טכניקה במקביל דמיינו ספציפיות וירוס CD8 + T ו-תאים הנגועים בווירוס תאים באתרו</em

Summary

טכניקה המשלבת ב מכתים tetramer באתרו של הכלאה באתרו (ISTH) מאפשר, הדמיית מיפוי וניתוח של הקרבה המרחבי של ספציפיים וירוס CD8 תאים + T ליעדים הנגועים בנגיף שלהם, וקביעת היחסים הכמותיים בין effectors מטרות החיסונית לתוצאות זיהום.

Abstract

המספרים של הנגיף במקומות ספציפיים CD8 + T תאים ביחס מספרים ומיקומים של מטרות נגועים שלהם התא נחשב קריטי בקביעת התוצאות אשר נע בין פינוי מתמשך לזיהומים כרוניים. אנו מתארים כאן שיטה להערכת יחסים מרחביים כמותיים בין החיסון מפעיל (ה) וירוס ספציפי CD8 + T תאים מטרות נגוע (T) אשר משלב מכתים באתרו (IST) tetramer לזהות וירוסים ספציפיים CD8 + T תאים ו באתרו ההכלאה (שאני עורך) כדי לזהות נגיפי-RNA + תאים ברקמות שם את הקרב בין ההגנה החיסונית וזיהום מתרחש. השילוב של מכתים IST ו - איש, מקוצר ISTH, מאפשרת הדמיה ומיפוי של המיקומים של תאים מפעיל מטרות החיסונית, ונחישות קליל של E: יחסי טי. פרמטרים אלה בתורם לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לקבוע את יחסי הגומלין בין קרבה מרחבית, ואת העיתוי ואת העוצמה של התגובה החיסונית כי לחזות תוצאות של זיהום מוקדם.

Protocol

בשיטה זו נעשה שימוש במחקר דיווחו Li et al. Science 323, 1726-1729 (2009) .

משולב ב מכתים tetramer באתרו ב (ISTH) נהלים באתרו הכלאה

נהלים ISTH ניתן לחלק 4 שלבים: 1) IST מכתים של אנטיגן ספציפי CD8 + T תאים ברקמות; 2) שאני עורך לזהות וירוס נגועים-RNA + תאים: 3) הדמיה מיקרוסקופית confocal של IST מוכתמת תאים ויראלי-RNA + תאים: 4) ניתוח התמונה, כולל בנייה של montages תמונה ומיפוי של tetramer + + ו - וירוס RNA בתאים.

1. IST מכתים של אנטיגן ספציפי CD8 + T תאים בסעיפים רקמות.

1. גזור לתוך רקמות טרי 200 חלקים עבים אממ באמצעות vibratome או אזמל.
2. צ'יל אמבטיה vibratome עם סטרילי PBS-H ו צמרמורת 0-2 ° C. הגדר את זווית הלהב vibratome ל 27 מעלות תלולים למדי. במידת האפשר, לשמור על הרקמות מצוננים על קרח כדי למזער את ההשפלה. רקמה טרי הוא גם קל יותר לפרק באמצעות vibratome כאשר הוא צונן.
3. גזור רקמת עם מספריים או אזמל מנתחים לתוך רחב 0.5cm כ 0.25 חתיכות קטנות של ס"מ. שים חתיכות רקמה בסירה לשקול או צלחת קטנה לכסות עם ~ 40 ° C PBS 4% נמס שנאגרו נמוכה להמיס agarose. ודא רקמות נמצא במגע עם החלק התחתון של המנה. Push פיסות הרקמה למטה אם הם צפים. לבסס על הקרח. זה בדרך כלל לוקח 3-5 דקות.
4. מעיל vibratome לחסום רקמה עם דבק Loctite. גזור agarose סביב הרקמה עם אזמל, ולאחר מכן באמצעות מלקחיים, בזהירות להעביר את הרקמה העדינה agarose מוטבע לחסום vibratome מצופה דבק. אל תזיז את פיסת רקמה פעם זה מוגדר על לחסום את הרקמה. בואו יבש כ -10 דקות על הקרח.
5. הר לחסום רקמות vibratome ו לחתוך את הרקמה לתוך 200um חלקים עבים באמצעות מהירות מת קדימה איטי משרעת גבוהה יחסית. הגדרות מהירות משרעת להשתנות עם כל vibratome. אם vibratome אינו זמין, או רקמות אינו מקובל vibratome חתך, לחתוך לרצועות דקות רקמות באמצעות אזמל.
6. העברת חלקים עם מכחול לתאי רקמת להגדיר היטב את צלחת 24 היטב בתרבות רקמה המכילה 1 מ"ל של צונן PBS-H. לשים עד ארבעה חלקים רקמה לתוך תא כל רקמות. לייבל את המכסה של הצלחת רקמה תרבות עם מידע מדגם ניסיוני מכסה מאובטח לצלחת עם גומייה.
7. לחלופין, עבור רקמות שאינן לחתוך היטב עם vibratome, כמו המעיים, יכול לחתוך דק כמו רצועות אפשרי עם סכין גילוח או אזמל. שים רק קטע אחד לכל היטב לחתוך קטעים אזמל.
8. המשך מכתים מייד לאחר חיתוך רקמות המוגמר. שמור סעיפים צונן כדי למזער את ההשפלה בכל עת עד קבוע. אל תתנו סעיפים להתייבש. שמור מקטעים צונן סטרילי PBS-H.
9. דגירה סעיפים רקמה על לילה עם tetramers 0.5 מ"ג / מ"ל ​​מצומדות FITC. יכול לכלול את העכבר או אי - ארנב נוגדנים המכוונים epitopes תאיים ב הדגירה זה, למשל אנטי CD8 נוגדנים, מדולל 1:200 בחסימת פתרון. השתמש ב 1 מ"ל לכל פתרון גם לכך וכל incubations הבאות, ולבצע את כל incubations הבאים ב 4 ° C עם צלחות על פלטפורמת נדנדה. שמור לתאי רקמה המכילה דגימות ניסויים שונים מופרדים אחד לפחות ריק היטב על מנת למנוע זיהום לחצות של פתרונות בשלבים הבאים.
10. לאחר הדגירה העיקרי, לשטוף חלקים עם פעמיים צונן PBS-H (2X) במשך 20 דקות כל אחד. לעשות זאת על ידי העברת לתאי רקמות צלחת רקמות שונות 24-מקורר היטב בתרבות המכיל PBS-H. היזהר שלא לטפטף תוכן ממדגם דגם ניסיוני לתוך אחר, בעת העברת לתאי רקמות. לכל incubations ושוטף הבאים דומה להעביר לתאי רקמות צלחת נקייה המכיל את הפתרון המתאים. צג סעיפים בתאי הרקמה במהלך ההליך כדי לוודא כי החלקים לא להיתקע על צידי לתאי רקמות.
11. סעיפים תקן עם PBS טרי שנאגרו paraformaldehyde 4% עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר. לשטוף עם קור דק PBS-H 2X 5 כל אחד.
12. דגירה עם אנטי FITC נוגדנים ארנבת, למשל Biodesign1: 10,000, בחסימת פתרון אחד לשלושה ימים. עבור תיוג משותפת, יכול לכלול אי - ארנב נוגדנים המכוונים epitopes תאיים ב הדגירה זה גם כן. עבור אפשרות זו, אם יש צורך לחשוף epitopes ו מחלחלים ולחסום את התאים לפני הדגירה השני.
13. אם באמצעות נוגדנים המכוונים epitopes תאיים הדורשים אחזור אנטיגן מן הקיבעון פורמלדהיד, לחשוף epitopes על ידי 3 פעמים רותחים דשן 0.01M, 10 שניות בכל פעם, במיקרוגל. חכה 2 דקות בין כל חימום. היזהר מאוד כפתרון רותחים יכולים להכריח את הסעיפים מתוך בארות. אם זה יקרה, להשתמש במברשת צבעלדחוף חלקים מן הצדדים של תא או רקמה מן המכסה של הצלחת חזרה לתוך החלק התחתון של תא רקמת המתאים. אם נוגדנים אינם דורשים אחזור אנטיגן להשמיט את הצעד הזה.
14. אם באמצעות נוגדנים המכוונים epitopes תאיים, לפני הדגירה השני, permeabolize ולחסום תאים בסעיפים רקמה עם PBS-H המכיל 0.3% Triton X-100, ו -2% נסיוב עז נורמלי במשך שעה אחת. ואז לבצע incubations נוגדן שנותרו PBS-H המכיל 0.3% Triton X-100 ו - 2% נסיוב עז נורמלי.
15. לאחר דגירה השני, לשטוף מקטעים PBS-H במשך 20 דקות עד מספר שעות. חזור פעמיים בסכום כולל של שלושה שוטף. בצע הדגירה הסופי עם נוגדנים שכותרתו fluorescently המתאים. לדוגמה, עז נגד ארנב Cy3 עזים אנטי עכבר אלקסה 488 בדילול 1:1000 כל חסימה פתרון. דגירה של 1-3 ימים. שמור חלקים מוגנים מפני אור על ידי עטיפת צלחות נייר אלומיניום במהלך הדגירה זה ואילך, כמו מרווה fluorophores אור.
16. לשטוף מקטעים PBS-H במשך 20 דקות עד מספר שעות. חזור פעמיים בסכום כולל של שלושה שוטף.
17. עבור IST בשילוב עם הפוסט לתקן סעיפים שאני עורך שלאחר לתקן paraformaldehyde ב -4% במשך שעה 1 עד tetramers ונוגדנים מאובטח במקום, ולאחר מכן לשטוף חלקים עם PBS-H שוב הר.
18. שימוש במכחול להעביר חלקים לשקופית מיקרוסקופ. כל סעיף מעיל עם גליצרול / הג'לטין המכיל 4mg/ml n-propyl gallate או מדיה הרכבה אחרים המכילים חומר משמר fluorophore ומכסים coverslip. חנות שקופיות מיכל אור שקופיות מוגן ב -20 °. לשטוף תרבות צלחות רקמות להסיר תוויות על העפעפיים עם אלכוהול. ניתן לעשות שימוש חוזר צלחות.
19. ניתוח סעיפים רקמה צבעונית עם מיקרוסקופ confocal. ואז יכול להמשיך איש.

2. זיהוי וירוס נגועים-RNA + תאים על ידי הכלאה ב באתרה.

זה בפרוטוקול הכלאה באתרו שונה מן הפרוטוקולים שפורסמו בעבר שלנו ^4,5 כדלקמן:

1. Re-לחתוך 5-8 מיקרון עבה sectionss מ עבה בסעיפים מוכתם באתרו tetramer.
   1. 200 מיקרון עבה סעיפים מחוממים על 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לנתק את קטע מתוך השקופית.
   2. סעיף מוטבע אז על קרח יבש אוקטובר
   3. 8 מיקרון קטעים נחתכים עם cryostat מן הסעיפים עבה דבק שקופיות silanized.
   4. שקופיות ניתן לאחסן ב -80 ° C בקופסה אטומה עבור מאוחרות הכלאה באתרה.
2. ב הכלאה באתרו
   1. רעננותם סעיפים רקמה ידי טבילה שקופיות עבור 3 דקות כל אחד 90% אתנול ו DEPC שטופלו מים.
   2. Permeabilize סעיפים הרקמות על ידי חימום במאגר ציטראט 10mm (pH 6.0) בשעה 98 ° C באמבט מים במשך 15 דקות.
   3. רקמה סעיפים מגניב בטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות.
   4. לשטוף פעמיים במים DEPC שטופלו במשך 3 דקות.
   5. Acetylate קטע רקמה על ידי שיקוע שקופיות אנהידריד אצטית 0.25% ב 0.1 M תה (triethanolamine, pH8.0) במשך 10 דקות.
   6. העברת שקופיות TEA M 0.1 (pH8.0) במשך 5 דקות.
   7. להכליא חלקים ^ל-S-35 שכותרתו וירוס ספציפי (כגון HIV-1, SIV) בדיקה antisense או תחושה (בקרה שלילית ל-HIV-1, SIV), או ^35-S שכותרתו riboprobes LCMV (במובן ונקווה ו antisense).
   8. לשטוף חלקים פעמיים עם 2xSSC 5 דקות לאחר הכלאה בין לילה בשעה 42 ° C.
   9. לשטוף מקטעים STE (0.5 מ 'NaCl, 1mm EDTA, 20 מ"מ טריס-HCL, pH 7.5) עבור 5 דקות.
   10. תקציר RNases חלקים עם A ו-T1 ב STE על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות
   11. לשטוף מקטעים 2x SSC פלוס לפוראמיד 50% עבור 5 דקות.
   12. לשטוף מקטעים דקות 1x 10 SSC.
   13. לשטוף מקטעים 0.5 דק 'x 15 SSC.
   14. מייבשים הסעיפים 70, 80 ו - 100% אתנול המכילה M 0.3 אמוניום אצטט, כל 5 דקות.
   15. מעיל קטעים עם אמולסיה מסלול גרעיני
   16. יבש בחדר חשוך במשך שעה 1.
   17. לחשוף חלקים על 4 מעלות צלזיוס למשך 11 יום (SIV) ו 3 ימים (LCMV).
   18. פיתוח מקטעים D19 (קודאק, חתול # 146 4593) 3 דקות, לשטוף dH2O ב 30 שניות, לתקן ב Rapid Fixer (קודאק, חתול # 146 4106) עבור 4 דקות, לשטוף dH2O ב 5 דקות X 3 פעמים.
   19. מייבשים ב 70%, 80% אתנול אבסולוטי, 5 דקות כל אחד.
   20. הר שקופיות בינוני פלורסנט Permount תואם.

3. רוכשת את תמונות מיקרוסקופ confocal.

1. צלמו תמונות ISTH עם מיקרוסקופ Bio-Rad 1000 MRC Confocal, או כל מיקרוסקופ confocal אחרים עם המכשיר Epi2 כחול השתקפות.
2. השתמש Epi1-605 עבור tetramer אדום fluorochrome, Epi2 DF32-522 עבור הירוק CD8 fluorochrome, ואת השתקפות Epi2-Blue עבור דגנים כסף (אות שאני עורך את radioautographs שפותחה) בשעה 20x (עבור SIV) או 60x (עבור LCMV)
3. ברצף לאסוף Z-סדרתי תמונות ב 1 מיקרון במרווחים של שלושת הערוצים של כל שדה.
4. רוכשת את תמונות כל מקטע משמאלהדימוי הנכון, מלמעלה למטה, שם כל אחד על פי שורה שלה עמודה בקובץ Excel.
5. צלמו כל תמונה עם ~ 20% חפיפה עם תמונות השכנות, כדי למנוע פערים תמונת מונטאז' משוחזר.

4. ניתוח תמונה: שחזור תמונה מונטאז', חישוב תא centroid וניתוח מרחבי.

1. פרויקט Z-סדרתי תמונות לתוך תמונה אחת עבור כל ערוץ עם עוזר Confocal (גרסה 4.02)..
2. באופן אוטומטי למזג את התמונה המוקרנת מתוך שלושת הערוצים לתוך תמונת RGB אחד, באמצעות הליך 7.0 Photoshop פעולה.
3. יצירת תמונת מונטאז' על ידי תפרים תמונות התמזגו יחד שכבות ב-Photoshop 7.0.
4. עמית דגנים כסף הפרט tetramer כתם עם תאים, להקצות את X, Y קואורדינטות המרכזים (centroids) של RNA SIV + ו tetramer + תאים, באמצעות MetaMorph (גרסה 7.1.3.) או פוטושופ (זמין המחבר)
5. ייצוא נתונים centroid לתוך קבצי Excel כמספרים מספריים עבור כל תא. E: יחסי T נקבעים מתוך קבצי Excel מן המספרים הכוללים של tetramer + + ו-RNA נגיפי בתאים בסעיף.

יחסים מרחביים בין אדום וכחול + tetramer SIV RNA בתאים + נלכדים על ידי העתקה והדבקה מגרשים שלהם מן קבצי Excel למסמך Photoshop. לאחר הפחתת האטימות של השכבה כדי ליישר בהיקף רשתות, כך שהם חופפים, צבעים לבחירה העתקה והדבקה לתוך שכבה חדשה את עמדותיהם של כחול RNA + תאים, ולאחר מכן משליכים את השכבה נהגו ליישר את רשתות, עמדות של + tetramer ו-RNA נגיפי + תאים יתגלה בתמונה שטוח.

5. הערות נוספות

אם חיתוך הרקמה זיהומיות:

עבודה במעבדה BSL2.5. לנקוט באמצעי זהירות מיוחדים עם סכיני גילוח. שים את להב הסכין לתוך הר vibratome עם מלקחיים. אם אתה לא יכול לשים את הלהב עם מלקחיים, ואז לשים אותו לפני הוספת רקמות באמבטיה, לא להחליף את הלהב. כאשר סיים לחתוך, להסיר את הלהב עם מלקחיים. תרסיס עם להב EtOH 70% או DMQ לפני הסרת. כמו תמיד, תשליך להבי במיכל החדים. שנה כפפות החיצונית או לשטוף בחומר חיטוי לאחר כל מגע עם רקמה או PBS מזוהם במיכל. בסיום, אם עובדים עם חומר זיהומיות, להוסיף חומר חיטוי DMQ כדי PBS במיכל ולתת לשבת כמה דקות לפני הסרת. השלך PBS לחטא ירדו לטמיון. ואז לשטוף את המיכל עם מים כדי להסיר מלח וחומרי חיטוי. סביבת עבודה נקייה וכלי עם DMQ. לשטוף כלים עם מים.

To Make tetramers מ מונומרים MHC biotinylated:

השג בכיתה MHC biotinylated אני מולקולות כגון HLA-A * 0201 / B ₂ מ '/ מולקולות פפטיד המיוצר עם Gag או (SLYNTVATL), פול (ILKEPVHGV), או לא רלוונטי מארט פפטיד (ELAGIGILTV) פפטידים מן Beckman Coulter. Biotinylated HLA-A * 0301 / B ₂ מ '/ מולקולות פפטיד המיוצר עם Gag או (KIRLRPGGK) או הנף (QVPLRPMTYK) במתקן tetramer NIAID. Tetramers נוצרות על ידי הוספת 6 aliquots של FITC שכותרתו ExtraAvidin (Sigma) כדי biotinylated ממו * 01 A / B ₂ מ '/ מונומרים פפטיד במשך 8 שעות יחס טוחנת הסופי של 4.5:1. הרציונל מאחורי הוספת Extravidin לאט הוא שבמהלך נקודות זמן מוקדם יש עודף של מונומר אשר מבטיח כי כל Extravidin הוסיף מקבל את כל ארבעת אתרי ביוטין כבול. בהמשך התגובה, תהליך זה הוא פחות יעיל, כי יש פחות מונומר שמאל יותר סיכוי כי ExtrAvidin לא תהיה כל 4 האתרים כבול. אם להוסיף את כל ExtrAvidin מיד התגובה תהיה יעילה פחות מולקולות Extravidin יותר היו רק 2 או 3 מונומרים המצורפת.

Discussion

מאז נגיף RNA משמש כסמן תאים הנגועים בנגיף בדוח זה, כל ריאגנטים לפני הכלאה צריכים להיות חופשיים RNAase. בהליך הכלאה באתרו המתואר כאן שונתה כדי לשמר את האות ניאון מ ב מכתים tetramer באתרה. מאז האות radioautographic מ הנגועים בנגיף תאים זוהה על ידי הכלאה ב באתרו הוא בעומק של בערך בקוטר-תאים, בסעיפים עבה המשמש ב מכתים tetramer באתרו להיות חתכה מחדש תוך 5-8 מיקרון בעובי חלקים.

זו טכניקה חדשנית של שילוב של tetramers באתרו של הכלאה באתרו (ISTH) המתואר כאן מאפשר מיפוי להדמיה סימולטני, וניתוח הקשר המרחבי של וירוס ספציפי בתאי CD8 + T ו-נגוע בווירוס התאים היעד. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מנת להעריך CD8 + T תא החיסון מבוסס על נגיף פתוגן שאינו אחרים ואת האינטראקציות המארח. שיטת ניתוח התמונה שתוארה כאן יכול להיות גם מותאם המחקר יחסים מרחביים של כל שני תאים אוכלוסיות אינטראקציה באתרו, למשל, אנחנו לאחרונה השתמשו הליך מיפוי centroid בלימוד של העברת HIV-1 המינית במודל פרימטים לא אנושיים של חסר חיסוני הקופי זיהום וירוס של קופי רזוס ⁶

Materials