잘 분화 된 SBNET 세포는 천천히 성장하고 전파하기 어렵다. 몇몇 확립된 세포주는 연구원에 쉽게 유효하지 않습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 이 3D 배양 프로토콜을 개발했습니다.
SBNET 세포주를 확립하는 전통적인 방법에 비해 이 기술의 장점은 3D 배양을 얻을 수 있고 약물 검사를 3주 이내에 수행할 수 있다는 것이다. 이 방법은 췌장에서 신경 내분비 종양과 같은 다른 신경 내분비 종양에 적용 될 수있다. 절제된 환자 SBNET 샘플을 얻은 후 5밀리미터 큐브로 잘라 서 운송을 위한 원문 튜브에 DMEM F12 배지의 25 밀리리터에 저장합니다.
15 분 동안 원고 지시에 따라 준비 된 세척 매체에서 종양을 배양합니다. 그런 다음 새 접시에 옮기고 멸균 곡선 가위를 사용하여 1밀리미터 미만의 조각으로 다진다. 다진 조직을 세척 매체 25밀리리터를 포함하는 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮긴 다음, 샘플을 섭씨 4도에서 15분 동안 500배 g로 원심분리합니다.
상체를 버리고 콜라게나아제와 DNase로 세척 매체의 10 밀리리터에 펠릿을 다시 분리합니다. 다진 종양이 섭씨 37도에서 90분 동안 느리게 흔들리는 것을 허용합니다. 종양 샘플을 과도하게 소화하지 않는 것이 중요합니다.
너무 많은 효소 또는 더 긴 잠복기 는 SBNET 세포를 죽일 것입니다. 소화가 완료되면 튜브를 섭씨 4도에서 15분 동안 500배 g로 원심분리합니다. 상체를 버리고 15 밀리리터의 세척 매체로 펠릿을 다시 놓습니다.
새로운 50 밀리리터 튜브 위에 70 마이크로미터 셀 스트레이너를 배치하고 스트레이너를 통해 세척 버퍼의 10 밀리리터를 전송합니다. 튜브 내부의 세척 버퍼를 소용돌이쳐 세포가 측면에 달라붙지 않도록 합니다. 그런 다음 여과기를 통해 셀 서스펜션을 필터링합니다.
섭씨 4도에서 15분 동안 500배 g의 원심분리. 상체를 버리고 200 마이크로리터의 세척 매체에 펠릿을 다시 놓습니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 혈종계로 셀 카운트에 셀의 5 마이크로리터를 사용합니다.
세포의 수를 계산한 다음 원심분리를 반복하여 상신체를 제거하고 밀리리터당 백만 개의 세포농도로 액체 ECM의 세포를 재연한다. 다음으로, ECM에 있는 SBNET 스페로이드 5~20마이크로리터를 ECM에 96웰 플레이트로 옮기고, 액체 ECM이 고화될 수 있도록 섭씨 37도에 플레이트를 놓는다. 이전에 설명한 바와 같이 줄기 세포 배지에서 구균 또는 배양스포지드를 포함하는 각 우물에 SBNET 배양 배지의 200 마이크로리터를 첨가한다.
P1000 파이펫을 사용하여 오르가노이드를 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 1분 동안 1, 500배 g의 원심분리기로 튜브를 원심분리하여 상체를 제거합니다. PBS와 원심분리기 의 1 밀리리터로 문화를 씻어 주체를 제거합니다. 그런 다음 파라포름알데히드의 500 마이크로 리터를 추가하고 15 분 동안 배양하여 오르가노이드를 수정합니다.
인큐베이션 후 PBS의 1 밀리리터로 문화를 두 번 씻으시다. 3%BSA와 0.1%트리톤 X-100으로 PBS 500 마이크로리터를 추가하여 문화를 침투합니다. 튜브를 5분 동안 배양한 다음 PBS 1밀리리터와 3%BSA로 오르가노이드를 세 번 세척합니다.
다음으로, 1차 항체로 배양한 다음 PBS 및 BSA로 세차를 반복한다. 이차 항체로 배양하고 모든 수퍼나티를 흡인하고 폐기하는 것을 확인하는 세차재를 반복합니다. 스페로이드를 이미지화하려면 DAPI가 포함된 마운팅 매체 5마이크로리터를 추가하고 P20 파이펫을 사용하여 스페로이드 5마이크로리터를 유리 슬라이드로 전송합니다.
10, 20 및 40X 목표를 사용하여 형광 현미경으로 슬라이드를 밀봉하십시오. 기계적으로 P1000 파이펫으로 ECM을 분해하고 멸균 1.5 밀리리터 튜브로 전송합니다. 4섭씨에서 1, 000배 g의 원심분리기.
그런 다음 모든 상체를 제거하고 얼음에 튜브를 배치합니다. 펠릿에 새 ECM의 2~4배 의 부피를 추가하고 기포를 도입하지 않도록 10배 위아래로 파이프를 사용하여 튜브의 내용을 혼합합니다. ECM 및 SBNET 혼합물의 5~20마이크로리터를 새로운 96웰 플레이트로 옮기고 ECM이 고화될 수 있도록 한다.
그런 다음 고화된 ECM을 새로운 SBNET 배지로 덮고 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다. SBNET 스페로이드를 다른 실험실로 배송하는 경우 새 ECM을 T25 플라스크로 전송하고 ECM이 응고할 수 있도록 합니다. 플라스크를 SBNET 스페로이드 매체로 채우고 캡을 단단히 고정하고 배송 패키지를 준비합니다.
스페로이드 배양을 받으면 배양 배지를 제거하고 이전 단계를 반복하여 스페로이드를 다시 배양에 넣습니다. SBNET 스페로이드 성장 속도는 현미경 이미징으로 모니터링되었습니다. 문화 매체가 일주일에 한 번 변경될 때 SBNET 스페로이드의 크기가 두 배가 되는 데는 약 14일이 소요됩니다.
문화에서 14 일 후, SBNET 스페로이드는 크기가 증가하지 않습니다. 스페로이드는 시냅토피신, 염색체 A 및 SSTR2에 대한 특정 항체로 염색되고 면역 형광 현미경 검사를 사용하여 이미지화되었다. 데이터는 이 마커가 세포질 및 SBNET 세포의 막에서 국소화된다는 것을 보여주었습니다.
항체의 특이성을 보장하기 위해 시냅토피신, 염색체 A 및 SSTR2를 발현하지 않는 췌장 종양으로부터 유기성 선상에서 동일한 염색 절차가 수행되었으며 녹색 신호는 발견되지 않았다. 면역형광 영상의 주요 장점은 4시간 이내에 수행될 수 있고 면역조직화학과 유사한 염색 정보를 제공할 수 있다는 것이다. SBNET을 스페로이드로 배양하는 것은 SBNET 성장을 저해할 수 있는 약물을 식별하는 데 중요한 기술입니다.
스페로이드는 라파마이신과 mTOR 억제제로 치료되었다. 5 일 후, 라파마이신 처리 스페로이드는 포도 같은 구조를 형성하고 apoptotic 또는 괴사가되었다. 이 절차를 시도할 때, 셀 스트레이너와 수집 튜브를 세척 매체로 미리 적재하는 것이 중요합니다.
이렇게 하면 SBNET 세포가 세포 여과기와 플라스틱 튜브에 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다. 이 프로토콜을 통해 과학자와 임상의는 절제된 종양에서 SBNET 스페로이드 배양을 확립하고 다른 실험실과 공유하고 FDA 승인 약물을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.
