Name: generation of 3d tumor spheroids for drug evaluation studies
Uploaded: 2023-02-24T13:20:00
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중요한 의견과 제안을 해주신 모든 실험실 구성원에게 감사드립니다. 이 연구는 Jiangsu Commission of Health (K2019030)의 핵심 프로젝트에 의해 지원되었습니다. 개념화는 C.W.와 Z.C.에 의해, 방법론은 W.H.와 M.L.에 의해 수행되었고, 조사는 W.H.와 M.L.에 의해 수행되었고, 데이터 큐레이션은 W.H., Z.Z., S.X., M.L.에 의해 수행되었고, 원래 초안 준비는 Z.Z., J.Z., S.X., W.H., 및 X.L., 검토 및 편집은 Z.C.에서, 프로젝트 관리는 C.W.와 Z.C.에서, 자금 조달은 C.W.에서 수행했습니다. 모든 저자는 출판된 버전의 원고를 읽고 동의했습니다.

1. 스페로이드 구조
<ol><li>배양 접시의 유착 방지 처리<ol><li>유착방지제 시약 100 μL를 U자형 웰 바닥이 있는 48웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅하고, 10분 동안 유지한다. 10분 후, 코팅 시약을 흡인하고, 멸균된 PBS로 2회 세척한다.</li>
		<li>배양 접시를 사용할 때까지 인큐베이터(37°C, 5%CO2로 가습된 공기)에 넣는다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포 준비, 수집 및 계수<ol><li>세포에 특이적인 ?...

<ol>
	<li>Carioli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+cancer+mortality+predictions+for+the+year+2021+with+focus+on+pancreatic+and+female+lung+cancer.">European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer.</a> Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).</li><li>Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+in+cancer+biology+and+therapy.">CRISPR in cancer biology and therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).</li><li>Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-Ts:+New+perspectives+in+cancer+therapy.">CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy.</a> FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).</li><li>Shokooohi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+targeted+therapy+and+immunotherapy+on+advanced+nonsmall-cell+lung+cancer+outcomes+in+the+real+world.">Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world.</a> Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).</li><li>Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+strategies+to+target+RAS+signaling+in+human+cancer+therapy.">Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 116 (2021).</li><li>Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroids+as+in+vitro+preclinical+models+for+cancer+research.">Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research.</a> Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).</li><li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stretchable+scaffold+with+electrochemical+sensing+for+3D+culture,+mechanical+loading,+and+real-time+monitoring+of+cells.">A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells.</a> Advanced Science. 8 (13), 2003738 (2021).</li><li>Wartenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+multidrug+resistance+transporter+P-glycoprotein+in+multicellular+tumor+spheroids+by+hypoxia-inducible+factor+(HIF-1)+ad+reactive+oxygen+species.">Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species.</a> FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (8), 583-592 (2006).</li><li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension:+How+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Br&#252;ningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumour+spheroids+for+the+prediction+of+the+effects+of+radiation+and+hyperthermia+treatments.">3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments.</a> Scientific Reports. 10, 1653 (2020).</li><li>Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+in+non-small-cell+lung+cancer.">The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer.</a> Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening:+The+multicellular+spheroid+model.">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model.</a> Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).</li><li>Carragher, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerns,+challenges+and+promises+of+high-content+analysis+of+3D+cellular+models.">Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models.</a> Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606 (2018).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+morphological+and+physiological+monitoring+of+three-dimensional+tumor+spheroids+using+optical+coherence+tomography.">Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59020 (2019).</li><li>Yazdanfar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+robust+image-baed+autofocusing+for+digital+microscopy.">Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy.</a> Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+evaluation+of+tumor+spheroid+behavior+in+3D+culture+using+deep+learning-based+recognition.">Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition.</a> Biomaterials. 22 (272), 120770 (2021).</li><li>Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+models+and+their+use+for+the+testing+of+immunotherapies.">3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 603640 (2020).</li><li>Anastasiou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+factors+shaping+the+cancer+metabolism+landscape.">Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape.</a> British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+clinical+significance+of+mechanical+tumor+microenvironment:+Cancer+cell+sensing,+mechanobiology+and+metastasis.">Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis.</a> Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).</li><li>Zhu, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+KRAS+cancers:+From+druggable+therapy+to+druggable+resistance.">Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance.</a> Molecular Cancer. 21 (1), 159 (2022).</li><li>Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+in+vitro+tumor+models+for+cell-based+immunotherapy.">Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy.</a> Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).</li><li>Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hanging-drop+multicellular+spheroids+as+a+model+of+tumor+angiogenesis.">Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis.</a> Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).</li><li>Costa, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroids:+An+overview+on+the+tools+and+techniques+used+for+their+analysis.">3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis.</a> Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).</li><li>Sant, S., Johnston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+3D+tumor+spheroids+for+cancer+drug+discovery.">The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening:+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Scientific Reports. 6, 19103 (2016).</li></ol>

미세 환경은 종양 성장에 중요한 역할을 합니다. 그것은 세포 외 기질, 산소 구배, 영양 및 기계적 상호 작용의 제공에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 유전자 발현, 신호 경로 및 종양 세포의 많은 기능에 영향을 미칠 수 있습니다 19,20,21. 많은 경우에, 2D 세포는 그러한 효과를 내지 못하거나 심지어 반대 효과를 생성하여, 약물 ...

암은 인간이 가장 두려워하는 질병 중 하나이며, 특히 높은 사망률때문에 1. 최근 몇 년 동안 새로운 치료법이 도입됨에 따라 암 치료 가능성이 높아졌습니다 2,3,4,5. 2차원(2D) 및 3차원(3D) 체외 모델은 실험실 환경에서 암을 연구하는 데 사용됩니다. 그러나 2D 모델은 항종양 민감도를 나타내는 모든 중요한 매개변수를 즉각적이고 정확하게 평가할 수 없습니다. 따라서 약물 치료 테스트에서 생체 내 상호작용을 완전히 나타내지 못한다6.
2020년부터 글로벌 3차원(3D) 문화 시장이 크게 성장했습니다. NASDAQ OMX의 한 보고서에 따르면 3D 세포 배양 시장의 글로벌 가치는 2025년 말까지 27억 달러를 초과할 것입니다. 2D 배양 방법과 비교하여 3D 세포 배양은 증식 및 분화뿐만 아니라 장기 생존을 위해 최적화할 수 있는 유리한 특성을 나타냅니다 7,8. 이러한 수단을 통해 생체 내 세포 미세 환경을 시뮬레이션하여 보다 정확한 종양 특성화와 대사 프로파일링을 얻을 수 있으므로 게놈 및 단백질 변화를 더 잘 이해할 수 있습니다. 이로 인해 3D 테스트 시스템은 이제 주류 약물 개발 작업, 특히 새로운 항암제 스크리닝 및 평가에 중점을 둔 작업에 포함되어야 합니다. 스페로이드 구조에서 불멸화된 확립된 세포주 또는 일차 세포 배양의 3차원 성장은 저산소증 및 약물 침투와 같은 종양의 생체 내 특징뿐만 아니라 세포 상호작용, 반응 및 내성을 가지며, 시험관 내 약물 스크리닝을 수행하기 위한 엄격하고 대표적인 모델로 간주될 수 있습니다 9,10,11.
그러나 이러한 3D 배양 모델에는 해결하는 데 시간이 걸릴 수 있는 몇 가지 문제가 있습니다. 세포 스페로이드는 이러한 프로토콜을 사용하여 형성될 수 있지만, 배양 시간 또는 매립 겔(12)과 같은 특정 세부사항에서 상이하므로, 이러한 구성된 세포 스페로이드는 제한된 크기 범위 하에서 잘 제어될 수 없다. 스페로이드의 크기는 생존력 테스트 및 이미징 분석의 일관성에 영향을 미칠 수 있습니다. 성장 미세 환경과 성장 인자 또한 다양하며, 이는 세포 간의 분화의 차이로 인해 다른 형태를 초래할 수 있다13. 이제 제어된 크기로 모든 유형의 종양을 구성하기 위한 표준적이고 간단하며 비용 효율적인 방법이 분명히 필요합니다.
또 다른 관점에서, 형태, 생존력 및 성장률을 평가하기 위해 균질한 분석 및 고함량 이미징 접근법이 개발되었지만, 종양 스페로이드의 위치, 크기 및 형태의 균일성 부족과 같은 문헌에 보고된 다양한 이유로 3D 모델의 고처리량 스크리닝은 여전히 도전 과제로 남아 있습니다14,15,16.
여기에 제시된 프로토콜에서는 3D 종양 스페로이드 구성의 각 단계를 나열하고 다른 유리한 특성 중에서 자동 초점, 자동 이미징 및 분석을 포함하는 고처리량, 고함량 이미징 시스템을 사용하여 스페로이드 관찰 및 분석 방법을 설명합니다. 우리는 이 방법이 어떻게 고처리량 이미징에 적합한 균일한 크기의 3D 종양 스페로이드를 생성할 수 있는지 보여줍니다. 이러한 스페로이드는 또한 암 약물 치료에 대한 높은 민감도를 나타내며 고함량 이미징을 사용하여 스페로이드의 형태학적 변화를 모니터링할 수 있습니다. 요약하면, 우리는 약물 평가 목적을 위한 3D 종양 구조를 생성하는 수단으로서 이 방법론의 견고성을 입증합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Pipette tips</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>T-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5&#160;mL Boil proof microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000&#956;L Pipette tips</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L Pipette tips</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>T-200-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D gel</td>
			<td>Avatarget</td>
			<td>MA02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well U bottom Plate</td>
			<td>Avatarget</td>
			<td>P02-48UWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>&#160;DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>#07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Certified FBS</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>W433884-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel sofware&#160;</td>
			<td>Microsoft office</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism sofware&#160;</td>
			<td>GraphPad software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Content Microscope and SMART system</td>
			<td>Avatarget</td>
			<td>1-I01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51300-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin Sol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Fluoroskan Ascent</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Fluoroskan Ascent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flask</td>
			<td>JET Biofil</td>
			<td>TCF012050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.25% (1X)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3d tumor spheroids for drug evaluation studies

최근 수십 년 동안 단층 배양 세포 외에도 3차원 종양 스페로이드가 항암제 평가를 위한 잠재적으로 강력한 도구로 개발되었습니다. 그러나 종래의 배양 방법은 3차원 수준에서 균질한 방식으로 종양 스페로이드를 조작하는 능력이 부족합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 본 논문에서는 평균 크기의 종양 스페로이드를 구성하는 편리하고 효과적인 방법을 제시합니다. 또한 전체 플레이트를 스캔하고 3차원 스페로이드에 대한 데이터를 얻을 수 있는 인공 지능 기반 분석 소프트웨어를 사용한 이미지 기반 분석 방법에 대해 설명합니다. 몇 가지 매개 변수가 연구되었습니다. 표준 종양 스페로이드 구성 방법과 고처리량 이미징 및 분석 시스템을 사용하면 3차원 스페로이드에서 수행되는 약물 테스트의 효과와 정확성을 크게 높일 수 있습니다.

그림 1A,B는 이 연구에서 종양 스페로이드를 구성하는 데 사용된 프로세스를 보여줍니다. 우리는 먼저 48웰 U자형 바닥 플레이트에 세포를 시드했습니다. 이 단계는 2D 세포 배양에 사용되는 단계와 거의 동일합니다. 우리는 우물을 둘러싸고 있는 물이 있는 공통 인큐베이터에 플레이트를 보관하여 증착된 세포가 자가 조립 과정에서 스페로이드를 형성하기 시작?...

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Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

이 글에서는 3차원 종양 스페로이드를 구성하기 위한 표준화된 방법을 보여줍니다. 자동화된 이미징 시스템을 사용한 스페로이드 관찰 및 이미지 기반 딥러닝 분석을 위한 전략도 설명합니다.

약물 평가 연구를 위한 3D 종양 스페로이드 생성

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

이 프로토콜은 스페로이드의 3차원 종양을 구성하는 표준화된 방법을 보여주었습니다. 그리고 이 방법론은 3D 종양 구축물의 높은 회로 및 높은 함량 분석을 제공했습니다. 표준 종양 스페로이드 구성 방법과 고처리량 이미징 및 분석 시스템을 사용하여 3차원 스페로이드에서 형성된 약물 테스트의 효과와 정확성을 크게 높일 수 있습니다.이 프로토콜에서는 NCI-H23 스페로이드를 예로 처리하기 위해 AMG510을 사용했습니다. 실험에서 우리는 종양 스페로이드에 대한 암 표적 약물의 유의미한 효과를 관찰할 수 있었습니다. 먼저, 100마이크로리터의 유착방지 시약을 U자형 웰 바닥이 있는 48웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅하고 10분 동안 유지합니다.10분 후, 코팅 시약을 흡인하고 멸균된 PBS로 2회 세척한다. 섭씨 37도의 인큐베이터에 배양 접시를 넣고 5% 이산화탄소가 함유된 가습된 공기에서 사용할 때까지 넣습니다. 현미경으로 세포를 관찰하십시오.그 후, T25 플라스크에서 배양된 세포를 PBS로 2회 세척하여 배양액을 제거하고, 팽창된 세포를 섭씨 37도의 배양기에서 1 내지 2분 동안 0.25% 트립신 EDTA로 1 밀리리터, 5% 이산화탄소로 처리하였다. 현미경으로 세포 모양을 확인합니다. 사용된 트립신 EDTA 현탁액을 T25 플라스크에 흡인하여 트립신 처리를 중단한 후 4밀리리터의 신선한 배지로 세포를 세척한다.모든 현탁액을 15 밀리리터 튜브로 옮기고 1 밀리리터의 신선한 배지를 사용하여 잔류 세포를 씻어 내고 튜브에 첨가하십시오. 세포를 실온에서 5분 동안 186.48G에서 원심분리하고 상층액을 버립니다. 세포 펠릿에 10 밀리리터의 신선한 배지를 첨가하고 세포가 균질 한 현탁액이 될 때까지 부드럽게 피펫팅합니다.0.1 밀리리터의 세포 현탁액을 새로운 원심분리기 튜브로 흡인한다. 0.9 밀리리터의 신선한 배지를 첨가 한 다음 현탁액을 잘 피펫팅하십시오. 세포 계수를 위해 10 마이크로리터의 세포 현탁액을 추출한다.이 과정을 한두 번 반복하고 평균값을 구합니다. 현탁액을 희석하여 밀리리터 당 50, 000 세포의 최종 파종 밀도에 도달하십시오. 다음으로, 200 마이크로리터의 세포 현탁액을 48 웰 U자형 바닥판의 각 웰에 첨가한다.플레이트 주위에 밀봉 필름을 감싸고 실온에서 5분 동안 119.35G에서 원심분리합니다. 원심 분리 후 보호 필름을 떼어 내고 5-8 밀리리터의 멸균 된 물을 우물을 둘러싼 수로에 첨가하십시오. 플레이트를 섭씨 37도에서 5일 동안 배양합니다.이 기간 동안 수로에 물을 바꾸거나 보충하지 말고 다음 5일 동안 세포 응집을 관찰하십시오. 젤 임베딩의 경우 섭씨 영하 20도의 냉장고에서 얼린 젤을 꺼낸 후 실험 중 내내 아이스박스에 올려 놓는다. 현미경으로 세포 스페로이드를 관찰합니다.젤 임베딩이 시작되기 전에 스페로이드의 상태를 다시 확인해야 합니다. 150마이크로리터의 배지를 조심스럽게 제거하고 미리 냉각된 피펫 팁을 웰 주변과 내부로 이동하면서 웰의 벽 쪽에서 액체 젤을 천천히 추가하여 각 스페로이드를 젤에 삽입합니다. 5분 동안 기다렸다가 젤이 고르게 퍼지지 않으면 10마이크로리터 피펫 팁으로 젤을 부드럽게 피펫팅합니다.각 웰에는 종양 스페로이드, 밀리리터 겔당 3.5밀리그램의 25마이크로리터 및 50마이크로리터의 완전한 배양 배지가 들어 있습니다. 컨트롤에 75마이크로리터의 매체도 추가합니다. 하이드로겔화가 완전히 완료될 때까지 플레이트를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.현미경으로 겔화 상태를 확인합니다. 각 샘플에 125마이크로리터의 신선한 배지를 오버레이하고 스페로이드를 7-10일 동안 추가로 배양합니다. 각각 4-6개의 웰이 있는 스페로이드 그룹을 준비하고 분석을 위해 그 중 최소 3개를 선택합니다.제조업체의 지침에 따라 약물을 용해시키고 DMSO로 100 배 작업 용액을 준비하십시오. 0.1%DMSO를 양성 대조군으로 사용하고 125마이크로리터의 약물 처리 배지를 각 웰에 추가합니다. 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 다시 넣고 5%이산화탄소가 함유된 가습 공기에 넣습니다.이 단계에서, 각 웰은 종양 스페로이드, 밀리리터 겔 당 3.5 밀리그램의 25 마이크로리터, 및 175 마이크로리터의 배지를 함유한다. 대조군에는 200마이크로리터의 매체가 포함되어 있습니다. 제조업체의 지침에 따라 alamarBlue 분석 키트를 사용하여 스페로이드 생존력을 측정합니다.각 웰로부터 100 마이크로리터의 상청액 배지를 새로운 시험 플레이트로 흡인한다. 그 후, 마이크로플레이트 광도계를 이용하여 생존율을 측정하였다. 1일차, 4일차, 7일차, 10일차에 스페로이드를 젤에 삽입한 후 측정합니다.80 마이크로리터의 신선한 배지를 배양 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 그런 다음 약물 처리 배지 100 마이크로 리터를 교체하십시오. 우물에 alamarBlue의 잔해가 없는지 확인하십시오.이미징 전에 100마이크로리터의 배지를 흡인하고 플레이트를 스테이지에 놓습니다. 10배 대물렌즈를 가진 자동 현미경을 사용하여 스페로이드의 디지털 이미지를 얻을 수 있습니다. 현미경은 이러한 스페로이드에 자동으로 초점을 맞추고 중앙 집중화할 수 있습니다.자동 이미징을 기다립니다. 각 스페로이드에 대해 4개의 이미지가 획득됩니다. 통합 이미지는 High Content Imaging System에 연결된 소프트웨어로 형성되고 처리됩니다.이미지 패치 프로세스 버튼을 클릭하고 소프트웨어에서 통합 이미지를 선택합니다. U net model을 선택하고 전환율을 입력합니다. 화면 하단의 을 클릭하여 이미지 처리를 시작합니다.지름, 둘레 및 거칠기 데이터를 스프레드시트 소프트웨어에 저장합니다. 마지막으로, 약물과 함께 100 마이크로 리터의 신선한 배지를 첨가하고 5 % 이산화탄소로 가습 된 공기에서 섭씨 37 도의 인큐베이터에 플레이트를 다시 넣습니다. 이 그림에는 다양한 농도의 AMG510으로 처리되고 고함량 현미경으로 자동 캡처된 NCI-H23 세포 스페로이드의 명시야 이미지가 나와 있습니다.열은 서로 다른 요일을 나타내고 행은 서로 다른 약물 농도를 나타냅니다. 결과에는 각 조건에 대한 3개의 스페로이드가 포함됩니다. AMG510 처리된 샘플 그룹의 종양 스페로이드 생존율은 1일, 4일, 7일 및 10일에 측정되었습니다.농도 구배가 있는 샘플의 말단 세포 생존율이 이 그림에 나와 있습니다. 종양 스페로이드 직경은 1일차, 4일차, 7일차 및 10일차에 측정되었습니다. 스페로이드 성장 비율은 원래 부피에 대한 말단 부피로 정의되었으며 스페로이드 직경을 사용하여 계산되었습니다.스페로이드 성장 억제 비율은 부피를 기준으로 정의하고 스페로이드 직경을 사용하여 계산했습니다. 종양 거칠기는 1일차, 4일차, 7일차 및 10일차에 소프트웨어로 측정되었으며, 이는 종양 스페로이드의 침습성을 나타냅니다. 스페로이드의 둘레는 딥 러닝 알고리즘을 사용하여 소프트웨어에 의해 위치되고 그려졌습니다.그런 다음 초점면의 스페로이드 영역을 이미지 J로 측정하고 이러한 데이터를 기반으로 초과 주변 지수를 계산했습니다. 이 메시지는 따르기 쉽지만 샘플은 여전히 신중하게 처리해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

종양의 전이에 저산소증의 테스트 효과에 대한 생체 내 모델에서

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

연구

암 연구학

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

종양 대상 Immunomodulation에 대 한 paramyxoviruses: 설계 및 평가 전 비보

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

경도 형태 및 생리 적인 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 3 차원 종양 Spheroids의 모니터링

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

작은 창자 신경 내분비 종양 스페로이드의 설치 그리고 특성화

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

종양-기질 상호 작용 및 약물 발견을 연구하기 위한 새로운 기질 섬유아세포 변조 3D 종양 스페로이드 모델

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...