Lentivirus הפקה

Summary

כדי להפוך את lentiviruses, וקטורים DNA הם transfected 293 לתוך תאים אנושיים. לאחר הקציר ריכוז supernatant, titer וירוס נקבעת על ידי ביטוי פלואורסצנציה עם cytometer זרימה.

Abstract

התערבות RNA (RNAi) היא מערכת של להשתקת גנים בתאים חיים. ב RNAi, גנים הומולוגיים ברצף RNAs התערבות קצרות (siRNA) מושתקים במצב שלאחר תעתיק. RNAs מכבנה קצר, מקדימים siRNA, ניתן לבטא באמצעות lentivirus, המאפשר RNAi במגוון רחב של סוגי תאים. Lentiviruses, כגון וירוס הכשל החיסוני האנושי, הם מסוגלים להדביק גם חלוקת ולא חלוקת התאים. נתאר תהליך אשר עד lentiviruses החבילה. אריזות מתייחס הכנת וירוס המוסמכת וקטורים מ-DNA. Lentiviral ייצור מערכות וקטור מבוססים על מערכת "פיצול", כאשר הגנום הנגיפי טבעי כבר התפצלה בונה עוזר אישי פלסמיד. זה פיצול של אלמנטים ויראליים שונים לארבע וקטורים נפרד מפחית את הסיכון של יצירת שכפול נגיף המסוגל ידי רקומבינציה adventitious של הגנום lentiviral. כאן, וקטור המכיל את shRNA עניין ושלושה וקטורים אריזה (p-VSVG, pRSV, pMDL) הם transfected transiently לתוך 293 תאים אנושיים. לאחר תקופה לפחות 48 שעות דגירה, supernatant וירוס המכיל נאסף ומרוכז. לבסוף, titer וירוס נקבעת על ידי הכתב (ניאון) הביטוי cytometer זרימה.

Protocol

חלק 1: transfection של HEK 293 תאים כדי לייצר Lentiviruses

* 24 שעות לפני, transfection צלחת 2.5 X 10 ⁶ תאים צלחת 10 ס"מ עבור confluency של 50-70% למחרת.

1. התחל בפרוטוקול זה על ידי הכנת ה-DNA עם איזה מהם יהיה מאוחר transfect תאים של אדם לעשות וירוס. ראשית, לדלל FuGENE 6 מגיב transfection רוש, מגיב השומנים שהופכים תאים לקחת את ה-DNA. בתוך צינור 1.5 מ"ל, פיפטה 30μl FuGENE 6 לתוך מדיום סרום ללא 600ul (SFDMEM). היזהרו לא לתת FuGENE לגעת בצד של הצינור כפי שהוא מועבר לתוך המדיום. בואו הזה FuGENE ומערבבים SFDMEM ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
2. בכובע של הצינור, לערבב 4 מיקרוגרם lentiviral פלסמיד עם 4 מיקרוגרם כל 3 הדור ^השלישי וקטורים ויראליים אריזה (pMDL, pRSV pVSV ו-G). Lentiviral פלסמיד המכיל את ה-DNA הווירוס יהיה להכניס לתוך הגנום של כל תא הוא מדביק, בעוד וקטורים האריזה מכילים גנים לכל וחלבונים אחרים הדרושים כדי לבצע lentivirus.
3. סגור את המכסה ומערבבים על ידי צינור inverting כמה פעמים.
4. דגירה 15-20 דקות בטמפרטורת החדר.
5. פיפטה התוכן של הצינור לתוך צלחת 293. מערבבים בעדינות על צלחת הטיה קדימה ואחורה.
6. מחזירים את התאים החממה ולאפשר ייצור ויראלי להימשך 48-96 שעות לפני הקציר.
7. במהלך הדגירה, 293 תאים לתעתק את ה-DNA של עניין מן הפלסמיד lentiviral, יצירת עותק של RNA לבנות את lentiviral. הם גם לתמלל ולתרגם את הגנים של וקטורים אריזה לחלבונים ויראליים. חלבונים אלה להמשיך לייצר וירוסים המכילים את הגרסה של RNA לבנות lentiviral שלך, הווירוס יהיה הפוך להעתיק ולהכניס לתוך הגנום של כל התאים שהוא מדביק.

חלק 2: קציר lentiviral

1. לאחר תקופת הדגירה, לקחת תאים מתוך האינקובטור ולהשתמש מזרק חד פעמי, 10 מ"ל להסיר את supernatant, אשר מכיל כעת את הנגיף. יהיו כ 10 מ"ל של supernatant.
2. צרף לסנן מזרק 0.45μM אל קצה ולסנן את הווירוס לתוך צינור ultracentrifuge Beckman. המסנן מאפשר רק וירוסים, ולא התאים לעבור.
3. לפני השלכת, דגירה כל וירוס תאים מייצרי, צלחות תרבות, מזרקים מסננים אקונומיקה 10% במשך 45 דקות.

חלק 3: ריכוז lentiviral דרך ultracentrifugation

1. טען צינורות צנטריפוגות לתוך SW-41Ti או SW-28 דליים הרוטור.
2. שימוש בסרום ללא DMEM לאזן כל וירוס המכילים צינורות אל תוך 0.2g.
3. חותם לסגור דליים הרוטור קרס אותם על הרוטור לפני הצבת הרוטור בתוך ultracentrifuge
4. ספין הנגיף במשך 90 דקות ב ultracentrifuge ב 4 ° C בסל"ד 25,000 ב הרוטור SW-41Ti או 24,000 סל"ד ב הרוטור SW-28.
5. במנדף בתרבית רקמה, להפוך צינורות הפוך supernatant לשפוך לתוך מיכל המכיל אקונומיקה 10%.
6. השתמש Kimwipe לספוג עודפי נוזלים סביב גלולה ו להפוך את הצינור במעמד נוח לא יותר מחמש דקות.
7. כדי לחדש את להשעות את גלולה ויראלי, השתמש טיפ לסנן להוסיף 100 PBS סטרילי μL אל הצינור, ואז פיפטה למעלה ולמטה כ -20 פעמים.
8. השאירו את וירוס ב 4 מעלות למשך הלילה כדי להשלים מחדש ההשעיה C. אפשר לאחסן preps ויראלי ב 4 מעלות במשך שבוע על 1 ו - ב -80 מעלות למשך עד שנה. זכור להתייחס לכל שפופרות ריק עם אקונומיקה 10% לפני השלכת.
9. אם מישהו מתכוון להשתמש הכנה ויראלי עבור יותר משבוע 1, לעשות aliquots מינימלי של 5-20μl לניסויים עתידיים aliquot 1 של 3 עד 5μl עבור טיטרציה. להקפיא ולאחסן את aliquots בגיל 80 מינוס.

חלק 4: טיטרציה lentiviral שימוש cytometry זרימה

1. השלב הבא הוא לקבוע את titer ויראלי ידי cytometry הזרימה. שיטה זו פועלת רק במקרים שבהם lentiviral פלסמיד המכיל את הגן כתב ניאון. הרעיון הוא שכאשר נגיף מדביק תא, היא מציגה את ה-DNA פלסמיד lentiviral לתוך הגנום של התא הזה. תא נגוע לאחר מכן לתמלל ולתרגם את הגנים אתה נכלל פלסמיד lentiviral, ואם אתה כללו גן הכתב ניאון, תאים נגועים יהיה לזרוח. רמת הקרינה מייצג את העוצמה, או titer, של הנגיף.
2. עבור כל מניות ויראלי להיות titered, לדלל 3 μl של נגיף מרוכז לתוך 1.5 מ"ל של מדיה מלאה (DMEM, עט סטרפטוקוקוס, גלוטמין, FBS).
3. ב 1-6 בארות בשורה בודדת של צלחת 96 היטב, לבצע דילולים סדרתי הבאים: לכל 6 בארות להוסיף 100 μl של שלמה DMEM התקשורת. כדי הראשונה גם להוסיף 100μl של התקשורת עם וירוס לא (זה בלא כתם השליטה שלך), אל השני היטב להוסיף 100 μl של הנגיף בדילול מלא (שהוא שווה ערך מ"ל to1 של נגיף חי), על השלישי גם להוסיף 100 μlתמהיל מן השני היטב, הרביעי גם להוסיף 100 מ"ל מן 3 היטב, החמישי טוב להוסיף 100μl מהבאר 4, וכדי השישי היטב להוסיף 100 μl של 5 היטב. לבסוף לקחת 100ul מתוך הבאר 6 וזורקים ב אקונומיקה. דילול סדרתי בוצעה בו היטב לכל אחד מהם יש חצי נפח של הנגיף בהשוואה אחד לפני זה.
4. תביאו את הנפח הכולל של הבארות כל 200μl. שים לב כי אלה דילולים הציע בלבד, אשר אמור לעבוד גם עבור titering וירוסים המרוכזת ביותר. אם הנגיף הוא נמוך titer, או unconcentrated אפשר צריך להתאים את דילולים.
5. פנקו כל וירוס בדילול מלא בשימוש עם אקונומיקה 10% במשך 45 דקות לפני השלכת לתוך מיכל פסולת Biohazard.
6. הוסף את ~ 15,000 בריא, פעיל חלוקת 293 תאים לכל אחד 6 בארות. צלחת 96-היטב יחיד יכול לשמש titer 16 preps ויראלי.
7. חזור התאים 37 מעלות באינקובטור עם 5% CO ₂ ולאפשר זיהום להמשיך לפחות 48 שעות.
8. לאחר דגירה, התאים הם ניתחו לביטוי עיתונאי (ב הקרינה במקרה שלנו) עם cytometer זרימה. חלקיקים נגיפיים נבדקת ונרשמת אחוזים של תאים פלורסנט לכל טוב.

לחשב את מספר יחידות זיהומיות לכל מ"ל עם הנוסחה הבאה:

_{(# של תאים לכל גם ביום של תאים זיהום X כתב חיובי) X 1000}
^{______________________________________________________
מ"ל של וקטור להוסיף גם}

חלק 5: תוצאות נציג:

לאחר transfection 48 שעות שלאחר תקופת הדגירה, את צלחת של 293 תאים צריך להיות בסביבות 90% ניאון. אחוז גבוה של תאים פלורסנט אינדיקציה אחוז גבוה של תאים וירוס לייצר.

לאחר צנטריפוגה, גלולה ויראלי היא בקושי נראית לעין כאשר resuspending. זה נורמלי כמו גלולה היא ברורה קטן מאוד.

כאשר לפרש cytometer תוצאות זרימה, יש לציין כי ניתן להשיג רק חישובים titer מדויק כאשר נגוע (ניאון) התאים קיבלו לא יותר אינטגרציה ויראלי לכל תא. על מנת להבטיח כי זה המקרה, יש להשתמש בתאים עם שיעור <זיהום 15% עבור חישובים. תאים עם שיעורי זיהום גבוהים קיבלו סביר integrants ויראלי מרובות לכל תא. דילולים הציע בשלב 2 צריך להניב מספר דוגמאות בטווח זה של זיהום. באופן אידיאלי, להשתמש כמה דגימות כדי ליצור עלילה טיטרציה (קו ליניארי) שממנו ניתן לחשב את titer הסופי, אבל אתה יכול לחשב titer באמצעות מדגם יחיד, במידת הצורך. אפשר לצפות titer של 1.0 x 10 ⁷ TU / ml וירוס בלתי מרוכז 1.0 x 10 ⁸ TU / ml וירוס מרוכז.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS	Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG	Roche Group
Bleach	Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes	Falcon BD	353003
Multichannel pipette	Rainin
Filtered pipette tips	Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)	Eppendorf
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter Inc.
Tissue culture incubator at 5% CO2	Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.
Fluorescent microscope	Coulter
FACS Array	Beckman Coulter Inc.