Lentivirüs Üretim

Özet

Lentiviruses yapmak için, DNA vektörleri insan 293 hücrelerine transfekte. Hasattan sonra ve supernatant yoğunlaşarak, virüs titresi bir akış sitometresi ile floresan ifade tarafından belirlenir.

Özet

RNA enterferans (RNAi) canlı hücrelerin gen susturma bir sistemdir. RNAi, genler homolog kısa müdahale RNA'lar sırayla (siRNA) post-transkripsiyonel devlet susturulmaktadır. Kısa saç tokası RNA'lar, siRNA habercisi, çeşitli hücre tipleri RNAi için izin lentivirüs kullanarak ifade edilebilir. Human Immunodeficiency Virus Lentiviruses, hücrelerin bölünmesi ve non-bölünmesi bulaşmasını yeteneğine sahiptir. Biz paketi lentiviruses bir prosedür anlatacağız. Ambalaj yetkili virüs DNA vektörleri hazırlanması anlamına gelmektedir. Lentiviral vektör üretim sistemleri doğal viral genomun bireysel yardımcı plazmid yapıları bölünmüş olan bir 'bölünme' sistemi dayanmaktadır. Bu dört ayrı vektörleri farklı viral elemanlarının bölme lentiviral genomunun adventif rekombinasyon çoğaltma yeteneğine sahip bir virüs yaratma riski azalır. Burada ilgi ve üç ambalaj vektörler shRNA (p-VSVG, pRSV, pMDL) içeren bir vektör geçici insan 293 hücrelerine transfekte. En azından 48 saatlik bir kuluçka döneminden sonra, virüsü içeren süpernatant hasat ve yoğunlaşmıştır. Son olarak, virüs titresi muhabiri (floresan) bir akış sitometresinde ifade tarafından belirlenir.

Protokol

Bölüm 1: Lentiviruses üretmek için HEK 293 Hücre Transfeksiyon

* 24 saat önce% 50-70 ertesi gün confluency için bir 10cm çanak transfeksiyon, plaka 2,5 X 10 ⁶ hücreleri.

1. Bu protokol virüs yapmak için bir sonraki hücreleri transfect hangi DNA hazırlayarak başlayın. İlk olarak, FuGENE 6 Transfeksiyon Reaktif Roche, hücrelerin DNA sürebilir yapmak bir lipid reaktif seyreltin. 1.5 ml tüp, pipet 30μl FuGENE 6 600ul serum serbest ortama (SFDMEM). Ortama teslim olarak FuGENE tüp tarafında dokunmatik izin vermeyin dikkatli olun. Bu FuGENE ve SFDMEM karıştırın ve oda sıcaklığında inkübe, 5 dakika izin verin.
2. Tüpün kapağı, 4 mg her 3 ^üncü nesil viral ambalaj vektörler (pMDL, pRSV ve pVSV-G) ile plazmid lentiviral 4 mikrogram karıştırın. Lentiviral plazmid DNA içeren ambalaj vektörleri bir lentivirüs yapmak için gerekli tüm diğer proteinlerin genleri içeren virüs, bulaştığı her hücre genomu içine gireceğiz.
3. Tersine tüp birkaç kez karıştırın ve kapağını kapatın.
4. 15-20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
5. Pipet 293 plaka içine tüpün tüm içeriği. Ileri ve geri devirme plaka yavaşça karıştırın.
6. Inkübatör hücreleri dönün ve viral üretim, hasat önce 48-96 saat süreyle devam etmesine izin.
7. İnkübasyon sırasında, 293 hücreler lentiviral yapının bir RNA kopyasını oluşturma, lentiviral plazmid DNA ilgi yazıya. Onlar da yazıya ve virüs proteinleri içine ambalaj vektörü genler çevirmek. Bu proteinler, virüs yazıya ters ve bozar tüm hücreleri genomların takın lentiviral inşa RNA sürümü, içeren virüsler yapmaya devam edin.

Bölüm 2: lentiviral Hasat

1. Kuluçka döneminden sonra, kuluçka hücreleri almak ve virüs içeren süpernatant kaldırmak için tek kullanımlık, 10 ml şırınga kullanabilirsiniz. Süpernatant 10ml hakkında olacaktır.
2. 0.45μM şırınga ucu filtre takın ve Beckman ultrasantrifüjdeki tüp içine virüs filtre. Bu filtre, sadece virüslerden sağlar ve hücrelerin geçmesi için değil.
3. Atmadan önce, tüm virüs üreten hücreler inkübe, kültür plakaları, şırınga ve 45 dakika boyunca% 10 çamaşır suyu filtreleri.

Bölüm 3: Ultrasantrifügasyon üzerinden lentiviral Konsantrasyon

1. GB-41Ti veya SW-28 rotor kova içine santrifüj tüplerine yükleyin.
2. Tüm virüs içeren dengelemek için 0.2g içinde tüpler serum ücretsiz DMEM kullanın.
3. Rotor kova ultrasantrifüjdeki içinde rotor yerleştirmeden önce kapatın ve rotor üzerine onları kanca Mühür
4. Spin virüs bir ultrasantrifüjdeki 90 dakika 4 ° C SW-41Ti rotor 25.000 rpm veya SW-28 rotor 24.000 rpm.
5. Bir doku kültürü kaputu,% 10 çamaşır suyu içeren bir kap içine süpernatant dökmek için tüpler ters ters.
6. Pelet çevresinde aşırı sıvı emer ve beş dakika daha fazla için uygun bir rafa tüp ters bir Kimwipe kullanın.
7. Viral pelet yeniden askıya için 100 mcL steril PBS tüp eklemek için bir filtre ucu kullanın, ardından 20 kez aşağı yukarı pipet ve.
8. 4 virüs bırakın ° C yeniden süspansiyon tamamlamak için bir gecede. Bir virüs preparatlarıyla yaklaşık 1 hafta süreyle ve en fazla bir yıl için -80 derece 4 derece kaydedebilirsiniz. Atılmadan önce% 10 çamaşır suyu ile tüm boş tüpler tedavi etmeyi unutmayın.
9. Viral hazırlık 1 haftadan daha uzun süre kullanmak niyetinde ise, titrasyon için 5μl gelecek 3 deney ve 1 kısım için asgari 5-20μl alikotları olun. Dondurma ve eksi 80 alikotları saklamak.

Bölüm 4: Akım Sitometri lentiviral Titrasyon

1. Bir sonraki adım, flow sitometri viral titresi tespit etmektir. Bu yöntem, yalnızca lentiviral plazmid floresan muhabiri geni içeren durumlarda çalışır. Fikir virüs, bir hücreye bozar, o hücre genomu içine lentiviral plazmid DNA tanıtır. Enfekte hücrenin sonra uyarlamak ve tercüme lentiviral plazmid yer alan genlerin, bir floresan raportör gen dahil, enfekte olan hücreleri floresan. Floresan seviyesi virüsün potens yada titre temsil eder.
2. Titre her viral stoğu olması için, 1.5 ml (DMEM kalem strep, glutamin, FBS) eksiksiz bir medya içine konsantre virüs 3 ul sulandırmak.
3. 96 plaka tek bir satır kuyuları 1-6, aşağıdaki seri dilüsyonları gerçekleştirin: 100 ul tam DMEM medya eklemek Tüm 6 kuyu. Iyi iyi 100 ul eklemek iyi ikinci, (bu lekesiz kontrolü) hiçbir virüs medya 100μl eklemek üçüncü, seyreltilmiş virüsün 100 ul (eşdeğer 1'e ml sulandırılmamış virüs) ilkkarışımı iyi ikinci, dördüncü, beşinci, iyi 3. 100 ml 4. sıra ve altıncı 100μl eklemek iyi 5. 100 ul eklemek. Son olarak 6. sıra 100ul almak ve çamaşır atın. Her bir kuyunun önce bir virüs yarım hacmi bir seri dilüsyon yapıldı.
4. 200μl tüm kuyuların toplam hacmi getirin. Bunların en yoğun virüsler titering için çalışması gerektiğini, sadece önerilen dilüsyonları unutmayın. Virüs titresi düşük veya Konsantre bir dilüsyonları ayarlamanız gerekebilir.
5. Kullanılmayan bir biyolojik tehlikeli atık kabı içine atılmadan önce 45 dakika süreyle% 10 oranında çamaşır suyu ile seyreltilmiş virüs davranın.
6. ~ 15.000 sağlıklı, aktif 293 hücrelerin bölünerek, her biri için 6 kuyu ekleyin. Bir tek 96-plaka 16 viral preparatlarıyla titresi kullanılabilir.
7. % 5 CO ile 37 derece inkübatör hücreleri dönün ₂ ve enfeksiyon en az 48 saat süreyle devam etmek için izin.
8. Inkübasyondan sonra, hücrelerin bir akış sitometresi ile muhabir ifade (bizim durumumuzda floresan) analiz edilir. Viral parçacıkların de ortalama floresan hücrelerinin yüzde quantitated.

Aşağıdaki formül ile ml'de bulaşıcı birimlerinin sayısını hesaplayın:

_{(# Enfeksiyonu X muhabiri pozitif hücrelerin gün başına hücre sayısı) X 1000}
^{______________________________________________________
vektör ml}

Bölüm 5: Temsilcilik Sonuçları:

48 saatlik bir kuluçka dönemi sonrası transfeksiyon sonra, 293 hücrelerinin plaka floresan az% 90 civarında olmalıdır. Floresan hücrelerinin yüksek oranda virüs üreten hücreler yüksek bir yüzdesinin bir göstergesidir.

Resuspending santrifüj sonra, viral pelet zorlukla görülebilir. Pelet açık ve çok küçük olduğu gibi bu durum normaldir.

hücreleri, hücre başına en fazla bir viral entegrasyon almış (floresan) enfekte tek doğru titresi hesaplara ulaşmak akış sitometresinin sonuçları yorumlama, not. Bu durumda olduğundan emin olmak için, hesaplamalar için <% 15 enfeksiyon oranı ile hücre kullanın. Hücreler daha yüksek enfeksiyon oranları muhtemelen, hücre başına birden fazla virüs integrants aldık. 2. adımda önerdi dilüsyonları enfeksiyon bu aralığın içinde birkaç örnek verim. İdeal olarak, nihai titresi hesaplayabilirsiniz titrasyon arsa (doğrusal çizgi) oluşturmak için birkaç örnek kullanabilirsiniz, ancak gerekirse, tek bir örnek kullanarak titresi hesaplayabilirsiniz. Tahmin titresi 1.0 x 10 ⁷ TU / un konsantre virüs ml ve 1.0 x 10 ⁸ TU / ml konsantre virüs için.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS	Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG	Roche Group
Bleach	Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes	Falcon BD	353003
Multichannel pipette	Rainin
Filtered pipette tips	Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)	Eppendorf
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter Inc.
Tissue culture incubator at 5% CO2	Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.
Fluorescent microscope	Coulter
FACS Array	Beckman Coulter Inc.