Nuestro protocolo es significativo porque permite a los investigadores investigar el mecanismo molecular de la angiogénesis coronaria fuera de un organismo. La principal ventaja de esta técnica es que modela con precisión el proceso de angiogénesis coronaria dentro de un organismo, facilitando el estudio de los mecanismos de la angiogénesis coronaria. Comience por rociar un ratón embarazada llevando embriones embrionarios del día 11,5 con 70%etanol.
Levantar la piel sobre el vientre con fórceps, utilizar tijeras para hacer una piel abdominal y la incisión peritoneal lateralmente y antes hasta el diafragma para exponer el cuerno uterino. Agarrar el útero, cortar el tejido libre y sacar el cuerno uterino. Coloque la cadena de embriones en PBS estéril frío bajo un microscopio estéreo y despegue el músculo uterino, el saco de yema y la cubierta de amnion de cada embrión.
A medida que cada embrión está aislado, utilice una cuchara perforada para transferir los tejidos a un nuevo plato de Petri que contenga PBS estéril en hielo. Para cosechar el tejido cardíaco embrionario, transfiera el primer embrión que se diseccione a una nueva placa Petri bajo el microscopio, y coloque el embrión en el lado ventral hacia arriba. Utilice fórceps finos para hacer una pequeña incisión en el pecho, ligeramente por encima del diafragma, e inserte los fórceps cerrados en la incisión para agrandar la incisión.
Usando los fórceps para mantener la pared torácica abierta para exponer el corazón y los pulmones, usa un segundo par de fórceps para mover suavemente el corazón antes de 90 grados para exponer la aorta dorsal y la vena. Luego, agarrando estos vasos en la base del corazón, saca cuidadosamente el corazón y los pulmones antes y enjuaga los tejidos con PBS frío. Cuando se haya cosechado todo el tejido cardíaco, coloque las muestras del corazón bajo el microscopio y retire los lóbulos pulmonares de cada corazón.
Orientar el primer corazón en su lado dorsal, y sosteniendo el corazón en su base, utilizar fórceps finos para raspar las aurículas izquierda y derecha en el tejido adyacente que rodea el SV desde el corazón. Para aislar el SV, oriente el lado dorsal del corazón hacia arriba. Retire cuidadosamente el SV del corazón y utilice una pipeta de transferencia estéril para colocar el tejido aislado en una nueva placa Petri de seis centímetros que contenga PBS estéril con hielo.
Para aislar todo el ventrículo, retire el tracto de salida y utilice una nueva pipeta de transferencia estéril para colocar los ventrículos en un plato separado de seis centímetros de Petri que contenga PBS estéril de hielo estéril en hielo. Para configurar cultivos de SV y ventrículos enteros, primero recubre las membranas de un inserto de cultivo PET de poro de ocho micrómetros por pozo de una placa de cultivo de 24 pozos, con 100 microlitros de matriz extracelular recién diluida por cultivo durante al menos 30 minutos a 37 grados Centígrados. Cuando la matriz se haya solidificado, utilice una pipeta de transferencia para transferir una plantación a cada plaquita y mueva la placa debajo del microscopio.
Usando fórceps limpios, coloque los explantes en el centro de cada plaquita para asegurarse de que no estén unidos a las paredes laterales, y retire cuidadosamente cualquier PBS adicional. A continuación, transfiera la placa con la tapa cerrada bajo una campana de cultivo de tejido de flujo laminar, y agregue 100 microlitros de medio completo precalentó a cada inserción, y 200 microlitros al pozo por debajo de cada plaquita. Luego agregue 300 microlitros de PBS a cualquier pozo no utilizado, y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante cinco días.
Para el tratamiento con VEGF-A en el segundo día de cultivo, retire el medio de ambas cámaras de cada cultivo y agregue 100 microlitros de PBS a cada inserción, y 200 microlitros de PBS a cada pozo. Después de agitar la placa un par de veces, reemplace el PBS con 300 microlitros de medio basal complementados con 1%suero bovino fetal para iniciar los cultivos, y devuelva la placa a la incubadora. En el tercer día después de la inanición, añadir 300 microlitros de medio basal fresco más suero a los pozos de control y medio basal más 50 nanogramos por mililitro de VEGF-A a los pozos de tratamiento, y devolver la placa a la incubadora de cultivo celular.
En el sexto día de cultivo, lave las cámaras con PBS como se ha demostrado, y fije los cultivos con 200 microlitros de 4%paraformaldehído en cada pozo, y 100 microlitros de fijador en cada plaquita. Después de 20 minutos a 4 grados centígrados con balanceo, lave los cultivos con 300 microlitros de PBS durante 10 minutos por lavado con balanceo a temperatura ambiente. Después del último lavado, añadir 300 microlitros de solución de anticuerpos primarios a los pozos e inserciones para un cultivo nocturno a cuatro grados centígrados con balanceo.
A la mañana siguiente, lave los cultivos 10 veces en tensioactivo no iónico en PBS con balanceo, cambiando la solución de lavado cada 10 minutos antes de etiquetar los cultivos con 300 microlitros de un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado a cuatro grados Celsius durante la noche con balanceo. Al día siguiente, lave los cultivos 10 veces en PBS fresco con tensioactivo no iónico como se demuestra. Después del último lavado, utilice fórceps finos para pelar cuidadosamente la membrana de cada plaquita y colocar las membranas en diapositivas individuales del microscopio de vidrio, explanar hacia arriba.
Cubra las muestras con un medio de montaje complementado con DAPI en un resbalón de cubierta, y selle los bordes de los resbalones de la cubierta con esmalte de uñas transparente. Cuando el esmalte de uñas se haya secado, imagine las diapositivas por microscopía confocal. A medida que las células SV iniciales crecen sobre el ventrículo cardíaco, dejan de producir marcadores venosos como Coup-TF2.
Después de cinco días de cultivo, las células endoteliales SV brotan y migran a la membrana. Al igual que en el corazón embrionario, la expresión de Coup-TF2 se reduce a medida que los vasos migran lejos del SV. Cultivos estimulados con VEGF-A exhiben un mayor crecimiento de brotes angiogénicos tanto en densidad como en longitud. Otros cultivos de SV estimulados por VEGF-A demuestran un aumento casi tres veces en la longitud del brote en comparación con los controles, lo que sugiere que los brotes endoteliales de SV y endocardio responden al VEGF-A.
Es importante no perder el tejido SV mientras saca el corazón y los pulmones, extirpa las aurículas y limpia el tejido adyacente que rodea la SV. Se pueden realizar experimentos de imágenes en vivo para visualizar la angiogénesis coronaria y capturar los detalles de la dinámica celular y molecular durante el proceso. Esta técnica es extremadamente útil para evaluar los mecanismos moleculares potenciales de la angiogénesis coronaria y como un sistema modelo para el estudio de la angiogénesis en general.
