Техника одновременно визуализировать вирус-специфических CD8 + T-клетки и инфицированные вирусом клетки В месте</em

Резюме

Техника объединения на месте окрашивания тетрамера и гибридизация (ISTH) позволяет визуализации, отображения и анализа пространственной близости вирус-специфических CD8 + Т-клеток с их инфицированных вирусом цели, а также определение количественных соотношений между этими иммунных эффекторов и задач к инфекции результатов.

Аннотация

Количества и местонахождения вирус-специфических CD8 + T-клеток относительно количества и местонахождения их инфицированных цели ячейка считается критическим для определения результатов, которые варьируются от оформления к хроническому стойких инфекций. Мы опишем здесь метод оценки пространственных и количественных соотношений между иммунной эффекторной (E) вирус-специфических CD8 + Т-клеток и инфицированных мишеней (Т), которая объединяет на месте тетрамер (IST) окрашивания для выявления вирус-специфических CD8 + T-клеток и на месте гибридизация (МОГ) для обнаружения вирусной РНК +-клеток в тканях, где сражение между иммунной и инфекция имеет место. Сочетание окрашивания IST и ISH, сокращенно ISTH, дает возможность визуализации и отображения местах иммунных клеток-эффекторов и задач, а поверхностное определение E: T отношений. Эти параметры в свою очередь, могут быть использованы для определения отношений между пространственной близости, а также сроки и величина иммунного ответа, что предсказать результаты в начале инфекции.

протокол

Этот метод был использован в исследованиях сообщается в Li и соавт., 323 Наука, 1726-1729 (2009) .

Комбинированное на месте окрашивания тетрамера и гибридизация (ISTH) процедуры

ISTH процедуры можно разделить на 4 этапа: 1) IST окрашивание антиген-специфических CD8 + T-клеток в тканях, 2) ISH для выявления инфицированных вирусом-РНК + клеток, 3) конфокальной микроскопических изображений IST-окрашенных клеток и вирусной РНК + клетки, 4) анализ изображений, в том числе строительство изображение монтажи и картирование тетрамер + и вирусной РНК + клеток.

1. IST окрашивание антиген-специфических CD8 + Т-клеток в срезах тканей.

1. Cut свежих тканей в 200 мкм разделы, используя vibratome или скальпелем.
2. Холод vibratome ванна с стерильной PBS-H и охладить до 0-2 ° С. Установите vibratome углом лезвие довольно крутой 27 °. По возможности, держите тканей охлажденной на льду, чтобы минимизировать деградацию. Свежая ткань также легче секции, используя vibratome, когда она охлаждается.
3. Отрежьте ткань с хирургическим скальпелем или ножницами на мелкие примерно 0,5 см в ширину и 0,25 см высотой штук. Положите ткань штук в весят лодке или маленькое блюдо и накрыть ~ 40 ° C расплавленный 4% PBS буфере низкой расплава агарозы. Убедитесь, что ткань находится в контакте с нижней части блюда. Нажмите ткани частей вниз, если они плавают. Укрепить на льду. Это обычно занимает 3-5 минут.
4. Пальто vibratome ткани блок клеем Loctite. Вырезать агарозном вокруг ткани скальпелем, а затем с помощью щипцов, тщательно передачи хрупкой агарозном встроенных ткани vibratome блока покрыты клеем. Не перемещайте кусочек ткани, когда он будет установлен на ткани блока. Дайте высохнуть около 10 минут на льду.
5. Горы ткани блока в vibratome и сократить ткани в 200um толстым слоем использованием мертвых медленным поступательной скорости и относительно высокой амплитудой. Скорость и амплитуда настройки изменяются с каждой vibratome. Если vibratome недоступен, или ткани, не поддается vibratome секционирования, вырезать тканей на тонкие полоски с помощью скальпеля.
6. Передача участков с кистью в ткани камеры установлены в скважине 24-и культуре ткани пластину, содержащую 1 мл охлажденной PBS-H. Положите до четырех разделов ткани в каждой ткани камеры. Этикетка крышки пластины тканевой культуры с экспериментальной информации образца и безопасной крышкой, чтобы пластина с резинкой.
7. Кроме того, для тканей, которые не режут хорошо с vibratome, как кишечник, может сократить как можно тоньше полосы с скальпеля или лезвия бритвы. Положите только один раздел на лунку для скальпеля разделы разреза.
8. Приступить к окрашиванию сразу же после резки готовых тканей. Держите разделы охлажденным до сведения к минимуму деградации во все времена, пока исправлена. Не позволяйте разделы высохнуть. Держите секций в охлажденном стерильной PBS-H.
9. Инкубируйте срезов ткани в течение ночи с 0,5 мг / мл FITC сопряженных тетрамеров. Может включать мыши или не кролика антитела, направленные на внеклеточные эпитопов в этой инкубации, например, анти-CD8 антител, разбавленной 1:200 в блокировании решения. Используйте 1 мл раствора на лунку для этого и всех последующих инкубации, а также выполнять эту и все последующие инкубации при 4 ° С с тарелки на качалке платформы. Держите ткани камер, содержащих различные экспериментальные образцы разделены по крайней мере одна пустая хорошо, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение решения в последующих шагов.
10. После первичной инкубации, мыть участки с охлажденным PBS-H в два раза (2X) в течение 20 минут каждый. Сделайте это путем передачи ткани камер для различных 24-и культуре ткани пластины, содержащей охлажденным PBS-H. Будьте осторожны, чтобы не капать содержимое из одного экспериментального образца в другую, при перемещении тканей камер. Для всех последующих инкубации и моет аналогичным передачи ткани камер чистую тарелку, содержащий соответствующие решения. Монитор секций в ткани камеры во время процедуры, чтобы убедиться, что разделы не застревают на сторонах ткани камер.
11. Fix разделы со свежим PBS буфером 4% параформальдегида в течение 2 часов при комнатной температуре. Промыть холодной PBS-H 2X 5 минут каждый.
12. Инкубируйте с кроликом анти-FITC антител, например Biodesign1: 10000, в блокировании решения от одного до трех дней. Для со-маркировки, могут включать в себя не-кролика антитела, направленные на внутриклеточные эпитопов в этой инкубации, а также. Для этого параметра выставить эпитопов при необходимости и пронизывают и блокировать клетки до начала второй инкубации.
13. При использовании антител, направленных на внутриклеточные эпитопов антигенов, которые требуют извлечения из формальдегида фиксации, подвергать эпитопы путем кипячения 3 раза в 0,01 М мочевины, 10 секунд каждый раз, в микроволновой печи. Подождите 2 минуты между каждой отопления. Будьте очень осторожны, как кипящий раствор может заставить разделы из скважин. Если это произойдет, используйте кистьвыдвинуть секции из сторон ткани камере или с крышкой пластины обратно в нижней части соответствующей камеры ткани. Если антитела не требуют поиска антигена пропустить этот шаг.
14. При использовании антител, направленных на внутриклеточные эпитопов, до второй инкубации, permeabolize и блокировать клетки в срезах тканей с PBS-H, содержащие 0,3% тритона Х-100, а 2% нормальной козьей сывороткой в ​​течение одного часа. Затем выполните оставшиеся антитела инкубации в PBS-H, содержащие 0,3% тритона Х-100 и 2% нормальной козьей сывороткой.
15. После второй инкубации, мыть секций в PBS-H в течение 20 минут до нескольких часов. Повторите два раза в общей сложности три стирок. Выполните окончательное инкубации с соответствующими флуоресцентно меченых антител. К примеру, козий анти-кролик-Cy3 и антимышиного-Alexa 488 разбавленный 1:1000 каждый в блокировании решения. Инкубируйте в течение одного-трех дней. Держите разделы защищенном от света месте, обернув пластин в фольгу в течение этого инкубационного и в дальнейшем, как свет флуорофоров утоляет.
16. Вымойте секций в PBS-H в течение 20 минут до нескольких часов. Повторите два раза в общей сложности три стирок.
17. Для IST в сочетании с ISH после исправления разделов после исправления в 4% параформальдегида в течение 1 часа для обеспечения тетрамеров и антител в месте, затем смойте секций с PBS-H снова и монтировать.
18. Используйте кисть для передачи разделы предметное стекло. Пальто каждой секции с глицерином / желатин содержащие 4mg/ml н-пропил галлат или другие монтажные среды, содержащие консервант флуорофора и накройте покровным стеклом. Магазин слайдов в защищенном от света слайд таре при -20 °. Промыть пластины культуре ткани и удалить этикетки на крышки с алкоголем. Может повторного использования пластин.
19. Анализ окрашенных срезах ткани с конфокальной микроскопии. Затем можно перейти к ISH.

2. Обнаружение зараженных вирусом-РНК + клеток на месте гибридизации.

Это на месте протокол гибридизации был изменен из наших ранее опубликованных протоколов ^4,5 следующим образом:

1. Re-среза 5-8-микронной толщины-sectionss из толстого на месте срезах, окрашенных тетрамер.
   1. 200-микронной толщины сечения нагревают при 70 ° C в течение 5 минут, чтобы отделить участок от слайда.
   2. Секция не встроенных в октябре на сухом льду.
   3. 8-микронной разделы резать криостат из толстых секций и придерживались silanized слайдов.
   4. Слайды можно хранить при температуре -80 ° C в запечатанной коробке для последующей гибридизации на месте.
2. В гибридизация
   1. Увлажняет срезах тканей путем погружения слайда в течение 3 минут в каждом из 90% этанола и DEPC обработанной воды.
   2. Permeabilize срезах тканей путем нагревания в 10 мМ буфера цитрата (рН 6,0) при 98 ° С на водяной бане в течение 15 мин.
   3. Прохладный срезах тканей при комнатной температуре в течение 20-30 мин.
   4. Мыть два раза в DEPC обработанной воды в течение 3 мин.
   5. Acetylate срез ткани, погрузив слайдов в 0,25% уксусной кислоты в 0,1 М TEA (триэтаноламин, pH8.0) в течение 10 мин.
   6. Передача слайды в 0,1 М TEA (pH8.0) в течение 5 мин.
   7. Скрещиваться разделов до ³⁵ С-меченых вирус-специфических (таких, как ВИЧ-1, SIV) зонда антисмысловых или чувство (отрицательный контроль на ВИЧ-1, SIV), или ³⁵ S меченных LCMV riboprobes (складочном смысл и антисмысловых).
   8. Вымойте разделы дважды 2xSSC в течение 5 минут после гибридизации ночь на 42 ° C.
   9. Вымойте разделы STE (0,5 М NaCl, 1 мМ EDTA, 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5) в течение 5 мин.
   10. Дайджест секций с РНКазы и T1 в СТЭ при 37 ° С в течение 30 минут
   11. Вымойте секций в 2х SSC плюс 50% формамида в течение 5 мин.
   12. Вымойте разделы 1x SSC 10 мин.
   13. Вымойте секций в 0,5 х SSC 15 мин.
   14. Дегидрировать секций в 70, 80 и 100% этанола, содержащего 0,3 М ацетата аммония, каждые 5 мин.
   15. Пальто секций с ядерной эмульсии трек
   16. Сушить в темном помещении в течение 1 часа.
   17. Expose разделы при 4 ° С в течение 11 дней (ВИО) и 3 дня (LCMV).
   18. Разработка разделов в D19 (Kodak, Cat # 146 4593) в течение 3 мин, умойся в dH2O 30 секунд, исправить в Рапид-Fixer (Kodak, Cat # 146 4106) в течение 4 минут, умойся в dH2O 5 мин х 3 раза.
   19. Дегидрировать в 70%, 80% и абсолютного этилового спирта, 5 мин каждый.
   20. Горы слайды в люминесцентных совместимая среда Permount.

3. Приобретать конфокальной микроскопии изображений.

1. Захват изображения с ISTH Bio-Rad MRC 1000 конфокальной микроскопии, или любой другой конфокальной микроскопии с Epi2-Blue Отражение устройства.
2. Используйте Epi1-605 для красного тетрамера флуорохромом, Epi2-522 DF32 для зеленых CD8 флуорохромом и Epi2-Blue Отражение для зерен серебра (ISH сигнала в развитых автографов) на 20х (для SIV) или 60x (для LCMV)
3. Последовательно собирать Z-серийный изображений на 1-микронной интервалом в три канала для каждого поля.
4. Получение изображений со каждом разделе слевасправа, и сверху вниз, и имя каждого изображения в соответствии с ее строк и столбцов в файл Excel.
5. Захват каждого изображения с ~ 20% перекрытием с соседними изображения, чтобы избежать пробелов в реконструированных монтаж изображения.

4. Изображение анализы: монтаж реконструкции изображения, мобильный центр тяжести расчетов и пространственного анализа.

1. Проект Z-серийный изображений в одно изображение для каждого канала с конфокальной Assistant (версии 4.02.).
2. Автоматически объединять проецируемого изображения из трех каналов в одно изображение RGB, используя Photoshop 7.0 Действие процедуры.
3. Создание монтаж изображения прошиты объединены изображения вместе слоями в Photoshop 7.0.
4. Ассоциированный отдельных зерен серебра и тетрамер пятно с клетками, и назначить X, Y координаты центров (центров тяжести) из SIV РНК + и тетрамер + клеток, используя Метаморф (версия 7.1.3.) Или Photoshop (можно получить у автора)
5. Экспорт данных в центроида Excel файлов, цифровые номера для каждой ячейки. E: T отношения определяются из файлов Excel от общего числа тетрамер + и вирусной РНК + клеток в разделе.

Пространственные отношения между красным тетрамер + и синего SIV РНК + клетки собрать путем копирования и вставки их участков из Excel файлов в документ Photoshop. После уменьшения непрозрачности слоя для выравнивания и масштаба сетки так, что они совпадают, цвет-отбора и копирования и вставки в новый слой позиции синий РНК + клеток, а затем отбрасывая слой используется для выравнивания сетки, позиции из + тетрамера и вирусной РНК + клеток будут выявлены в сведенное изображение.

5. Дополнительные примечания

Если сокращение инфекционных ткани:

Работа в BSL2.5 лаборатории. Принимать особые меры предосторожности с бритвенными лезвиями. Положите бритву в лезвие vibratome крепление с щипцами. Если вы не можете положить лезвие в с щипцами, затем поместите его в перед добавлением ткани в баню, и не заменяют лезвия. После завершения резки, удаления лезвие с щипцами. Спрей лезвие с 70% этанола или DMQ перед удалением. Как всегда, распоряжаться лопастей в контейнере острых предметов. Изменение внешнего перчатки или промыть в дезинфицирующий после каждого контакта с тканью или загрязненных PBS в бак. Когда закончите, как при работе с инфекционным материалом, добавьте DMQ дезинфицирующие средства для PBS в баке и пусть сидят несколько минут до удаления. Утилизировать обеззаражены PBS в канализацию. Затем промыть резервуар с водой, чтобы удалить соль и дезинфицирующее средство. Чистая рабочее место и посуду с DMQ. Промыть посуду с водой.

Сделать из тетрамеров биотинилированного MHC мономеров:

Получить биотинилированного MHC класса I молекул, таких как HLA-A * 0201 / B ₂ м / пептидные молекулы, производимые с любой Gag (SLYNTVATL), Пол (ILKEPVHGV), или не имеют отношения МАРТ пептид (ELAGIGILTV) пептидов из Beckman Coulter. Биотинилированные HLA-A * 0301 / B ₂ м / пептидные молекулы, производимые с любой Gag (KIRLRPGGK) или NEF (QVPLRPMTYK) на NIAID объекта тетрамер. Тетрамеров создаются путем добавления 6 аликвоты FITC помечены ExtraAvidin (Sigma) в биотинилированного Маму * 01 / B ₂ м / пептид мономеров в течение 8 часов до окончательного молярном соотношении 4,5:1. Обоснованием добавив Extravidin медленно, что во время ранних моментов времени есть переизбыток мономера, который уверяет, что все Extravidin добавил получает все четыре биотин сайтов границы. Позже в реакции, этот процесс является менее эффективным, поскольку там меньше мономера левой и больше шансов, что ExtrAvidin не будет иметь всех 4 участках границы. Если добавить все ExtrAvidin сразу реакция была бы менее эффективным и более Extravidin молекул бы только 2 или 3 мономеров прилагается.

Обсуждение

Так как вирус РНК используется в качестве маркера для инфицированных вирусом клеток в настоящем докладе, все реагенты до гибридизации должно быть РНКазой бесплатно. На месте процедуру гибридизации описаны здесь был изменен, чтобы сохранить флуоресцентный сигнал на месте окрашиванием тетрамера. С радиоавтографического сигнал от зараженных вирусами-клетки обнаружены на месте гибридизация на глубине около одной ячейке диаметра, толстым слоем используются для окрашивания на месте тетрамер должны перекроить в 5-8-микронной толщины секций.

Этот новый метод объединения на месте тетрамеров и гибридизация (ISTH) описаны здесь позволяет одновременно визуализации, отображения и анализа пространственных отношений вирус-специфических CD8 + T-клеток и инфицированные вирусом клетки-мишени. Этот метод может быть применен для оценки CD8 + Т-клеток, основанных вакцины и в других, не вирус возбудителя и принимающих взаимодействий. Метод анализа изображений, описанные здесь также может быть адаптировано для изучения пространственных отношений любых двух клеточных популяций взаимодействующих на месте, например, мы недавно использовали центроида процедуры отображения в изучении ВИЧ-1 половым путем в приматах модели обезьяньего иммунодефицита вирусная инфекция макак-резус ⁶

Материалы