이 방법은 표적 면역 변조를 위한 종양용액 벡터의 발달을 촉진하여 암 면역 요법 분야의 주요 과제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 적용된 역유전 시스템의 주요 장점은 다재다능함입니다.따라서 벡터는 다양한 연구 질문을 해결하고 다양한 면역 서명을 가진 종양을 대상으로 조정할 수 있습니다. 특히 바이러스를 수확하는 최적의 시점을 결정하는 바이러스 전파 단계는 시간이 지남에 따라 시각적으로 동기화증 형성을 평가해야 하기 때문에 텍스트 프로토콜에서 배우기 어렵다.
원고에 설명된 바와 같이 재조합 면역 조절 벡터를 설계 및 복제하기 시작한다. 이 프로토콜은 이중특이적 T 세포 종사자를 코딩하는 온코리틱 홍역 백신 벡터의 개발을 위한 특정 단계를 설명합니다. cDNA에서 홍역 바이러스를 구출하기 위해, 24 시간 전에 홍역 플레이트 홍역 바이러스 생산자 세포는 6 벽판에 균등하게.
종자 200, 000 세포 2 밀리리터 DMEM에 있는 10% FBS를 포함하는 것은 전형시 65 75% 합류를 달성하기 위하여 우물 당 10% FBS를. 세포를 변형시키는 데 사용될 홍역 바이러스 항유놈을 인코딩하는 재조합 DNA 5 마이크로그램을 혼합합니다. DMEM의 총 200 마이크로 리터의 적절한 플라스미드와 형광 기자.
18.6 마이크로리터의 리포소피 트랜스펙트 시약을 혼합물에 넣고 튜브를 즉시 플릭하여 혼합합니다. 실온에서 25분 동안 이 형질 혼합물을 배양합니다. MV 생산자 세포는 65~75%의 컨플루엔티시로 자라난 6개의 웰 플레이트에서 배지를 제거하고 2% FBS와 50 마이크로그램당 DMEM의 1.8 밀리리터를 잘 포함한다.
그런 다음 각 우물에 드롭 와이즈를 드롭 스페션 믹스를 추가하고 조심스럽게 소용돌이. 하룻밤 사이에 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 다음 날 배지를 2밀리리터의 신선한 DMEM으로 교체하고 밀리리터 카나마이신당 50마이크로그램을 사용하면 중간체가 황색으로 인식되면 이를 반복합니다.
현미경을 사용하여 기자 유전자 발현 및 syncytia 형성을 위해 매일 세포를 관찰한다. 20개 이상의 세포로 구성된 큰 싱크로티아가 보이거나 세포가 너무 조밀해질 때 바이러스를 수확한다. 예상 수확 종자 전에 24 시간 약 150 만 MV 생산자 세포 DMEM의 12 밀리 리터와 10 센티미터 요리에 10 % FBS와 함께 바이러스 접종 시 65 ~75 %의 합류를 달성.
바이러스 를 수집하기 위해 세포 스크레이퍼를 사용하여 6 벽판에서 부착 된 생산자 세포를 조심스럽게 긁어 내는 것으로 감염된 세포가 있습니다. 긁힌 세포를 포함하는 배지를 원심분리기 튜브로 옮는다. 원심분리기는 5분 동안 적어도 2,500배 G, 섭씨 4도에 세포 이물질을 제거합니다.
원심분리 후 세포없는 상피와 혈청 프리 배지를 4 밀리리터의 최종 부피에 혼합하여 접종을 준비합니다. MV 생산자 셀로 10센티미터 접시에서 배지를 제거하고 세포에 접종을 추가합니다. 섭씨 37도에서 최소 2시간, 이산화탄소 5%를 배양합니다.
인큐베이션 후 10 %의 FBS와 DMEM의 6 밀리리터를 추가하고 하룻밤 세포를 배양합니다. 그런 다음 12 밀리리터의 신선한 DMEM으로 배지를 10%의 FBS로 교체하고 수확할 때까지 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 세포를 적어도 하루에 두 번 관찰하십시오.
막 중단이 눈에 띄게 수확 바이러스가 될 때 syncytia 버스트 하기 전에. 첫 번째 구절을 수확하려면 플레이트에서 상류체를 제거하고 600 마이크로 리터의 혈청 프리 배지를 추가합니다. 그런 다음 셀 리프터를 사용하여 세포를 긁어 내고 깨끗한 튜브로 옮습니다.
그 직후 액체 질소에서 바이러스 현탁액을 동결하고 철저한 동결을 보장하기 위해 적어도 24 시간 동안 섭씨 80도에 보관하십시오. 96 개의 벽판을 사용하여 알리 쿼트 당 octuplicates에서 바이러스 주식의 티터를 결정합니다. 먼저 T75 세포 배양플라스크에서 생산자 세포를 50 밀리리터 원추형 튜브로 끌어들입니다.
세포를 계산하고 10%의 FBS로 DMEM에서 밀리리터당 150, 000 세포로 세포 현탁액을 조정합니다. 96개의 벽판당 10%의 FBS로 90마이크로리터의 DMEM을 추가합니다. 그런 다음 플레이트의 첫 번째 열에 있는 모든 8 개의 우물에 바이러스 주식의 한 알리쿼트에서 10 마이크로 리터를 추가합니다.
적어도 10번 이상 위아래로 피펫팅하여 완전히 섞는다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 첫 번째 컬럼에서 두 번째 열로 각 웰의 10 마이크로리터를 전송하고 위아래로 파이펫팅하여 완전히 혼합합니다. 각 열에 대해 이 것을 반복하여 각 희석 단계에 대한 신선한 파이펫 팁을 사용하여 바이러스의 10배 희석을 얻습니다.
마지막 열의 각 웰에서 10 마이크로리터를 폐기합니다. 셀 현탁액 100마이크로리터를 밀리리터당 150, 000개의 세포로 추가하여 세포 덩어리가 없는지 확인합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5% 48시간 동안 배양합니다.
가벼운 현미경을 사용하여 동기화를 확인합니다. 가시적인 syncytia를 포함하는 가장 높은 희석 계수를 가진 열의 각 웰에서 동기화를 계산합니다. 형광 기자를 코딩하는 바이러스의 경우, syncytia는 형광 현미경 검사를 사용하여 계산될 수 있습니다.
감염 종자 100, 000 베로 세포감염 전 1일 전에 홍역 바이러스 복제 운동학을 분석하기 위해, DMEM의 1 밀리리터에서 000 베로 세포는 12개의 벽판에 10% FBS를 가지며, 관심의 각 시간마다 적어도 2개의 우물이 있는. 세포를 감염시키기 위해 배지를 혈청 프리 배지의 300 마이크로리터로 대체하여 각각의 양의 바이러스를 함유한다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 최소 2시간 동안 배양합니다.
접종을 제거하고 10 %의 FBS와 DMEM의 1 밀리리터를 추가하고 인큐베이션을 계속합니다. 감염 후 관련 시점에서 배지내세포를 직접 긁어내어 바이러스 성 progyny를 수확한다. 각 웰에서 개별 튜브로 내용을 전송합니다.
액체 질소에 고정 하 고 적정 때까지 섭씨 80도에 저장 하 고 원고에 설명 된 대로 진행 합니다. LDH 방출에 의한 BTE 유도세포 매개 세포 독성의 평가를 시작하기 위해, 먼저 바이러스 감염 대상 세포에 의해 발현된 분비된 트랜스진 제품을 분리하고 원고에 설명된 바와 같이 면역 이펙터 세포를 분리한다. 그런 다음 U-바닥 96 벽판에서 표적 세포를 시드하고 원고에 설명된 바와 같이 샘플을 포함한다.
원하는 농도에서 이전에 분리된 면역 조절기를 각각의 샘플에 추가합니다. 면역 결함 세포를 원하는 비율로 추가하고 우물 당 100 마이크로 리터의 총 부피에 매체를 추가합니다. 원하는 이전에 결정된 시간 프레임에 대해 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양합니다.
샘플 수집 45분 전에 10X Lysis 솔루션의 10마이크로리터를 T max 샘플및 해당 중간 제어 및 계속 배양을 포함하는 우물에 추가합니다. 세포를 250배 G로 4분간 원심분리합니다. 50 마이크로리터의 상체리터를 각 우물에서 평평한 바닥 96 벽판의 우물로 옮겨 세포를 옮기지 않도록 합니다.
제조업체에 따라 기판 용액을 준비한 후 각 웰에 50 마이크로리터를 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 30분 동안 또는 T 최대 샘플이 빨간색으로 바뀔 때까지 배양합니다. 인큐베이션 후 각 웰에 50 마이크로리터의 스톱 솔루션을 추가합니다.
원심분리기는 4,000회 G에서 1분 동안 한 다음 빈 바늘을 사용하여 기포를 제거합니다. 490 나노미터에서 광학 흡광도를 측정하고 원고에 설명된 대로 계산합니다. 수정되지 않은 및 BTE 인코딩 온코리틱 홍역 바이러스를 접종한 후 베로 세포에 대한 비교 된 벡터의 성장 곡선이 유사하게 나타납니다.
mc38 murine colorectal 암종 세포에 세포 생존성 곡선안정적으로 인간 발암항원 및 MV 수용체 CD46 접종 후 암분 암세포는 뮤린 종양 세포주에서 뒤처진 트랜스진 인코딩 바이러스의 리혈활성이 뒤쳐진다는 것을 보여준다. 5개의 상이한 희석제에서 BTE로 배양된 표적 항원 발현 세포의 유동 세포측정은 농도 의존적인 방식으로 세포에 의해 결합되는 BTE를 보였다. BTE 관련 세포의 자기 당김 후 면역 블롯에서 BTE의 비 타겟팅이 사용될 때 검출 가능한 양의 세포가 없는 것으로 나타났습니다.BTE 샘플을 대상으로 할 때 결합 된 세포가 용출 분획에 존재하였다.
BTE 매개 표적 항원 특이적 및 농도 의존성 세포 독성은 대표적인 LDH 방출 분석에 의해 표시되며, 본 예에서 15% 특정 세포 학살이 기준 세포에 비해 밀리리터당 1 마이크로그램의 상대적으로 높은 BTE 농도에서 달성되었다는 것을 보여준다. 이 절차를 시도하는 동안, 감염의 진행을 확인하기 위해 정기적으로 세포를 모니터링하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 감쇠되었지만 재조합 홍역 백신 균주가 특히 면역 억제 된 개인에게 위험 할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.
적절한 생체 안전 절차를 따라 노출을 방지하십시오. 바이러스를 취급하는 개별은 이 방법을 능력을 발휘하기 전에 예방 접종을 해야 합니다. 바이러스 호스트 상호 작용 및 치료 효과를 분석하기 위해 추가 전유전자의 이 절차 바이러스 발현을 달성할 수 있다.
이러한 기술의 발달은 생물 요법 분야의 연구원들이 수많은 종양 개체에서 국소 발현 된 면역 조절제의 효과를 탐구하는 길을 열었습니다.Vitro, In Vivo 및 임상 시험에서도.
