الفيروسة البطيئة الإنتاج

Summary

لجعل lentiviruses ، هي ناقلات transfected الحمض النووي في الخلايا البشرية 293. بعد الحصاد ، وتركيز طاف ، يتم تحديد عيار الفيروس عن طريق التعبير مضان مع تدفق عداد الكريات.

Abstract

تدخل الحمض النووي الريبي (رني) هو نظام لإسكات الجينات في الخلايا الحية. في رني ، في تسلسل الجينات مثلي قصيرة الرناوات التدخل (سيرنا) يتم إسكاتها في دولة ما بعد النسخي. ويمكن التعبير عن الرناوات دبوس الشعر القصير ، والسلائف لسيرنا ، وذلك باستخدام الفيروسة البطيئة ، مما يسمح لرني في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. Lentiviruses ، مثل فيروس نقص المناعة البشرية ، قادرة على اصابة كل من الانقسام وعدم تقسيم خلايا. سنقوم بشرح الإجراء الذي lentiviruses إلى الحزمة. التغليف يشير إلى إعداد الأكفاء من نواقل فيروس الحمض النووي. وتستند نظم الإنتاج Lentiviral ناقلات على نظام "تقسيم" ، حيث تم تقسيم الجينوم الفيروسي في البنى الطبيعية المساعد الفردية البلازميد. تقسيم هذه العناصر الفيروسية المختلفة إلى أربع ناقلات منفصلة يقلل من خطر خلق الفيروس قادر على تكرار إعادة التركيب من قبل العارض للجينوم lentiviral. هنا ، transfected عابر متجه تحتوي على shRNA من الاهتمام والتعبئة والتغليف ناقلات الثلاث (ف VSVG ، pRSV ، pMDL) في خلايا الإنسان 293. على الأقل بعد فترة حضانة لمدة 48 ساعة ، هو حصاد طاف الفيروس التي تحتوي على ومركزة. أخيرا ، يتم تحديد عيار الفيروس بواسطة مراسل (الفلورية) التعبير مع تدفق عداد الكريات.

Protocol

الجزء 1 : ترنسفكأيشن من الخلايا لإنتاج 293 كلوة الجنين البشري Lentiviruses

* قبل 24 ساعة ترنسفكأيشن ، لوحة الخلايا 2.5 X ⁶ 10 في صحن 10cm عن confluency من 50-70 ٪ في اليوم التالي.

1. يبدأ هذا البروتوكول عن طريق إعداد الحمض النووي مع أي واحد في وقت لاحق سوف transfect الخلايا واحد لجعل الفيروس. أولا ، تخفيف FuGENE الكاشف ترنسفكأيشن 6 روش ، وهو كاشف الدهون التي تجعل الخلايا بتناول الحمض النووي. في أنبوب مل 1.5 ، ماصة 30μl FuGENE 6 في مصل المتوسطة خالية 600ul (SFDMEM). توخي الحذر لعدم السماح FuGENE تلمس الجانب من الأنبوب حيث يتم تسليمها في المتوسط. ندع هذا FuGENE وخلط واحتضان SFDMEM في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
2. في الحد الأقصى من الأنبوب ، مزيج 4 ميكروغرام lentiviral البلازميد مع 4 ميكروغرام لكل جيل ^الثالث 3 ناقلات التعبئة الفيروسي (pMDL ، وpRSV pVSV G). والبلازميد lentiviral يحتوي على الحمض النووي للفيروس سيتم إدراج في جينوم كل ما يصيب الخلية ، في حين أن ناقلات التعبئة تحتوي على جينات البروتينات سائر المطلوب لإجراء الفيروسة البطيئة.
3. إغلاق الغطاء والمزيج بواسطة أنبوب في قلب عدة مرات.
4. احتضان 15-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
5. ماصة المحتوى بالكامل من الأنبوب إلى 293 لوحة. المزيج بلطف لوحة مائلة ذهابا وإيابا.
6. عودة إلى الخلايا الحاضنة والسماح الانتاج الفيروسية أن يستمر لمدة 48-96 ساعة قبل الحصاد.
7. أثناء الحضانة ، فإن الخلايا 293 نسخ الحمض النووي لمصلحة من البلازميد lentiviral ، وخلق نسخ الحمض النووي الريبي لبناء lentiviral. كما أنها نسخ وترجمة الجينات في ناقلات التعبئة والتغليف في البروتينات الفيروسية. هذه البروتينات المضي قدما لجعل الفيروسات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي الإصدار الخاص من بناء lentiviral ، والتي ستغير نسخ الفيروس وإدراجها في الجينوم من الخلايا في كل ما يصيب.

الجزء 2 : حصاد Lentiviral

1. بعد فترة حضانة ، أخذ خلايا من الحاضنة واستخدام المتاح حقنة 10ML ، لإزالة طاف ، والتي تحتوي الآن على الفيروس. وسوف يكون هناك حوالي 10ML من طاف.
2. إرفاق تصفية حقنة 0.45μM إلى الطرف وتصفية الفيروس في أنبوب بيكمان نابذة فائقة السرعة. مرشح يسمح الفيروسات فقط ، وليس الخلايا بالمرور.
3. قبل رميه ، احتضان كل الخلايا المنتجة للفيروس ، لوحات والثقافة ، والمحاقن والمرشحات في المبيض بنسبة 10 ٪ لمدة 45 دقيقة.

الجزء 3 : التركيز Lentiviral عبر تنبيذ فائق

1. تحميل أنابيب الطرد المركزي في 41Ti SW - SW - 28 أو الدلاء الدوار.
2. استخدام المصل خالية DMEM لتحقيق التوازن بين جميع الفيروسات التي تحتوي على أنابيب إلى داخل 0.2g.
3. ختم الدلاء اغلاق الدوار وربط لهم على الدوار قبل ان يضع الدوار داخل نابذة فائقة السرعة
4. تدور الفيروس لمدة 90 دقيقة في نابذة فائقة السرعة في 4 درجات مئوية في 25000 دورة في الدقيقة في الدوار SW - 24000 دورة في الدقيقة أو 41Ti في الدوار SW - 28.
5. في نسيج الثقافة هود ، المقلوب رأسا على عقب أنابيب لضخ طاف في وعاء يحتوي على مواد التبييض 10 ٪.
6. استخدام Kimwipe لاستيعاب فائض السيولة في جميع أنحاء بيليه وعكس الأنبوب في رفوف مريحة لمدة لا تزيد على خمس دقائق.
7. لإعادة تعليق بيليه الفيروسي ، واستخدام غيض فلتر لاضافة 100 برنامج تلفزيوني العقيمة ميكرولتر إلى أنبوب ، ثم ماصة صعودا وهبوطا بنحو 20 مرة.
8. ترك الفيروس في 4 درجات ليلا لاستكمال إعادة تعليق C. يمكن للمرء تخزين محضرات الفيروسية عند 4 درجات لنحو 1 في الأسبوع ، و-80 درجة لمدة تصل الى سنة واحدة. تذكر لعلاج جميع أنابيب فارغة مع التبييض 10 ٪ قبل رميه.
9. إذا كان أحد ينوي استخدام الإعدادية الفيروسية لمدة أطول من الأسبوع 1 ، وجعل الحد الأدنى من aliquots 20μl - 5 لإجراء التجارب في المستقبل ، وقسامة 1 من 3 إلى 5μl للمعايرة. تجميد وتخزين aliquots في 80 تحت الصفر.

الجزء 4 : Lentiviral المعايرة باستخدام التدفق الخلوي

1. الخطوة التالية هي تحديد عيار الفيروسية التي التدفق الخلوي. هذه الطريقة لا تعمل إلا في الحالات التي يكون فيها lentiviral البلازميد يحتوي على جين مراسل الفلورسنت. والفكرة هي أنه عندما يصيب الفيروس خلية ، فإنه يدخل في الحمض النووي إلى جينوم lentiviral البلازميد تلك الخلية. سوف الخلية المصابة ثم نسخ وترجمة الجينات التي شملت في البلازميد lentiviral ، وإذا كنت تضمن جينة مراسل الفلورسنت ، وسوف يتألق الخلايا المصابة. مستوى مضان يمثل قوة ، أو عيار من الفيروس.
2. عن أن يكون لكل سهم titered الفيروسي ، وتمييع 3 ميكرولتر من الفيروس تتركز في 1.5 مل من وسائل الإعلام كاملة (DMEM ، القلم بكتيريا ، الجلوتامين ، FBS).
3. في الآبار 1-6 في صف واحد من 96 لوحة جيدا ، نفذ التخفيفات المتسلسلة التالية : لجميع الآبار 6 إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الاعلام DMEM كاملة. إضافة إلى الأول من وسائل الإعلام جيدا 100μl مع عدم وجود الفيروس (وهذا هو عنصر التحكم غير ملوثين) ، والثاني كذلك إضافة 100 ميكرولتر من الفيروس المخفف (أي ما يعادل to1 مل من فيروس مخفف) ، إضافة إلى الثلث من 100 ميكرولترمن مزيج من البئر الثانية ، إضافة إلى الرابع على 100 مل من 3 جيدا ، الى الخامس جيدا إضافة 100μl من البئر 4 ، والسادس أيضا إضافة 100 ميكرولتر من 5 جيد. 100ul تتخذ في النهاية من أصل 6 البئر وتجاهل في التبييض. وأجري تخفيف المسلسل حيث كل بئر ونصف حجم الفيروس مقارنة مع واحد قبل ذلك.
4. جعل إجمالي حجم في جميع الآبار ل200μl. علما أن هذه التخفيفات اقترح فقط ، التي ينبغي أن تعمل بشكل جيد لtitering الفيروسات الأكثر تركيزا. اذا كان الفيروس منخفضة في عيار ، أو غير مركز واحد قد تحتاج إلى ضبط التخفيفات.
5. علاج أي فيروس غير المستخدمة المخفف مع التبييض 10 ٪ لمدة 45 دقيقة قبل رميه في حاوية نفايات بيولوجية.
6. إضافة ~ 15000 صحية ، وتقسيم الخلايا بنشاط 293 إلى كل من الآبار 6. ويمكن استخدام لوحة واحدة 96 - جيدا لعيار 16 محضرات الفيروسية.
7. عودة إلى الخلايا الحاضنة 37 درجة مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ ₍₂₎ وتسمح للعدوى والمضي قدما على الأقل 48 ساعة.
8. بعد الحضانة ، ويتم تحليل الخلايا للتعبير مراسل (مضان في حالتنا) مع تدفق عداد الكريات. وquantitated الجسيمات الفيروسية التي كتبها في المئة من الخلايا الفلورسنت لكل بئر.

حساب عدد من وحدات المعدية في مل مع الصيغة التالية :

_{(# من الخلايا لكل بئر في يوم من الخلايا العدوى الإيجابية مراسل X) X 1000}
^{______________________________________________________
وأضاف أن مل من ناقلات جيدا}

الجزء 5 : نتائج الممثل :

بعد ترنسفكأيشن الحضانة لمدة 48 ساعة فترة ما بعد ، ينبغي أن لوحة من 293 خلايا تكون على حوالي 90 ٪ الفلورسنت. وهناك نسبة عالية من الخلايا الفلورسنت وهذا مؤشر على نسبة عالية من الخلايا المنتجة للفيروس.

بعد الطرد المركزي ، وبيليه الفيروسية بالكاد مرئية عند إعادة التعليق. هذا أمر طبيعي كما هو واضح بيليه والصغيرة جدا.

عند تفسير النتائج تدفق عداد الكريات ، علما أن واحدة فقط يمكن تحقيق عيار حسابات دقيقة عند إصابتها (الفلورسنت) الخلايا لم تتلق أي أكثر من التكامل الفيروسي في الخلية. من أجل ضمان أن يكون هذا هو الحال ، مع معدل استخدام الخلايا <العدوى بنسبة 15 ٪ لإجراء العمليات الحسابية. وقد تلقت الخلايا مع ارتفاع معدلات العدوى الفيروسية المرجح integrants متعددة لكل خلية. ينبغي أن التخفيفات اقترح في الخطوة 2 الغلة عينات عدة ضمن هذا النطاق للعدوى. من الناحية المثالية ، واستخدام عينات عدة لتوليد مؤامرة المعايرة (الخط خطي) التي يمكنك من خلالها حساب عيار النهائي ، ولكن يمكنك حساب عيار باستخدام عينة واحدة ، إذا لزم الأمر. يمكن للمرء أن يتوقع من عيار 1.0 × 10 ⁷ TU / مليلتر بالنسبة لبرنامج الأمم المتحدة للتركيز الفيروس و 1.0 × 10 ⁸ TU / مل لفيروس المركزة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS	Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG	Roche Group
Bleach	Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes	Falcon BD	353003
Multichannel pipette	Rainin
Filtered pipette tips	Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)	Eppendorf
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter Inc.
Tissue culture incubator at 5% CO2	Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.
Fluorescent microscope	Coulter
FACS Array	Beckman Coulter Inc.