

The rat orthotopic liver transplantation (OLT) model is a powerful tool to study acute and chronic rejection. However, it is not a complete representation ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease, metabolic liver disease, and liver cancer) requires experimental manipulation of animal models and in vitro cell cultures. Both techniques have limitations, such as the requirement of large numbers of animals for in vivo manipulation. However, in vitro cell cultures do not reproduce the structure and function of the multicellular hepatic environment. The use of precision-cut liver slices is a technique in which uniform slices of viable mouse liver are maintained in laboratory tissue culture for experimental manipulation. This technique occupies an experimental niche that exists between animal studies and in vitro cell culture methods. The presented protocol describes a straightforward and reliable method to isolate and culture precision-cut liver slices from mice. As an application of this technique, ex vivo liver slices are treated with bile acids to simulate cholestatic liver injury and ultimately assess the mechanisms of hepatic fibrogenesis.

This protocol provides a simple and reliable method for the production of viable precision-cut liver slices from mice. The ex vivo tissue samples can be maintained under laboratory tissue culture conditions for multiple days, providing a flexible model to examine liver pathobiology.

Rebanadas de hígado cortadas con precisión de la murino como modelo Ex Vivo de biología hepática

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, including ischemia-reperfusion injury (IRI) of extrahepatic organs. This model requires numerous experiments and devices. The duration of anhepatic phase is closely related to the time to develop IRI after transplantation. In this experiment, we used hemodynamic changes to induce extrahepatic organ damage in rats and determined the maximum tolerance time. The time until the most severe organ injury varied for different organs. This method can easily be replicated and can also be used to study IRI of the extrahepatic organs after liver transplantation.

This paper provides a detailed description of how to build an animal model of the anhepatic phase (liver ischemia) in rats to facilitate basic research into ischemia-reperfusion injury after liver transplantation.

Lesión de isquemia-reperfusión de órganos mediante la simulación de cambios hemodinámicos en el modelo de trasplante de hígado de rata

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...