تقنية لتصور في الوقت نفسه للفيروسات محددة CD8 + الخلايا T والخلايا المصابة بالفيروسات في الموضع</em

Summary

وهناك تقنية تجمع في تلطيخ tetramer الموقع والتهجين الموضع (ISTH) تمكن التصور ورسم الخرائط وتحليل القرب المكاني للمحددة فيروس CD8 خلايا تي + لأهداف المصابة بالفيروسات على ، وتحديد العلاقات الكمية بين هذه المستجيبات المناعي والأهداف إلى نتائج العدوى.

Abstract

أرقام ومواقع محددة من فيروس CD8 + ويعتقد أن الخلايا التائية النسبي لأرقام ومواقع أهدافهم الخلية المصابة إلى أن تكون حاسمة في تحديد النتائج التي تتراوح من تطهير للإصابة بالأمراض المزمنة المستمرة. نحن تصف هنا وسيلة لتقييم العلاقات المكانية والكمي بين المناعية المستجيب (E) فيروس محددة الموضع CD8 + الخلايا التائية والأهداف المصابة (T) الذي يجمع في تلطيخ الموقع (IST) tetramer للكشف عن الفيروسات محددة CD8 + الخلايا التائية و التهجين (ISH) للكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي + الخلايا في الأنسجة حيث المعركة بين الدفاعات المناعية والتهاب يحدث. مزيج من تلطيخ وISH IST ، يختصر ISTH ، وتمكن من تصوير ورسم خرائط المواقع من الخلايا المناعية المستجيب والأهداف ، وتحديد من السهل E : نسب تي. ويمكن بعد هذه المعايير بدورها أن تستخدم لتحديد العلاقات بين القرب المكاني ، وتوقيت وحجم الاستجابة المناعية التي توقع النتائج في وقت مبكر العدوى

Protocol

وقد استخدم هذا الأسلوب في البحث عنها في لي وآخرون ، والعلوم 323 ، 1726-1729 (2009) .

مجتمعة في تلطيخ tetramer الموقع والموضع في الإجراءات (ISTH) التهجين

ويمكن تقسيم الإجراءات ISTH الى 4 الخطوات التالية : 1) تلطيخ IST من المستضد محددة CD8 + الخلايا التائية في الأنسجة ؛ 2) ISH للكشف عن الفيروس المصابين - RNA + الخلايا ، 3) التصوير المجهري مبائر من IST الملطخة الخلايا والفيروسي RNA - + الخلايا ؛ 4) تحليل الصور ، بما في ذلك بناء صورة مركبة ورسم خرائط + tetramer وفيروس RNA + الخلايا.

1. تلطيخ IST من المستضد محددة CD8 + الخلايا التائية في أقسام الأنسجة.

1. قطع أنسجة جديدة في الفروع 200 ميكرون سميكة باستخدام vibratome أو مشرط.
2. تعيين البرد vibratome العقيمة مع حمام PBS - H والبرد الى 0-2 درجة مئوية زاوية شفرة vibratome إلى ° 27 حاد نوعا ما. كلما كان ذلك ممكنا ، والحفاظ على الأنسجة المبردة على الجليد من أجل تقليل التدهور. أنسجة جديدة هي أيضا أسهل لاستخدام القسم vibratome المبردة عند ذلك.
3. قطع الأنسجة مع مقص أو مشرط الجراحة الصغيرة واسعة في ما يقرب من بقطع 0.5cm الطول 0،25 طول. وضع قطعة نسيج في قارب تزن أو صحن صغير ، وتغطي مع ~ 40 درجة مئوية ذاب PBS 4 ٪ مخزنة منخفضة ذوبان agarose. تأكد من الأنسجة في اتصال مع الجزء السفلي من الطبق. دفع قطعة نسيج أسفل إذا كانت تطفو. يصلب على الجليد. هذا عادة ما يستغرق 3-5 دقائق.
4. معطف كتلة الأنسجة vibratome مع وكتايت الغراء. قطع agarose حول الأنسجة مع مشرط ، ثم باستخدام الملقط ، ونقل بعناية جزءا لا يتجزأ من النسيج الهش agarose إلى كتلة vibratome المغلفة في الغراء. لا تحريك قطعة من النسيج مرة يتم تعيينها في كتلة الأنسجة. اسمحوا الجافة حوالي 10 دقيقة على الجليد.
5. جبل كتلة الأنسجة في vibratome وقطع نسيج سميك في 200um المقاطع باستخدام القتلى سرعة بطيئة إلى الأمام والسعة العالية نسبيا. السرعة والسعة الإعدادات تختلف مع بعضها vibratome. إذا vibratome غير متوفرة ، أو الأنسجة غير قابلة للvibratome sectioning ، وقطع الأنسجة إلى شرائح رقيقة باستخدام مشرط.
6. نقل المقاطع مع الفرشاة في غرفة النسيج تعيين في البئر لوحة نسيج الثقافة كذلك تحتوي على 24 مل من 1 مبردة PBS - H. طرح على أقسام الأنسجة الأربعة في كل غرفة الأنسجة. تسمية غطاء من نسيج الثقافة مع لوحة المعلومات العينة التجريبية وتأمين غطاء لوحة مع الشريط المطاطي.
7. بدلا من ذلك ، للأنسجة التي لا تخفض بشكل جيد مع vibratome ، مثل القناة الهضمية ، ويمكن قطع رقيقة مثل شرائط ممكن مع شفرة حلاقة أو مشرط. وضع مقطع واحد فقط لكل بئر لأقسام قطع مشرط.
8. انتقل إلى تلطيخ فورا بعد الانتهاء من قطع الأنسجة. إبقاء أبواب مبردة لتقليل التدهور في جميع الأوقات حتى ثابتة. لا تدع المقاطع تجف. إبقاء أبواب المبردة في برنامج تلفزيوني العقيمة - H.
9. احتضان المقاطع من النسيج على مدار الليل مع tetramers 0.5 ملغ / مل مترافق FITC. يمكن أن تتضمن الماوس أو غير الأرنب الأجسام المضادة التي تستهدف الحواتم خارج الخلية في هذه الحضانة ، مثل مكافحة CD8 الأضداد ، 1:200 المخفف في عرقلة الحل. استخدم 1 مل لكل حل جيد لهذه المسألة وجميع حضانات لاحقة ، وتنفيذ هذا وجميع حضانات لاحقة في 4 درجات مئوية مع لوحات على منصة هزاز. إبقاء الغرف التي تحتوي على أنسجة العينات التجريبية المختلفة مفصولة واحدة على الأقل فارغة جيدا لمنع التلوث من الحلول الشاملة في الخطوات اللاحقة.
10. بعد الحضانة الأولية ، وغسل المقاطع مرتين مع PBS - H المبردة (2X) لمدة 20 دقيقة لكل منهما. القيام بذلك عن طريق تحويل غرف الأنسجة المختلفة إلى جانب 24 لوحة الثقافة التي تحتوي على أنسجة المبردة PBS - H. يجب الحرص على عدم بالتنقيط محتويات من عينة واحدة تجريبية الى آخر ، وعندما تتحرك غرف الأنسجة. حضانات للجميع لاحقة ويغسل نقل بالمثل غرف الأنسجة لوحة نظيفة تحتوي على الحل المناسب. رصد المقاطع في غرف الأنسجة أثناء إجراء للتأكد من أن لا تتعثر المقاطع على الجانبين من الغرف الأنسجة.
11. أبواب الإصلاح مخزنة مع برنامج تلفزيوني جديد بارافورمالدهيد 4 ٪ لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يغسل بالماء البارد PBS - H 2X 5 دقائق لكل منهما.
12. احتضان مع أضداد FITC أرنب ، على سبيل المثال Biodesign1 : 10000 ، في عرقلة حل واحد لمدة ثلاثة أيام. لوضع العلامات المشتركة يمكن أن تشمل غير الأرنب الأضداد الموجهة الحواتم الخلايا في هذه الحضانة أيضا. لهذا الخيار ، إذا لزم الأمر فضح الحواتم وتتخلل وكتلة الخلايا قبل الحضانة الثانية.
13. إذا باستخدام الأجسام المضادة التي تستهدف الخلايا التي تتطلب الحواتم استرجاع مستضد من تثبيت الفورمالديهايد ، وفضح الحواتم 3 مرات من قبل الغليان في 0.01M اليوريا و 10 ثانية في كل مرة ، في فرن الميكروويف. انتظر 2 دقائق بين كل التدفئة. نكون حذرين للغاية حيث يمكن حل الغليان قوة المقاطع من الآبار. إذا حدث هذا ، استخدام فرشاة الدهانلدفع المقاطع من الجانبين للغرفة الأنسجة أو من غطاء لوحة العودة الى الجزء السفلي من الغرفة الأنسجة المناسبة. إذا الأجسام المضادة لا تتطلب استرجاع مستضد حذفت هذه الخطوة.
14. إذا باستخدام الأجسام المضادة التي تستهدف الخلايا الحواتم ، قبل الحضانة الثانية ، وpermeabolize كتلة الخلايا في الأنسجة مع أقسام PBS - H التي تحتوي على 0.3 ٪ تريتون X - 100 ، و 2 ٪ مصل الماعز العادية لمدة ساعة. ثم نفذ حضانات الضد المتبقية في برنامج تلفزيوني - H التي تحتوي على 0.3 ٪ تريتون X - 100 و 2 ٪ مصل الماعز العادية.
15. بعد حضانة الثانية ، يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني - H لمدة 20 دقيقة إلى عدة ساعات. كرر مرتين عن ما مجموعه ثلاثة يغسل. تنفيذ الحضانة النهائي مع الأجسام المضادة المناسبة fluorescently المسمى. المخفف على سبيل المثال ، الماعز المضادة للأرنب ، والماعز Cy3 مكافحة الفأر اليكسا 488 1:1000 في عرقلة كل حل. احتضان لمدة ثلاثة أيام. إبقاء أبواب محمية من الضوء من خلال التفاف على لوحات في احباط القصدير خلال هذه الحضانة ، وبعد ذلك ، كما يروي fluorophores الخفيفة.
16. غسل المقاطع في برنامج تلفزيوني - H لمدة 20 دقيقة إلى عدة ساعات. كرر مرتين عن ما مجموعه ثلاثة يغسل.
17. لIST جنبا إلى جنب مع أبواب مرحلة ما بعد الإصلاح ISH بعد الإصلاح في بارافورمالدهيد 4 ٪ لمدة 1 ساعة لتأمين tetramers والأجسام المضادة في مكان ، ثم شطف مع أقسام PBS - H وجبل مرة.
18. استخدام الفرشاة لنقل المقاطع إلى شريحة المجهر. معطف كل قسم مع الجلسرين / الجيلاتين تحتوي 4mg/ml البروبيل غاللاتي أو غيرها من وسائل الإعلام المتصاعدة التي تحتوي على مادة حافظة fluorophore وتغطي مع ساترة. شرائح تخزين الحاويات في ضوء المحمية على الشريحة ° -20. شطف لوحات زراعة الأنسجة وإزالة التسميات على الأغطية مع الكحول. ويمكن إعادة استخدام لوحات.
19. تحليل الأنسجة المقاطع ملطخة مبائر المجهر. يمكن ثم الشروع في ISH.

2. الكشف عن الفيروس المصابين - RNA + الخلايا في الموقع التهجين.

تعديل هذا البروتوكول في الموقع التهجين من البروتوكولات التي تم نشرها مسبقا لدينا ^4،5 على النحو التالي :

1. إعادة قطع 5-8 ميكرون سميكة ، سميكة من sectionss في الموقع أقسام tetramer الملون.
   1. يتم تسخينها 200 ميكرون سميكة الأقسام في 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لفصل مقطع من الشريحة.
   2. ثم يتم تضمين المقطع في أكتوبر على الجليد الجاف.
   3. يتم قطع 8 ميكرون المقاطع مع ناظم البرد من المقاطع سميكة وانضمت إلى الشرائح silanized.
   4. ويمكن تخزين الشرائح في -80 درجة مئوية في مربع مختومة لاحقا في الموقع التهجين.
2. تهجين في الموضع
   1. ترطيب أقسام الأنسجة عن طريق غمر شرائح لمدة 3 دقائق في كل من الإيثانول بنسبة 90 ٪ والمياه DEPC المعاملة.
   2. Permeabilize أقسام النسيج عن طريق التسخين في المخزن سيترات 10MM (الرقم الهيدروجيني 6.0) عند 98 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 15 دقيقة.
   3. أقسام الأنسجة بارد في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة.
   4. تغسل مرتين في DEPC معاملة المياه لمدة 3 دقائق.
   5. Acetylate قسم الأنسجة بغمر الشرائح في أنهيدريد الخل 0.25 ٪ في الشاي M 0.1 (ثلاثي إلإيثانولامين ، pH8.0) لمدة 10 دقيقة.
   6. نقل الشرائح في الشاي M 0.1 (pH8.0) لمدة 5 دقائق.
   7. هجن المقاطع لS - ³⁵ - الفيروس المسمى محددة (مثل HIV - 1 ، SIV) المسبار بواسطة العقاقير أو بمعنى (السيطرة السلبية لHIV - 1 ، SIV) ، أو ³⁵ S - riboprobes LCMV المسمى (بمعنى المجمعة والعقاقير).
   8. غسل المقاطع مرتين مع 2xSSC لمدة 5 دقائق بعد التهجين بين عشية وضحاها في 42 درجة مئوية.
   9. غسل المقاطع في STE (0.5 M كلوريد الصوديوم ، 1MM EDTA ، 20 ملي تريس - HCL ، ودرجة الحموضة 7.5) لمدة 5 دقائق.
   10. هضم المقاطع مع RNases ألف وT1 في STE عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة
   11. غسل المقاطع في SSC 2X formamide زائد 50 ٪ لمدة 5 دقائق.
   12. غسل المقاطع في 10 دقيقة 1X SSC.
   13. المقاطع في غسل 0.5 X 15 دقيقة محكمة أمن الدولة.
   14. يذوى المقاطع في 70 و 80 و 100 ٪ يحتوي على الايثانول 0.3 خلات الأمونيوم M ، كل 5 دقائق.
   15. أقسام معطف مع مستحلب المسار النووي
   16. الجافة في غرفة مظلمة لمدة 1 ساعة.
   17. فضح الأقسام في 4 درجات مئوية لمدة 11 يوما (SIV) و 3 أيام (LCMV).
   18. وضع المقاطع في D19 (كوداك ، القط # 146 4593) لمدة 3 دقائق ، ويغسل في 30 ثانية dH2O ، المثبت الإصلاح في السريع (كوداك ، القط # 146 4106) لمدة 4 دقائق ، ويغسل في 5 مرات dH2O 3 دقيقة س.
   19. يذوى في 70 ٪ ، 80 ٪ والإيثانول المطلقة ، كل 5 دقائق.
   20. جبل في الفلورية الشرائح المتوسطة Permount متوافق.

3. الحصول على صور المجهر مبائر.

1. ISTH التقاط الصور مع مجهر بيو راد 1000 MRC متحد البؤر ، أو أي أخرى مبائر المجهر مع الجهاز التأمل Epi2 أزرق.
2. استخدام Epi1 - 605 للملون تألقي tetramer الحمراء ، Epi2 DF32 - 522 ملون تألقي CD8 للأخضر ، وأزرق Epi2 انعكاس للحبوب الفضة (ISH في إشارة radioautographs المتقدمة) في 20X (على SIV) أو 60x (لLCMV)
3. جمع بالتسلسل Z - المسلسل صور في 1 ميكرون في فترات ثلاث قنوات من كل حقل.
4. الحصول على صور من كل قسم من اليسار إلىالحق ، ومن أعلى إلى أسفل ، واسم كل صورة وفقا لصف وعمود في ملف إكسل.
5. التقاط كل صورة مع تداخل ~ 20 ٪ مع الصور المجاورة لها لتجنب الثغرات في صورة المونتاج إعادة بنائها.

4. تحليل صورة : صورة المونتاج إعادة الإعمار ، وحساب الخلية النقطه الوسطى وتحليل المكاني.

1. المشروع Z - التسلسلي الصور في صورة واحدة لكل قناة مع مساعد ومتحد البؤر (النسخة 4.02).
2. دمج الصورة تلقائيا المتوقعة من ثلاث قنوات في صورة RGB واحد ، باستخدام العمل فوتوشوب 7.0 الداخلي.
3. إنشاء صورة المونتاج بواسطة خياطة الصور معا في دمج الطبقات في فوتوشوب 7.0.
4. المنتسبين الحبوب الفردية والفضة وصمة عار tetramer مع الخلايا ، وتعيين X ، Y إحداثيات مراكز (centroids) من الحمض النووي الريبي + SIV والخلايا tetramer + ، وذلك باستخدام MetaMorph (الإصدار 7.1.3) أو Photoshop (متوفر من المؤلف)
5. تصدير البيانات إلى ملفات إكسل النقطه الوسطى كأرقام الرقمية لكل خلية. E : مصممون نسب T من ملفات Excel من اجمالي عدد tetramer + و + خلايا الحمض النووي الريبي الفيروسي في هذا الباب.

العلاقات المكانية بين الأحمر والأزرق tetramer + RNA SIV يتم التقاطها بواسطة خلايا + نسخ ولصق قطع كل منها من ملفات Excel في وثيقة Photoshop. بعد خفض عتامة طبقة لمواءمة ونطاق شبكات بحيث تتزامن ، واللون ، واختيار ونسخ ولصق في طبقة جديدة مواقف الخلايا الزرقاء + RNA ، ومن ثم التخلص من طبقة تستخدم لمحاذاة شبكات ومواقف من الحمض النووي الريبي + tetramer والفيروسية وسوف يتم الكشف عن خلايا + في الصورة بالارض.

5. ملاحظات إضافية

إذا قطع الأنسجة المعدية :

عمل في مختبر BSL2.5. اتخاذ احتياطات خاصة مع شفرات الحلاقة. وضع أسلاك شائكة في جبل شفرة vibratome مع ملقط. اذا كنت لا تستطيع أن تضع في النصل مع ملقط ، ثم وضع عليها قبل إضافة إلى الحمام الأنسجة ، وعدم استبدال النصل. عند الانتهاء من القطع ، وإزالة شفرة مع ملقط. رذاذ مع شفرة EtOH 70 ٪ أو DMQ قبل إزالتها. كما هو الحال دائما ، والتخلص من ريش في وعاء الحادة. تغيير القفازات الخارجي أو شطف في مطهر بعد كل اتصال مع الأنسجة الملوثة في برنامج تلفزيوني أو دبابات. عند الانتهاء ، إذا كان يعمل مع المواد المعدية ، إضافة إلى برنامج تلفزيوني DMQ مطهر في خزان وترك الجلوس بضع دقائق قبل إزالة. التخلص من برنامج تلفزيوني تطهير هباء. ثم يشطف الخزان بالماء لإزالة الملح والمواد المطهرة. تنظيف مساحة العمل والأواني مع DMQ. شطف الأواني بالماء.

جعل tetramers من مونومرات MHC biotinylated :

الحصول على فئة MHC biotinylated أنا مثل جزيئات HLA - A * 0201 / ₂ م ب / جزيئات الببتيد أنتجت إما مع الكمامة (SLYNTVATL) ، بول (ILKEPVHGV) ، أو غير ذات صلة MART الببتيد (ELAGIGILTV) من الببتيدات بيكمان كولتر. Biotinylated HLA - A * 0301 / ₂ م ب / جزيئات الببتيد أنتجت إما مع الكمامة (KIRLRPGGK) أو نيف (QVPLRPMTYK) في منشأة tetramer المعدية. تتولد Tetramers بإضافة 6 aliquots من FITC ExtraAvidin المسمى (سيغما) إلى Mamu biotinylated A * 01 / ب ₂ م / مونومرات الببتيد على مدى 8 ساعات لنسبة لا المولي النهائي لل4.5:1 الأساس المنطقي وراء إضافة Extravidin ببطء أنه خلال نقاط وقت مبكر تكون هناك وفرة من مونومر التي تضمن أن جميع Extravidin أضاف يحصل على كل أربعة مواقع البيوتين ملزمة. لاحقا في رد الفعل ، وهذه العملية هي أقل فعالية بسبب وجود أقل مونومر اليسار وأكثر من فرصة أن ExtrAvidin لن يكون ملزما جميع المواقع 4. إذا أضيف كل من ExtrAvidin في آن واحد فإن الرد سيكون أقل فعالية وأكثر الجزيئات Extravidin لن يكون له سوى 2 أو 3 مونومرات المرفقة.

Discussion

منذ يستخدم الفيروس RNA كعلامة للخلايا المصابة بالفيروسات في هذا التقرير ، ينبغي لجميع الكواشف قبل التهجين يكون حرا RNAase. وقد تم إجراء تعديل في الموقع التهجين الموصوفة هنا للحفاظ على إشارة من الفلورسنت في تلطيخ tetramer الموقع. منذ radioautographic إشارة من الخلايا المصابة بالفيروس - - الكشف عنها بواسطة التهجين في الموقع هو على عمق حوالي واحد قطره الخلية ، والأجزاء السميكة المستخدمة في تلوين tetramer الوضع الطبيعي أن تكون في recut 5-8 ميكرون سميكة المقاطع.

ووصف هذا الأسلوب في الجمع بين رواية tetramers الموقع والتهجين في الموقع (ISTH) هنا يمكن تصور في وقت واحد ، ورسم الخرائط وتحليل العلاقة المكانية محددة الفيروس خلايا CD8 + T والخلايا المصابة بالفيروسات الهدف. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لتقييم الخلايا التائية CD8 + يستند اللقاح والممرض في الفيروسات الأخرى غير المضيفة والتفاعلات أسلوب تحليل الصور الموصوفة هنا يمكن أيضا أن تتكيف مع دراسة العلاقات المكانية من السكان أي اثنين خلية التفاعل في الموقع ، على سبيل المثال كنا في الآونة الأخيرة إجراء دراسة الخرائط في النقطه الوسطى من HIV - 1 الاتصال الجنسي في نموذج الرئيسيات غير البشرية من نقص المناعة القردي عدوى الفيروس من قرود المكاك ريسوس ⁶

Materials