Lentivirus de producción

Resumen

Para que los lentivirus, los vectores de ADN se transfectadas en células humanas 293. Después de la cosecha y la concentración del sobrenadante, título del virus se determina mediante la expresión de fluorescencia con un citómetro de flujo.

Resumen

ARN de interferencia (ARNi) es un sistema de silenciamiento de genes en las células vivas. El ARN de interferencia, en la secuencia de genes homólogos a corto RNAs de interferencia (siRNA) son silenciadas en el estado post-transcripcional. ARN de horquilla corta, los precursores de siRNA, se puede expresar mediante lentivirus, lo que permite el ARNi en una variedad de tipos de células. Los lentivirus, como el virus de inmunodeficiencia humana, son capaces de infectar tanto a la división y que no se dividen las células. Vamos a describir un procedimiento que a los lentivirus paquete. Envase se refiere a la preparación de virus competentes de vectores de ADN. Lentiviral los sistemas de producción de vectores se basan en un 'split' del sistema, donde ha sido el genoma del virus natural de división en las construcciones de plásmido auxiliar individual. Esta división de los diferentes elementos virales en cuatro vectores separados disminuye el riesgo de crear un virus capaz de replicarse por recombinación accidental del genoma del lentivirus. Aquí, un vector que contiene la shRNA de interés y tres vectores de empaquetamiento (p-VSVG, PRSV, pMDL) son transfectadas transitoriamente en 293 células humanas. Después de al menos un período de incubación de 48 horas, el sobrenadante que contiene el virus se recoge y se concentra. Finalmente, título del virus se determina por el reportero (fluorescentes), expresión con un citómetro de flujo.

Protocolo

Parte 1: La transfección de células HEK 293 células para producir lentivirus

* 24 horas antes de la transfección, la placa de 2,5 X 10 ⁶ células en una placa de 10 cm para una confluencia del 50-70% al día siguiente.

1. Inicio este protocolo mediante la preparación de ADN con la que uno más tarde transfectar una de las células para hacer virus. En primer lugar, diluir FuGENE 6 Transfección reactivo Roche, un reactivo de los lípidos que componen las células toman el ADN. En un tubo de 1,5 ml, pipeta de 30μl FuGENE 6 en 600ul medio libre de suero (SFDMEM). Tenga cuidado de no dejar que FuGENE tocar la parte del tubo que se introduce en el medio. Deja que este FuGENE y mezclar SFDMEM e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
2. En la tapa del tubo, mezclar 4 mg lentiviral plásmido con 4 mg cada 3 ^ª generación vectores virales embalaje (pMDL, PRSV y pVSV-G). El lentiviral plásmido contiene el ADN del virus se inserta en el genoma de cada célula que infecta, mientras que los vectores de envases contienen genes de todas las otras proteínas necesarias para hacer un lentivirus.
3. Cierre la tapa y mezclar invirtiendo el tubo varias veces.
4. Incubar durante 15-20 minutos a temperatura ambiente.
5. Pipeta de todo el contenido del tubo en la placa 293. Mezclar suavemente por la placa de inclinación hacia atrás y adelante.
6. Volver a las células a la incubadora y permiten la producción viral que continúe durante 48-96 horas antes de la cosecha.
7. Durante la incubación, las células 293 transcribir el ADN de interés de la lentiviral plásmido, creando una copia de ARN de la construcción de lentiviral. También se transcriben y traducen los genes en los vectores de envases en las proteínas virales. Estas proteínas se procederá a realizar los virus de ARN que contiene la versión de su construcción lentiviral, que el virus se invertirá transcribir e insertar en los genomas de todas las células que infecta.

Parte 2: Cosecha lentivirales

1. Después de un período de incubación, tomar células de la incubadora y el uso de una jeringa desechable, de 10 ml para separar el sobrenadante, que ahora contiene el virus. Habrá alrededor de 10 ml de sobrenadante.
2. Coloque un filtro de jeringa 0.45μM a la punta y filtrar los virus en un tubo de ultracentrífuga Beckman. El filtro sólo permite que los virus, y no a las células a pasar.
3. Antes de desechar, se incuban todas las células produzcan más virus, placas de cultivo, las jeringas y los filtros en el 10% de lejía durante 45 minutos.

Parte 3: Concentración lentivirales a través de ultracentrifugación

1. Carga tubos de centrifugación en SW-41Ti o SW-28 cubos del rotor.
2. El uso de suero libre de DMEM para equilibrar todos los virus que contienen los tubos dentro de 0.2g.
3. Se cierre cubos del rotor y engancharlos en el rotor antes de colocar el rotor dentro de la ultracentrífuga
4. Girar el virus durante 90 minutos en una ultracentrífuga a 4 ° C a 25.000 rpm en un rotor SW-41Ti o 24.000 rpm en un rotor SW-28.
5. En una campana de cultivo de tejidos, invierta los tubos boca abajo para verter el sobrenadante en un recipiente con lejía al 10%.
6. Use un Kimwipe para absorber el exceso de líquido alrededor de la bolita y se invierte el tubo en un estante conveniente para no más de cinco minutos.
7. Para volver a suspender el pellet viral, utilice un filtro de punta a añadir 100 ml de PBS estéril en el tubo, entonces la pipeta hacia arriba y abajo unas 20 veces.
8. Deje el virus a 4 ° C durante la noche para completar la re-suspensión. Uno puede almacenar prepara viral a 4 grados durante aproximadamente 1 semana y a -80 grados durante un máximo de un año. Recuerde que debe tratar a todos los tubos de vacío con lejía al 10% antes de desecharlos.
9. Si se piensa en usar la preparación viral por más de la semana 1, hacer alícuotas mínimas de 5-20μl para futuros experimentos y una alícuota de 3 a 5μl de la titulación. Congelar y almacenar las alícuotas a menos 80.

Parte 4: Valoración lentivirales mediante citometría de flujo

1. El siguiente paso es determinar el título viral por citometría de flujo. Este método sólo funciona en los casos en que los lentivirus plásmido contiene un gen fluorescente. La idea es que cuando el virus infecta una célula, se introduce el ADN del plásmido lentiviral en el genoma de la célula. La célula infectada luego transcribir y traducir los genes que se incluyen en el plásmido lentiviral, y si incluye un gen fluorescente, fluorescente las células infectadas se. El nivel de fluorescencia representa la potencia, o título, de los virus.
2. Para cada cepa viral que se titularon, diluir 3 l de virus concentrado en 1,5 ml de medio completo (DMEM, pen-estreptocócica, glutamina, FBS).
3. En los pozos de 6.1 en una sola fila de una placa de 96 pocillos, realizar las diluciones seriadas siguiente: a los 6 pozos de añadir 100 ml de DMEM completo los medios de comunicación. Para el primer pozo de añadir 100μl de los medios de comunicación, sin virus (esta es su control sin manchas), para el segundo y añadir 100 ml del virus diluido (lo que equivale a 1 ml de virus sin diluir), a la tercera y añadir 100 mlde la mezcla de la segunda y, a la cuarta y añadir 100 ml de la tercera y, a la quinta y añadir 100μl del pozo cuarto y el sexto y añadir 100 ml de la quinta también. Finalmente tome 100 ul de la sexta y así descartar en lejía. Una serie de dilución se realizó en el que cada pozo tiene la mitad del volumen de los virus en comparación con el anterior.
4. Obtener un volumen total en todos los pozos de 200μl. Tenga en cuenta que se trata de diluciones sólo sugirió, que debería funcionar bien para la titulación de los virus más concentrada. Si el virus es baja en el título, o sin concentrar una posible necesidad de ajustar las diluciones.
5. Tratar cualquier virus diluido no utilizado con lejía al 10% durante 45 minutos antes de desecharlos en un contenedor de residuos biopeligrosos.
6. Añadir ~ 15000 sano, las células se dividen activamente 293 a cada uno de los seis pozos. Una sola placa de 96 pocillos se puede utilizar para títulos de 16 preparaciones virales.
7. Volver a las células incubadora grado 37 con 5% de CO ₂ y que la infección de proceder por lo menos durante 48 horas.
8. Después de la incubación, las células son analizadas para la expresión reportero (en nuestro caso la fluorescencia) con un citómetro de flujo. Las partículas virales se cuantifica el porcentaje de células fluorescentes por pozo.

Calcular el número de unidades infecciosas por ml con la siguiente fórmula:

_{(Número de células por pocillo en el día de las células de la infección por el reportero X positivo) X 1000}
^{______________________________________________________
ml de vector añadido a bien}

Parte 5: Resultados del representante:

Después de un después de la transfección de 48 horas el período de incubación, la placa de 293 células debería ser al fluorescentes alrededor del 90%. Un alto porcentaje de células fluorescentes es una indicación de un alto porcentaje de virus productores de células.

Después de la centrifugación, el pellet viral es apenas visible cuando la resuspensión. Esto es normal ya que la pastilla es clara y muy pequeños.

Al interpretar los resultados del citómetro de flujo, tenga en cuenta que sólo se puede lograr cálculos exactos título cuando se infectan (fluorescentes), las células no han recibido más de una integración viral por célula. Con el fin de asegurar que este es el caso, utilizar las células con una tasa de <15% de infección para los cálculos. Las células con las tasas de infección más altos probablemente han recibido varios integrantes virales por célula. Las diluciones que se sugiere en el paso 2 debe rendir varias muestras dentro de este rango de infección. Lo ideal es utilizar varias muestras para generar un gráfico de titulación (lineal) de la cual se puede calcular el título final, pero se puede calcular el título con una sola muestra, si es necesario. Uno puede esperar título de 1,0 x 10 ⁷ TU / ml de concentrado sin virus y 1.0 x 10 ⁸ TU / ml de virus concentrados.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS	Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG	Roche Group
Bleach	Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes	Falcon BD	353003
Multichannel pipette	Rainin
Filtered pipette tips	Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)	Eppendorf
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter Inc.
Tissue culture incubator at 5% CO2	Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.
Fluorescent microscope	Coulter
FACS Array	Beckman Coulter Inc.