同時にウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染細胞を可視化するテクニックその場で</em

要約

その場テトラマー染色やin situハイブリダイゼーション（ISTH）で組み合わせる手法は可視化、マッピングおよび分析、そのウイルスに感染したターゲットへのウイルス特異的CD8 + T細胞の空間的な近接性の、及びこれらの免疫エフェクターと標的の間の量的関係を決定することが可能に感染の結果に。

要約

それらの感染細胞のターゲットの番号と場所への相対的な数字と場所のウイルス特異的CD8 + T細胞が隙間から慢性的な永続的な感染症の範囲という結果を決定する上で非常に重要であると考えられている。ここでは、ウイルス特異的CD8 + T細胞を検出するためにその場四量体（IST）染色とin situで結合した免疫エフェクター（E）ウイルス特異的CD8 + T細胞と感染のターゲット（T）の間の空間的および定量的な関係を評価するための方法を説明します。免疫防御と感染の間に戦いが行われる組織ではウイルス- RNA +細胞を検出するハイブリダイゼーション（ISH）。 T比：ISTの染色とISHの組み合わせ、簡略ISTHは、免疫エフェクター細胞とターゲット、およびEの安易な決定の位置の可視化とマッピングが可能になります。順番にこれらのパラメータは、空間的近接性、および初期の感染の転帰を予測する免疫応答のタイミングと大きさの関係を決定するために使用することができます。

プロトコル

このメソッドは、で報告された研究で使用されてLi ら、科学 323、1726〜1729（2009） 。

その場テトラマー染色やin situハイブリダイゼーション（ISTH）手続きの組み合わせ

ISTHの手順は4段階に分けることができます：1）組織中の抗原特異的CD8 + T細胞のISTの染色、2）ウイルス感染 - RNA +細胞を検出するISH、3）IST -染色された細胞の共焦点顕微鏡イメージングとウイルス- RNA +細胞、4）画像解析、画像のモンタージュの建設及び四量体+とウイルスRNA +細胞のマッピングを含む。

1。抗原特異的CD8 +組織切片におけるT細胞のISTの染色。

1. ビブラトームやメスを用いて200ええと厚の切片に新鮮な組織をカット。
2. チルビブラトームの滅菌PBS - Hが付いている浴室と0-2〜チル℃まではかなり急な27 °にビブラトームブレードの角度を設定します。可能な限り、組織の劣化を最小限にするために、氷上で冷やしておく。新鮮な組織はまた、それを冷やしているときにビブラトームを使用してセクションに簡単です。
3. 外科はさみまたは0.25センチの部分で小さく約0.5センチメートルワイドにメスで組織をカット。 〜40で、ボートや小さな皿とカバーの重量を量る° C溶融四パーセントPBSは、アガロースを溶かす低バッファに組織片を置く。組織は、皿の底に接触していることを確認してください。彼らが浮く場合組織片を押し下げ。氷の上で固める。これは通常3-5分かかります。
4. ロックタイトの接着剤でコーティングビブラトーム組織ブロック。鉗子を用いてメス、としているものと組織の周りカットアガロースは、慎重に接着剤でコーティングさビブラトームブロックに壊れやすいアガロース包埋組織を移す。それは組織のブロック上に設定されると、組織片を移動しないでください。氷上で約10分乾燥させます。
5. マウントの組織のビブラトームのブロックとデッドスロー前進速度と比較的高い振幅を使って200um厚の切片に組織を切る。速度と振幅の設定は、各ビブラトームによって異なります。ビブラトームが利用できない場合、または組織の切片ビブラトームに従順でない場合は、メスを用いて細い千切りに組織を切る。
6. 冷却したPBS - H 1 mlを入れた24ウェル組織培養プレートのウェルに設定されている組織チャンバーに絵筆を持つセクションを転送する。各組織のチャンバーに4つの組織切片に掲示。実験的なサンプル情報やゴムバンド付きプレートへの安全なフタ付きの組織培養プレートの蓋にラベルを付けます。
7. また、ビブラトームでうまくカットしていない組織のために、腸のように、メスまたはカミソリ刃で可能なストリップ限り薄くカットすることができます。メスカットのセクションでよくごとに1つのセクションを置く。
8. 終了最先端の組織の直後に染色に進みます。固定されるまで、すべての回で劣化を最小限に抑えるために冷却セクションを保管してください。セクションが乾燥させないでください。冷却した滅菌PBS - Hのセクションを保管してください。
9. は0.5 mg / mlのFITC結合テトラマーで一晩組織切片をインキュベートします。マウスまたはブロッキング溶液で1:200に希釈したこのインキュベーションの細胞外エピトープに向け非ウサギ抗体、例えば抗CD8抗体を含めることができます。このと後続のすべてのインキュベーションのために、ウェルあたり1 mlのソリューションを使用し、そしてこれと4で、後続のすべてのインキュベーション° Cロッキングプラットフォーム上でプレートとを実行します。後続の手順でソリューションの交差汚染を防ぐためによく空の少なくとも一つで区切られた別の実験試料を含む組織用チャンバーをしてください。
10. 主なインキュベーションの後、20分ごとに冷却したPBS - H倍（2X）を持つセクションを洗う。冷却したPBS - Hを含む別の24ウェル組織培養プレートに組織用チャンバーを転送することによりこれを行います。一つの実験サンプルから別に内容を滴下しないように注意して、組織用チャンバーを移動するとき。後続のすべてのインキュベーションおよび洗浄のために同様に適切なソリューションを含むクリーンなプレートに組織用チャンバーを転送する。セクションは、組織用チャンバーの側面に付着しないようにするための手順の間に組織用チャンバー内のセクションを監視します。
11. 新しいPBSと修正のセクションでは、室温で2時間4％パラホルムアルデヒドをバッファ。冷PBS - H 2X 5分ごとに洗浄する。
12. 1〜3日のためにブロッキング溶液に、10,000：ウサギ抗FITC抗体、例えばBiodesign1でインキュベートする。共同標識のため、同様にこのインキュベーションで細胞内エピトープに向け非ウサギ抗体を含めることができます。このオプションでは、必要に応じてエピトープを露出させ、前の2回目のインキュベーションの細胞に浸透してブロックする。
13. ホルムアルデヒド固定から抗原賦活化を必要とする細胞内エピトープに向けられた抗体を使用している場合は、電子レンジで、10秒、0.01M尿素で3回煮沸することにより、各時間のエピトープを公開。それぞれの加熱の間に2分間待ちます。沸騰溶液がウェルからセクションを強制的にできるので非常に注意してください。この問題が発生した場合は、ペイントブラシを使用してください適切な組織チャンバーの底に再び組織チャンバーの側面から、またはプレートの蓋からセクションをプッシュする。抗体は必要としない場合、抗原の検索は、この手順を省略します。
14. 前の2回目のインキュベーションに、細胞内エピトープに特異的な抗体を使用している場合は、PBS - Hが0.3％トリトンX - 100、および一時間の2％正常ヤギ血清を含むで組織切片でpermeabolizeとブロックの細胞。 、0.3％トリトンX - 100、2％正常ヤギ血清を含むPBS - Hの残り​​の抗体のインキュベーションを行います。
15. 2回目のインキュベーションの後、数時間〜20分間、PBS - Hでセクションを洗う。 3回の洗浄の合計のために二度繰り返します。適切な蛍光標識抗体との最後のインキュベーションを行います。例えば、ヤギの抗ウサギCy3およびヤギ抗マウス-アレクサ488ブロッキング溶液で1:1000それぞれを希釈。 1〜3日間インキュベートする。光消光蛍光団として、その後このインキュベーション中にスズ箔でプレートをラップし、することにより、光から保護されたセクションを保管してください。
16. 数時間〜20分間、PBS - Hでセクションを洗ってください。 3回の洗浄の合計のために二度繰り返します。
17. ISHポストフィックスのセクションの場所で安全な四量体と抗体の1時間、4％パラホルムアルデヒドでポストフィックスを組み合わせたISTの場合は、再度とマウントPBS - Hを持つセクションをすすいでください。
18. 顕微鏡スライドにセクションを転送するために絵筆を使用。グリセロール/ゼラチンを含む4mg/ml n -プロピル没食子酸やカバースリップで蛍光体の防腐剤とカバーを含むその他の固定メディアでコーティング各セクション。 -20℃での光保護スライドのコンテナに保管してスライド。組織培養プレートに洗い、アルコールで蓋にラベルを削除します。プレートを再利用することができます。
19. 共焦点顕微鏡で染色した組織切片を分析する。その後、ISHに進むことができます。

2。 in situハイブリダイゼーションによるウイルス感染- RNA +細胞を検出する。

in situハイブリダイゼーションプロトコルのこれは、次のように^4,5私たちの以前に発行されたプロトコルから変更されました。

1. 再カット5〜8ミクロンの厚sectionss現場テトラマー染色切片の厚さから。
   1. 200ミクロン厚の切片は、℃で5分間のスライドからセクションを分離するために70で加熱されています。
   2. セクションは、ドライアイス上で、OCTで埋め込まれています。
   3. 8ミクロンの切片厚の切片からクライオスタットで切断し、シラン処理したスライドに付着されています。
   4. スライドは、-80℃で保存できますin situハイブリダイゼーション、その後のために密封されたボックスにC。
2. in situハイブリダイゼーション
   1. 90％エタノール及びDEPC処理水に3分ごとにスライドを浸漬することにより、組織切片を再水和。
   2. ℃の水浴中で15分間98℃10mMのクエン酸緩衝液（pH6.0）中で加熱して組織切片を透過処理。
   3. 20〜30分間室温でクールな組織切片。
   4. 3分間のDEPC処理水で2回洗浄する。
   5. 10分間、0.1 M TEA（トリエタノールアミン、pH8.0）の0.25％無水酢酸にスライドを浸漬することにより組織切片をアセチル化する。
   6. 5分間0.1 MのTEA液（pH8.0）にスライドを移す。
   7. ³⁵ Sで標識したウイルス特異的（例えば、HIV - 1など、SIV）アンチセンスプローブまたはセンス（HIV - 1のネガティブコントロール、SIV）、または³⁵ S -標識LCMVのリボプローブ（プールされたセンスおよびアンチセンス）のセクションをハイブリダイズさせる。
   8. 42℃で一晩ハイブリダイゼーション後の5分℃で2xSSCで二回セクションを洗う
   9. 5分間のSTEのセクションを（0.5MのNaCl、1mMのEDTA、20mMトリス- HCL、pH7.5）で洗浄する。
   10. 37 RNaseにSTEのとT1とのセクションを消化℃で30分間
   11. 2 × SSCでのセクションに加えて5分間、50％ホルムアミドを洗ってください。
   12. 1 × SSCで10分間のセクションを洗ってください。
   13. 0.5 × SSCで15分間のセクションを洗ってください。
   14. 70のセクション、80と0.3 Mの酢酸アンモニウム、各5分を含む100％エタノールを脱水する。
   15. 核トラックのエマルジョンでコーティングのセクション
   16. 1時間暗い部屋で乾かしてください。
   17. 4でセクションを公開° C 11日目（SIV）と3日間（LCMV）のため。
   18. 3分間（コダック、猫＃146 4593）D19のセクションを開発、dH2O 30秒で洗って、4分間（コダック、猫＃146 4106）ラピッドフィクサーで修正、dH2O 5分× 3回洗浄する。
   19. 70％、80％と無水エタノール、5分ごとに水分を取り除く。
   20. 蛍光互換性のあるPermount媒体のマウントスライド。

3。共焦点顕微鏡像を取得する。

1. Bio - Rad社MRC 1000年共焦点顕微鏡、またはEpi2 -ブルー反射装置を持つ他の共焦点顕微鏡でISTH画像をキャプチャ。
2. 20倍（SIV）または60倍（LCMV用）で、赤四量体蛍光色素用Epi1 - 605、緑CD8蛍光色素用Epi2 - 522 DF32を使用し、銀粒子についてEpi2 -ブルーリフレクション（開発radioautographsのISHシグナル）
3. 順番に各フィールドの3つのチャンネルで1ミクロンの間隔でZ -シリアルの画像を収集する。
4. 左からの各セクションから画像を取得する右、および上から下へ、およびExcelファイルでその行や列に基づいて各画像に名前を付けます。
5. 再構成されたモンタージュ画像のギャップを避けるために、隣接画像との〜20％オーバーラップで各イメージをキャプチャします。

4。画像解析：モンタージュ画像再構成、細胞重心計算と空間分析。

1. プロジェクトZ -シリアル画像共焦点アシスタント（バージョン4.02）で、チャネルごとに単一のイメージに。
2. 自動的にPhotoshop 7.0のアクションの手順を使用して、1つのRGB画像に3つのチャンネルから投影されたイメージをマージする。
3. Photoshop 7.0でのレイヤーで一緒にマージされた画像をつなぎ合わせによるモンタージュ画像を生成する。
4. 准個々の銀粒子と四量体は、細胞と染色、およびMetaMorph（バージョン7.1.3）またはPhotoshopを（筆者から入手可能）を使用してX、SIV RNA +と四量体+セルの中心のY座標を（重心）、割り当てる
5. 各セルの数値の数字としてExcelファイルに重心データをエクスポートします。 E：T比がセクションの四量体の合計数字+およびウイルスRNA +細胞からのE​​xcelファイルから決定されています。

赤四量体+と青SIV RNAとの間の空間的関係は、+細胞は、PhotoshopのドキュメントにExcelファイルから、それぞれのプロットをコピーして貼り付けることによりキャプチャされます。彼らは色を選択すると青RNA +細胞の位置をコピーして新しいレイヤーにペーストする、一致するようにグリッドを調整し、スケーリングするレイヤーの不透明度を減少した後、次にグリッドを揃えるために使用される廃棄層、位置四量体の+とウイルスRNAの+細胞は、統合された画像で明らかにされます。

5。追加の注意事項

感染組織を切断する場合：

BSL2.5ラボで働く。カミソリの刃を持つ特別な予防策を講じる。鉗子でビブラトームブレードマウントにカミソリを置く。あなたが鉗子とでブレードを置くことができない場合は、お風呂に組織を追加する前にそれを入れ、刃を交換しないでください。終了したら切断する場合には、鉗子で刃を取り外します。除去前〜70％エタノールまたはDMQでスプレーブレード。いつものように、鋭利物容器のブレード処分する。外側の手袋を変更したり、組織またはタンク内の汚染されたPBSで各接触後に消毒剤ですすいでください。終了したら、感染性物質を扱う場合、タンク内にPBSにDMQの消毒剤を追加し、電源を切って数分放置します。どぶ除染PBS廃棄してください。その後、塩と消毒剤を除去する水でタンクを洗う。 DMQクリーンなワークスペースや調理器具。水で食器を洗います。

ビオチン化MHCモノマーから四量体を確認するには：

私はこのようなHLA - A * 0201 / B ₂としてベックマンコールター社からギャグ（SLYNTVATL）、ポル（ILKEPVHGV）、または無関係MARTペプチド（ELAGIGILTV）ペプチドのいずれかで生成されたM /ペプチド分子を分子ビオチン化MHCクラスを取得します。ビオチン化HLA - A * 0301 / B ₂ M /ペプチドNIAIDテトラマー施設でギャグ（KIRLRPGGK）またはネフ（QVPLRPMTYK）のいずれかで生成された分子。四量体は、FITC標識の6アリコートを添加することにより生成されるビオチン化麻木にExtraAvidin（シグマ）* 01 / B ₂ M / 4.5:1の最終的なモル比に8時間の経過とともにペプチドモノマー。ゆっくりExtravidinを追加する論理的根拠は、初期の時点の間に追加さExtravidinのすべてがバインドされているすべての4つのビオチンのサイトを取得することを保証する単量体の過剰があるということです。 ExtrAvidinがバインドされているすべての4カ所を持っていないことにチャンスの少ないモノマーと左よりあるので、後で反応で、このプロセスは非効率的です。 ExtrAvidinのすべてを一度に追加し​​た場合は反応が少なく、効率的でより多くのExtravidin分子が接続されている唯一の2つまたは3つのモノマーを持っているということです。

ディスカッション

ウイルスRNAは、本報告書におけるウイルス感染細胞のマーカーとして使用されているため、ハイブリダイゼーションの前にすべての試薬は、リボヌクレアーゼフリーでなければなりません。ここで説明したin situハイブリダイゼーションの手順でその場テトラマー染色での蛍光シグナルを維持するように変更されています。 in situハイブリダイゼーションによって検出されたウイルスに感染した細胞からradioautographic信号が約1セル径の深さにあるため、その場テトラマー染色のために使用される厚さのセクションでは5 - 8 -ミクロン厚の切片に改修さでなければならない。

その場四量体にし、in situハイブリダイゼーション（ISTH）の組み合わせのこの斬新な手法では、ウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染標的細胞の空間的関係の同時可視化、マッピングおよび分析を可能にするここで説明する。このメソッドは、CD8を評価するために+ T細胞をワクチンベースおよびその他の非ウイルスの病原体と宿主の相互作用に適用することができます。画像解析の手法も、その場で相互作用する任意の2つの細胞集団、例えば、の空間的な関係を研究するために適合させることができる我々は最近、サル免疫不全のヒト以外の霊長類モデルでのHIV - 1の性的感染を研究する上で重心のマッピングの手順を使用ここで説明アカゲザル⁶のウイルス感染

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