제브라피쉬 이종이이식은 암 연구에 널리 사용되고 있습니다. 당신은 인간의 종양 세포를 가지고 작은 애벌레 얼룩말 물고기에 주입 할 수 있습니다, 또는 성인으로. 여기서 우리가 제시하는 것은 살아있는 동물에서 여러 인간 암 특징을 연구 할 수있는 애벌레 모델의 단계별 프로토콜입니다.
증식을 연구할 수 있고, 혈관신생을 연구할 수 있고, 전이를 연구할 수 있으며, 또한 종양 미세 환경 내에서 상호 작용할 수 있습니다. 그리고 가장 큰 장점은 매우 짧은 시간 프레임에서 이것을 연구 할 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 불과 4 일.
또 다른 큰 장점은 공초점 또는 광시트 현미경을 사용하여 단일 세포 해상도로 이 라이브를 연구할 수 있다는 것입니다. 세포가 이동하는 방법, 세포가 서로 상호 작용하는 방법, 심지어 세포가 서로 어떻게 대화하는지 연구할 수 있습니다. 그래서 암 생물학을 공부하는 것은 정말 강력한 모델입니다.
Zebrafish xenografts는 화학요법, 방사선 요법, 또는 항체를 가진 표적으로 한 치료같이 항암 치료에 대한 반응을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 그리고 마지막으로, 또한, 이 프로토콜은 또한 외과 견본에서 환자 유래 세포를 사용하기 위하여 적응될 수 있고, 또는 생검에서, 그 후 제브라피시 아바타를 생성합니다. 주입을 위한 설정.
주입 2 주 전에, 배양에서 세포를 확장. 많은 세포와 물고기가 훈련 중에 손실되기 때문에, 기술에 능숙해질 때까지 여분의 세포와 과잉 물고기로 시작합니다. 표 중 하나는 여러 세포주 주입을 위한 체외 내 합류의 최적 비율에 대한 자세한 가이드가 있습니다.
주입 3 일 전에 원하는 배경의 제브라피시를 교차합니다. 주입 24 시간 전. 제브라피시 배아 판을 청소하십시오.
모든 죽은 및 비 개발 된 배아를 버리고 E3 배지를 새로 고칩니다. 세포 배양실에서, 세포 배양 배지를 폐기한다. PBS 1X로 한 번 씻고 죽은 세포를 제거하고 신선한 매체를 추가하십시오.
주입 바늘, 아가로즈 플레이트 및 헤어핀과 같은 주사 절차를 위한 공구를 준비하여 주사를 위해 배아를 정렬합니다. 플레이트 준비를 위해 깨끗한 페트리 접시 뚜껑에 용해된 2% 아가로즈 1층을 붓습니다. 그것은 중합하고 통치자의 도움으로, 배아의 정렬을 위해 3 ~ 4 개의 직선 아가로즈 라인을 만들 수 있습니다.
주사 일. 해치되지 않은 계란에서 부화 배아를 분리합니다. 이 단계에서 배아 배지에 Pronase를 추가하면 부화가 향상 될 수 있습니다.
배아를 주입 할 때까지 섭씨 28도에서 인큐베이터에 넣습니다. 주입을 위한 세포 라벨링. 재현 가능한 세포 라벨링 기술의 수립을 돕기 위해 셀라인 목록 및 여러 라벨링 솔루션의 컴파일을 위해 작성된 프로토콜 중 하나와 두 개의 테이블을 확인합니다.
세포 배양 배지를 제거하고 PBS 1X로 플라스크를 두 번 세척합니다. 광질염으로 세포를 라벨, 빛에 노출을 피하고, 37도에서 플라스크를 배양. 또한 분리 시 1.5ml 마이크로 센실리후지 튜브에 셀에 라벨을 붙일 수도 있습니다.
세포 라벨링 용액을 제거하고 PBS 1X로 셀을 세척하여 과도한 염료를 제거합니다. 해당 분리제를 추가하고 세포를 섭씨 37도에서 배양합니다. 플라스크를 멸균 세포 스크레이퍼로 칫솔질하여 분리 과정을 용이하게 하고 혈청학적 파이펫으로 세포를 수집합니다.
세포를 1.5ml 마이크로원심분리기 튜브및 원심분리기로 옮기. 상류체를 버리고 세포 배양 배지로 펠릿을 다시 중단하십시오. 트라이판 블루 배제 또는 다른 선택의 방법으로 Neubauer 챔버를 사용하여 세포 생존 가능성을 정량화합니다.
원심분리기 및 주사 배지에서 세포를 다시 중단한다. 매체에 있는 세포의 추천한 농도는 원고의 표 에서 찾아볼 수 있습니다. 이 시점부터 세포는 얼음 위에 보관해야 합니다.
사출 절차. 트리카인 1X에서 5분 동안 배아를 마취시화합니다. 그런 다음 소량의 마취 배아를 아가로즈 플레이트로 옮기고 헤어핀 루프의 도움으로 정렬합니다.
배아 사이의 거리를 유지하십시오. 특히 하나의 노른자와 다음 하나의 머리 사이에. 사망률을 방지하기 위해, 정렬 된 배아가 조심스럽게 접시에 트리사인 1X 용액의 1 ~ 3 방울을 추가하여 아가로즈 플레이트에서 건조하지 않도록하십시오.
마이크로센트심분리기 튜브를 가볍게 탭하여 세포를 다시 중단합니다. 마이크로 로더 팁을 사용하여 세포 현탁액으로 주사 바늘을 역로드하여 배아의 무결성을 손상시킬 수 있기 때문에 기포를 피하십시오. 기압 밸브를 열고 마이크로 인젝터를 설치하고 미세 주입 바늘을 조심스럽게 홀더에 넣습니다.
팁 에 가까운 미세 주입 바늘을 잘라. 조심스럽게 배아의 노른자를 관통하여 바늘의 각도를 낮추고 바늘 끝이 각면이 인식 공간에 도달할 때까지 조심스럽게 밀어 넣습니다. 팁이 인식 공간에 있으면 세포를 주입하십시오.
배아의 눈크기와 유사한 세포의 양을 주입하고 심장 부종을 예방하기 위해 심장에서 가능한 한 멀리 주입하십시오. 필요한 경우 마이크로 인젝터 압력을 조정합니다. 주입된 배아를 트리카인 1X 용액으로 깨끗한 페트리 접시에 옮기고 5~10분 동안 쉬게 합니다.
이것은 상처가 닫히는 시간을 줄 것입니다. 트리사인 1X 용액을 제거하고 신선한 E3 배지를 추가합니다. 그런 다음, 섭씨 34도에서 배아를 배양합니다.
이 온도는 제브라피시 배아와 인간 종양 세포의 생존을 허용할 것입니다. 전이성 분석. 세포주의 전이성 전위잠재력을 연구하고 싶은 경우, 약 1시간 후 주사후, 형광 스테레오현미경에 주입된 배아를 선별하고, 순환하는 암세포의 부재 또는 존재에 따라 두 그룹으로 분류하십시오.
언젠가 사후 주입. 형광 스테레오 현미경에, 주의 깊게 각 배아를 분석하고 제대로 주입 종양을 가진 사람들을 선택합니다. 종양 크기에 따라 선택한 이종이 이식을 정렬합니다.
비교를 위해 눈의 크기를 사용합니다. 비정상적인 형태, 심장 또는 노른자 부종, 암세포가 거의 없는 이종이이식, 또는 노른자 내부에서만 암세포를 가진 배아를 폐기하십시오. 원하는 실험 레이아웃에 따라 xenografts를 배포하고 약물 분석을 시작합니다.
매일 약물과 E3 배지를 교체하십시오. xenografts를 배양하여 분석이 끝날 때까지 섭씨 34도의 온도를 유지합니다. 4 일 후 주입.
분석의 마지막 날에, 트리카인 1X 용액으로 이종이 이식을 마취하고, 신중하게 한고판에 정렬합니다. 죽거나 부어 오른 제노이식을 버리십시오. 이러한 이 종이 이식은 이식 정량화에 대해 간주되지 않습니다.
형광 스테레오 현미경에서 각 이종이 접목을 신중하게 분석하고 각 xenograft를 분석하고 각 지각 공간에서 종양의 부재 또는 존재를 평가합니다. 실험 적인 설정에 따르면, 관심의 xenografts를 선택 하 고 트리카인 25X로 안락사. 면역 염색을 진행하기 위해 실온에서 적어도 4 시간 동안 4 % 포름알데히드로 고정하십시오.
그렇지 않으면, 섭씨 4도에서 하룻밤을 저장하고 다음 날에, 100 % 메탄올로 포름알데히드를 대체합니다. 100% 메탄올에 고정된 제노이식은 20도 무기한으로 보관할 수 있습니다. 공초점 이미징을 위한 전체 마운트 면역 염색.
전체 산 면역 형광 기술은 다음과 같이 나누어 3 일이 걸립니다. 첫날은 이종이이식및 1차 항체 배큐어의 투과화를 위한 것이다. 둘째 날, 세척 및 이차 항체 배양을 위한 것입니다.
그리고 셋째 날, 마운팅 매체에 제노이식 및 보관의 세척, 고정. 이 절차에 대한 자세한 내용은 함께 제공되는 PDF에서 확인할 수 있습니다. xenografts의 장착.
커버 슬립의 가장자리를 석유 젤리 또는 실리콘 그리스로 밀봉하여 장착 매체가 누출되지 않도록 하십시오. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 이종이 접목을 커버 슬립으로 옮습니다. 조심스럽게 머리핀에 정렬합니다.
마운팅 매체를 다른 커버 슬립에 추가합니다. 두 커버 슬립을 조심스럽게 결합하고 쉽게 조작 할 수 있도록 현미경 슬라이드 위에 배치하십시오. 공초점 이미징.
물 보정을 갖춘 아포오틱 25X 침지 목표 렌즈는 단일 세포 해상도를 가진 이미징 종양에 최적입니다. 각 슬라이스 사이에 5미크론 간격으로 Z-Stack 함수를 사용하여 샘플을 획득합니다. 피지 소프트웨어에서 원시 데이터를 엽니 다.
xenograft 당 z 스택 당 상단, 중간 및 아래에서 종양의 세 가지 대표적인 조각을 선택합니다. 피지 소프트웨어에서 셀 카운터 플러그인을 엽니 다. 셀 카운터 도구에서 초기화를 클릭하고 카운터 유형을 선택하고 이미지를 클릭하여 수동으로 계산 모드를 시작합니다.
클릭 할 때마다 카운터는 셀수를 계산하는지 묻습니다. 종양내의 총 세포 수를 얻으려면 다음 수식을 사용하십시오. 면역 세포, 미토틱 수치, 활성화된 caspase와 같은 마커의 총 숫자 또는 백분율을 평가하기 위해 셀 카운터 플러그인을 사용하여 z 스택의 모든 조각을 따라 관심있는 특정 라벨링, 마커 또는 변형에 긍정적 인 세포를 수동으로 정량화합니다.
일부 셀은 두 조각 사이에 위치합니다. z 스택에서 앞뒤로 이동하여 셀이 두 번 계산되지 않았는지 확인합니다. 대표적인 결과.
HCT 116 대장암 세포주 이종이이식은 프로토콜에 기재된 바와 같이 생성되었다. 제노이식은 비치료 대조군 및 FOLFIRI 화학요법에서 무작위로 분포되었다. 면역형광은 핵대항전을 위해 항칸카파제-3 항체 및 DAPI를 사용하여 세포 세포를 검출하기 위해 수행되었다.
미토성 지수, 세포사멸 및 종양 크기의 정량화는 FOLFIRI가 종양 크기의 54% 감소와 함께 미토시스의 현저한 감소와 세포멸증의 유의한 유도를 유도한다는 것을 밝혔다. 이러한 특징은 고처리량 의학적 증상 약물 스크린뿐만 아니라 짧은 시간 내에 여러 암 치료의 세포 내재 및 생리적 효과를 테스트하는 데 유용합니다. zebrafish xenograft 모델의 또 다른 큰 장점은 다른 종양 세포의 상호 작용을 연구하고 세포의 각 유형이 다른 사람의 행동에 영향을 미칠 수있는 방법을 분석 할 수 있다는 것입니다.
상이한 인간 암세포, 동일한 종양에서 다른 클론, 또는 상이한 종양으로부터, 공동 주입될 수 있다. 이 예에서, 동일한 환자로부터 유래된 2개의 대장암 세포주들은 상이한 리포메이션 염료로 표지되고 주사를 위한 일대일 비율로 혼합하였다. 우리는 이 프로토콜이 연구원이 제브라피시 제노이식을 생성하는 실제 전문가가 되는 데 도움이 되기를 바랍니다.
그것은 쉬운 일이 아니다. 연습하고 연습해야 합니다. 포기하지 마십시오.
난 당신이 거기에 도착 할 거야 확신합니다. 행운을 빌어.
