우리의 프로토콜을 통해 연구자들은 미토콘드리아 에너지 대사와 원활한 구상체를 조사하여 여러 가지 세포주, 세포 수 및 표현형뿐만 아니라 현장 약물 발견 및 암 연구에서 약물 치료를 비교할 수 있습니다. 우리의 연구는 세포 단층 실험에 비해 우수한 생리 모델을 제공하는 3D 구상체를 사용하여 미토콘드리아 에너지 대사를 탐구하기위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 생물학적 관찰은 유리체 구상체에서 생체 내 종양으로 외삽하고 스페로이드 종양 대사를 표적으로 할 수있는 경로를 식별 할 수 있습니다.
예를 들어, 구상체 성장 동안 탄수화물 유용성. 모든 데이터 해마 세포 외 플럭스 96 기기는 매우 민감합니다. 분석 플레이트 내의 시험관내 구상체 위치화는 단일 스페로이드 수준에서 정확한 데이터를 얻는 데 가장 중요하다.
4x 배율에서 위상 대비가 있는 반전된 광학 현미경을 사용하여 스페로이드 생존력을 확인하여 시료 간의 온전한 스페로이드 구조, 형태학 및 전반적인 균일성을 보장합니다. 센서 카트리지에 수분을 공급하려면 약 20밀리리터의 교정제를 원뿔형 튜브에 넣습니다. 교정제가 들어있는 원뿔형 튜브를 이산화탄소가 아닌 섭씨 37도 인큐베이터에 밤새 놓습니다.
분석 키트의 내용물을 꺼내십시오. 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓습니다. 200 마이크로리터의 멸균 이중 증류수를 다채널 P300 피펫을 이용하여 유틸리티 플레이트의 각 웰에 피펫한다.
센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 위에 놓습니다. 각 웰의 수위가 센서 프로브를 잠글 수 있을 만큼 충분히 높은지 확인합니다. 조립된 센서 카트리지를 이산화탄소가 아닌 섭씨 37도 인큐베이터로 옮기고 밤새 그대로 둡니다.
스페로이드 분석 마이크로플레이트를 코팅하기 위해, 패혈성 기술을 사용하여 스페로이드 마이크로플레이트의 웰 당 밀리리터 당 30 마이크로리터의 멸균 0.1 밀리그램의 폴리-D-라이신 용액을 첨가한다. 스페로이드 마이크로플레이트의 각 웰에서 용액을 흡인하고, 플레이트를 반전시킨 다음, 티슈 페이퍼 위에 단단히 두드려 잔류 용액을 제거합니다. 플레이트의 각 웰을 200 마이크로 리터의 멸균 이중 증류수로 씻으십시오.
최종 세척 후, 마이크로플레이트를 뒤집어 티슈 페이퍼 위에 단단히 두드려 잔류 물을 제거한다. 플레이트를 나중에 사용하기 전에 30 분 동안 공기 건조시킵니다. 원고에 기재된 대로 XF RPMI 배지를 준비한다.
보충된 XF RPMI 분석 배지를 분석 한 시간 전에 섭씨 37도로 예열합니다. 코팅된 스페로이드 분석 마이크로플레이트를 이산화탄소가 아닌 섭씨 37도 인큐베이터에서 예열한다. 교정제와 센서 카트리지가 들어있는 원뿔형 튜브를 공기 인큐베이터에서 꺼냅니다.
유틸리티 플레이트에서 센서 카트리지를 분리하고 작업 표면에 거꾸로 놓습니다. P300 다채널 피펫을 사용하여 유틸리티 플레이트에서 물을 흡인하고 버립니다. 200 마이크로리터의 예열 교정제를 유틸리티 플레이트의 각 웰에 첨가하십시오.
센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 올려 놓으면 센서가 캘리브란트에 잘 잠겨 있는지 확인합니다. 조립된 센서 카트리지를 포트 주입 용액을 로드할 준비가 될 때까지 비이산화탄소, 섭씨 37도 인큐베이터로 옮깁니다. 인큐베이터에서 스페로이드 배양 플레이트를 꺼내어 현미경으로 구상체를 관찰하여 스페로이드 전달 단계 전에 무결성을 보장합니다.
180 마이크로리터의 예온 분석 배지를 임의의 배경 보정 웰을 포함하는 스페로이드 플레이트의 각 웰에 로딩한다. 일곱 센티미터의 페트리 접시를 세 밀리리터의 분석 배지로 부분적으로 채운다. 96 웰 배양 플레이트에서 구상체를 페트리 접시로 옮기고, 넓은 오리피스 피펫 팁이 로딩된 다채널 피펫을 사용하고, 부피를 10 내지 50 마이크로리터로 설정한다.
넓은 오리피스 피펫 팁이 장착 된 단일 채널 피펫터의 부피를 20 마이크로 리터로 설정하고 조심스럽게 단일 구상체를 흡인하십시오. 팁을 이 스페로이드 분석 마이크로플레이트의 각 웰의 중앙에 직접 배치하고 모세관 작용이 피펫 팁으로부터 스페로이드를 인출하도록 허용한다. 피펫터의 내용물을 페트리 접시에 다시 피펫팅하여 현미경으로 진화를 확인하십시오.
일단 이 모든 구상체가 스페로이드 분석 마이크로플레이트로 옮겨지면, 플레이트를 최소 한 시간 동안 섭씨 37도 비이산화탄소 인큐베이터로 옮긴다. 원고에 기재된 바와 같이 각 화합물의 작업 스톡 농도를 준비하고, 완전히 보충된 예열 XF RPMI 분석 배지를 사용한다. 보정된 P100 다중 채널 피펫을 사용하여 각 화합물의 작업 용액 20 마이크로리터를 모든 해당 포트에 분배했습니다.
센서 카트리지를 로드하기 위한 분석기를 준비합니다. 잘 형성된 콤팩트한 구상체를 얻기 위해, 각 세포주는 시딩 밀도 및 배양 기간 동안 개별적으로 최적화되었다. 최적화된 시딩 전략에서, SK-OV-3의 스페로이드 부피는 7마이크로미터 큐베이션으로 약 5.46 x 10이었고, A549의 경우 1.45 x 10 내지 8마이크로미터 큐베이션이었다.
모든 스페로이드 유형은 초기 시딩 밀도와 스페로이드 부피 사이의 선형 상관 관계를 가졌다. 완벽한 스페로이드 대칭은 1.0의 원형을 가지며 1.0으로부터의 편차는 원형성의 손실을 나타냈다. 모든 스페로이드 유형에 대해 산소 소모율은 스페로이드 크기에 따라 증가했으며 MCF-7 구상체에서 가장 높고 SK-OV-3 구상체에서 가장 낮은 스페로이드 부피와 선형적으로 상관 관계가 있습니다.
MCF-7 구상체는 실험 전반에 걸쳐 비히클 제어에 반응하지 않았다. MCF-7 구상체에서의 산소 소모율은 밀리리터 당 0.5 마이크로그램의 첫 번째 주사 후 5개의 측정 사이클 후에 올리고마이신으로 낮아졌다. BAM15에 반응하여, 산소 소모율은 두 번째 주입 전에 증가하였다.
반면 로테논과 안티마이신 A의 조합은 그것을 낮췄다. 기저 미토콘드리아 호흡을 정확하게 조사하기 위한 프로토콜입니다. ADP 인산화 호흡, 누출 호흡, 결합 효율, 최대 호흡 용량 및 예비 호흡 용량은 암 유래 3D 구상체를 사용하여 개발되었습니다.
모든 호흡기 화합물은 웰 당 분당 산소의 20 내지 30 피코몰의 평균 꾸준한 기저 호흡률을 드러내는 선택된 화합물에 대한 예상된 동역학적 산소 소모율 프로파일을 산출하였다. 마이크로플레이트 내의 구상체의 위치와 화합물 주입 후 측정주기 번호는 화합물 첨가 사이에 호흡률이 안정한지 확인하기 위함이다. 언커플러와 함께 미토콘드리아 호흡 능력을 탐구 할 때, 집중력이 중요할뿐만 아니라 미토콘드리아 에너지 대사를 조사하는 실험에서 언커플러 전에 일반적으로 첨가되는 올리고 마이신의 존재하에 호흡을 분리 할 수있는 능력도 중요합니다.
