Una técnica para visualizar simultáneamente específica para el virus las células CD8 + T y células infectadas por virus In situ</em

Resumen

Una técnica que combina en la tinción de tetrámero situ e hibridación in situ (ISTH) permite la visualización, la cartografía y el análisis de la proximidad espacial de virus específicos de células T CD8 + a sus infectados por el virus objetivos y la determinación de las relaciones cuantitativas entre estos efectores inmunes y los objetivos a los resultados de la infección.

Resumen

El número y ubicación de virus específicos de células T CD8 + en relación con el número y la ubicación de sus objetivos de la célula infectada se cree que es fundamental para determinar los resultados que van desde la eliminación de las infecciones crónicas persistentes. Se describe aquí un método para evaluar las relaciones espaciales y cuantitativas entre efectoras inmunes (E) específica para el virus células T CD8 + y objetivos infectados (T), que combina in situ tetrámero (IST) de tinción para detectar el virus específico de células T CD8 + e in situ hibridación (ISH) para detectar ARN viral + células en los tejidos donde la batalla entre las defensas inmunes y la infección se lleva a cabo. La combinación de la tinción de IST e ISH, abreviado ISTH, permite la visualización y mapeo de la ubicación de las células efectoras inmunes y los objetivos y la determinación fácil del E: T ratios. Estos parámetros, a su vez puede ser utilizado para determinar las relaciones entre la proximidad espacial, y la oportunidad y la magnitud de la respuesta inmune que predicen los resultados en la infección temprana.

Protocolo

Este método se utilizó en la investigación publicada en Li et al., Science 323, 1726-1729 (2009) .

Combinado en la tinción de tetrámero situ e in situ hibridación (ISTH) procedimientos

Procedimientos ISTH se puede dividir en cuatro etapas: 1) IST tinción de antígenos específicos de células T CD8 + en los tejidos, 2) ISH para detectar infectados por el virus de ARN + en las células, y 3) la imagen confocal microscópico de IST células teñidas y viral de ARN + las células, y 4) el análisis de imágenes, incluyendo la construcción de montajes de imágenes y mapas de tetrámero + + y ARN del virus de las células.

1. IST tinción de antígenos específicos de células T CD8 + en secciones de tejido.

1. Cortar los tejidos frescos en 200 secciones um de espesor con un vibratome o un bisturí.
2. Frío baño vibratome con PBS estéril-H y el frío a 0-2 ° C. Ajuste el ángulo de la hoja vibratome a un lugar escarpado de 27 °. Siempre que sea posible, mantener los tejidos refrigerados en hielo con el fin de minimizar la degradación. Tejido fresco es más fácil a la sección con un vibratome cuando se enfría.
3. Cortar el tejido con unas tijeras o un bisturí quirúrgico en pequeños aproximadamente 0,5 cm de ancho por 0,25 cm de altura piezas. Reunir las piezas de tejido en un barco o un peso pequeño plato y cubrir con ~ 40 ° C derretida 4% PBS buffer de baja fusión de agarosa. Asegúrese de que el tejido está en contacto con el fondo del plato. Empuje las piezas de tejido por si flotan. Consolidar en el hielo. Esto suele tardar entre 3-5 minutos.
4. Escudo vibratome bloque de tejido con pegamento Loctite. Corte de agarosa alrededor del tejido con un bisturí, y luego con una pinza, transferir cuidadosamente el frágil tejido de agarosa incrustada en un bloque de vibratome recubiertos de goma. No mueva la pieza de tejido, una vez que se encuentra en el bloque de tejido. Deje secar unos 10 minutos en hielo.
5. Monte bloque de tejido en el vibratome y cortar el tejido en 200um de espesor con un muerto a baja velocidad hacia delante y amplitud relativamente alta. Los ajustes de velocidad y amplitud varían con cada vibratome. Si un vibratome no está disponible, o el tejido no es susceptible de vibratome corte, cortar los tejidos en tiras finas con un bisturí.
6. Transferencia de las secciones con un pincel en una cámara de tejido fijado en el pozo de una placa de tejido de 24 pocillos que contienen 1 ml de PBS frío-H. Poner un máximo de cuatro secciones de tejido en cada cámara de tejido. Etiqueta de la tapa de la placa de cultivo de tejidos con información de la muestra experimental y la tapa de seguridad a la placa con una goma elástica.
7. Por otra parte, para los tejidos que no se corte con vibratome, como intestino, puede cortar tiras finas como sea posible con bisturí o navaja. Ponga sólo una sección por cada bien para las secciones de corte de bisturí.
8. Proceder a las manchas inmediatamente después de terminados los tejidos de corte. Mantenga refrigerados secciones para minimizar la degradación en todo momento hasta que fija. No permita que las secciones se sequen. Mantener las secciones en frío PBS estéril-H.
9. Incubar las secciones de tejido durante la noche con 0,5 mg / ml tetrámeros conjugado FITC. Puede incluir el ratón o no anticuerpos de conejo dirigidos a epítopos extracelulares en la incubación, por ejemplo, anticuerpos anti-CD8, diluido 1:200 en solución de bloqueo. Use 1 ml de solución por tanto para esta y todas las incubaciones posteriores, y llevar a cabo esta y todas las incubaciones posteriores a 4 ° C con las placas en una plataforma de balanceo. Mantenga cámaras de tejido que contiene diferentes muestras experimentales separadas por al menos un pozo vacío para evitar la contaminación cruzada de las soluciones en los pasos posteriores.
10. Después de la incubación primaria, lávese las secciones con PBS frío-H dos veces (2X) durante 20 minutos cada uno. Para ello, la transferencia de las cámaras de tejido a otro de 24 y placa de cultivo de tejido que contiene PBS frío-H. Tenga cuidado de no derramar el contenido de una muestra experimental a otro, al mover cámaras de tejido. Para todas las incubaciones posteriores y se lava de manera similar la transferencia de las cámaras de tejido para un plato limpio, que contiene la solución adecuada. Monitor de las secciones en las cámaras de los tejidos durante el procedimiento para asegurarse de que las secciones no se tiene que quedar a los lados de las cámaras de los tejidos.
11. Secciones fijar con tampón PBS paraformaldehído al 4% durante 2 horas a temperatura ambiente. Lavar con PBS frío-H 2 veces 5 minutos cada uno.
12. Incubar con conejo anti-FITC anticuerpos, por ejemplo, Biodesign1: 10.000, en solución de bloqueo de uno a tres días. Para co-etiquetado, puede incluir el conejo anticuerpos dirigidos a epítopos intracelulares de esta incubación, así. Para esta opción, exponer epitopos si es necesario y penetrar y bloquear las células antes de la segunda incubación.
13. Si los anticuerpos dirigidos a epitopes utilizando intracelular que requiere la recuperación de antígenos de la fijación de formaldehído, exponer epitopos hirviendo 3 veces en urea 0,01 M, 10 segundos cada vez, en un horno de microondas. Esperar 2 minutos entre cada calentamiento. Tenga mucho cuidado como solución en ebullición puede obligar a las secciones de los pozos. Si esto ocurre, use un pincelpara impulsar las secciones de los lados de la cámara de tejido o de la tapa de la placa en la parte inferior de la cámara de tejido apropiado. Si los anticuerpos no requieren la recuperación de antígeno omita este paso.
14. Si el uso de anticuerpos dirigidos a epítopos intracelulares, antes de la segunda incubación, permeabolize y bloquear las células en cortes de tejido con PBS-H con 0,3% Triton X-100, y el 2% de suero normal de cabra durante una hora. A continuación, realice restantes incubaciones de anticuerpos en PBS-H que contiene 0,3% de Triton X-100 y 2% de suero normal de cabra.
15. Después de la segunda incubación, lavar las secciones en PBS-H por 20 minutos a varias horas. Repetir dos veces para un total de tres lavados. Realizar una incubación final con las correspondientes anticuerpos marcados con fluorescencia. Por ejemplo, cabra anti-conejo-Cy3 y de cabra anti-ratón Alexa 488 diluido 1:1000 en cada una de solución de bloqueo. Incubar durante uno a tres días. Mantener las secciones protegidas de la luz, envolviendo las placas en papel de aluminio durante la incubación y, posteriormente, como fluoróforos apaga la luz.
16. Lávese las secciones en PBS-H por 20 minutos a varias horas. Repetir dos veces para un total de tres lavados.
17. De IST en combinación con ISH fijar post-post-secciones fijar en paraformaldehído al 4% durante 1 hora para asegurar tetrámeros y los anticuerpos en el lugar, luego enjuague secciones con PBS-H de nuevo y de montaje.
18. Utilice una brocha para la transferencia de las secciones de un portaobjetos de microscopio. Cubra cada sección con glicerol / gelatina que contienen 4mg/ml n-propilo u otros medios de montaje que contiene un conservante fluoróforo y cubrir con un cubreobjetos. Diapositivas guardar en un recipiente de luz para diapositivas protegidos en -20 º. Enjuagar las placas de cultivo de tejidos y eliminar etiquetas en las tapas con alcohol. Puede volver a utilizar las placas.
19. Analizar las secciones de tejido teñidos con un microscopio confocal. A continuación, puede proceder a la ISH.

2. Detección de infectados por el virus de ARN + células por hibridación in situ.

Este protocolo de hibridación in situ fue modificada a partir de los protocolos previamente publicados ^4,5 de la siguiente manera:

1. Volver a cortar 5-8 micras de espesor-sectionss de espesor in situ secciones tetrámero de colores.
   1. De 200 micrones de espesor de las secciones se calienta a 70 ° C durante 5 minutos para separar la sección de la diapositiva.
   2. La sección se incrusta en octubre en hielo seco.
   3. De 8 micrones secciones se cortan con un criostato de las secciones de espesor y se adhiere a las diapositivas silanizada.
   4. Las diapositivas se pueden almacenar a -80 ° C en una caja sellada para su posterior hibridación in situ.
2. Hibridación in situ
   1. Rehidratar las secciones de tejido por inmersión portaobjetos durante 3 minutos cada uno en el 90% de etanol y agua tratada con DEPC.
   2. Permeabilizar las secciones de tejidos mediante el calentamiento en tampón citrato 10 mM (pH 6,0) a 98 ° C en un baño de agua durante 15 minutos.
   3. Secciones de tejido fresco a temperatura ambiente durante 20-30 min.
   4. Lavar dos veces en agua tratada con DEPC durante 3 min.
   5. Acetylate sección de tejido mediante la inmersión de diapositivas en el 0,25% de anhídrido acético en 0,1 M de TEA (trietanolamina, pH 8,0) durante 10 minutos.
   6. Transferencia se desliza dentro de TEA 0,1 M (pH 8,0) durante 5 min.
   7. Hibridar secciones de ^35-S etiquetados específicos del virus (como el VIH-1, SIV) de la sonda antisentido o sentido (control negativo para VIH-1, VIS), o el ^35-S etiquetados riboprobes LCMV (sentido común y antisentido).
   8. Lavar dos veces con secciones 2XSSC durante 5 minutos después de la hibridación noche a la mañana a 42 ° C.
   9. Lávese las secciones de ECE (0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5) durante 5 min.
   10. Recopilación de las secciones con RNasas A y T1 en ECE a 37 ° C durante 30 minutos
   11. Lávese las secciones en 2x SSC, más el 50% de formamida durante 5 min.
   12. Lávese las secciones en 1x SSC 10 min.
   13. Lávese las secciones en 0,5 x SSC 15 min.
   14. Deshidratar secciones 70, 80 y 100% de etanol que contiene 0,3 M de acetato de amonio, cada 5 min.
   15. Secciones capa de emulsión de trazas nucleares
   16. Seco en un cuarto oscuro durante 1 hora.
   17. Exponer las secciones a 4 ° C durante 11 días (SIV) y 3 días (LCM).
   18. Desarrollar las secciones de D19 (Kodak, Cat # 146 4593) durante 3 minutos, lavar en dH2O 30 segundos, fijar en fijador rápido (Kodak, Cat # 146 4106) durante 4 minutos, lavar en dH2O 5 min x 3 veces.
   19. Deshidratar en el 70%, 80% y etanol absoluto, a 5 minutos cada uno.
   20. Montaje se desliza en medio de fluorescentes Permount compatible.

3. Adquirir imágenes confocal microscopio.

1. Capturar imágenes con un microscopio ISTH Bio-Rad MRC 1000 confocal, o cualquier otro microscopio confocal con un dispositivo de reflexión Epi2-Blue.
2. Use Epi1-605 para el fluorocromo rojo tetrámero, Epi2 DF32-522 para el verde fluorocromo CD8, y la reflexión Epi2-azul para los granos de plata (la señal de ISH en el radioautographs desarrollados) a 20x (por SIV) o 60x (por LCMV)
3. Secuencialmente recoger Z-serie imágenes a intervalos de 1 micrón de los tres canales de cada campo.
4. Adquirir imágenes de cada sección, de izquierda aderecha y de arriba a abajo, y el nombre de cada imagen de acuerdo a su fila y columna en un archivo de Excel.
5. La captura de cada imagen con una superposición de alrededor del 20% con sus imágenes vecinos para evitar vacíos en la imagen reconstruida montaje.

4. Análisis de la imagen: la reconstrucción de imágenes montaje, cálculo de celda centroide y el análisis espacial.

1. Proyecto Z-serie imágenes en una sola imagen para cada canal con el Asistente de Confocal (versión 4.02)..
2. Automáticamente la imagen proyectada a partir de tres canales en una imagen RGB, mediante un procedimiento de acción de Photoshop 7.0.
3. Generar una imagen de montaje de costura imágenes se fusionaron en capas en Photoshop 7.0.
4. Asociado granos de plata individual y tetrámero mancha con las células, y asignar las coordenadas X, Y de los centros (centroides) de la SIV ARN + y las células tetrámero +, con MetaMorph (versión 7.1.3.) O Photoshop (disponible en el autor)
5. Exportar datos centroide en archivos de Excel como numéricos para cada celda. E: T ratios se determina a partir de los archivos de Excel a partir del número total de tetrámero + + y el ARN viral celdas de la sección.

Las relaciones espaciales entre el rojo y el azul tetrámero + SIV ARN + células son capturados por copiar y pegar sus respectivas parcelas de los archivos de Excel en un documento de Photoshop. Después de bajar la opacidad de una capa de ajuste y escala de las redes para que coincidan, color, seleccionar y copiar y pegar en una nueva capa de las posiciones de la nada ARN + en las células, y luego descartar la capa utilizada para alinear las rejillas, las posiciones del tetrámero + + y el ARN viral células se dará a conocer en la imagen acoplada.

5. Notas adicionales

Si el corte de tejidos infecciosos:

Trabajar en un laboratorio BSL2.5. Tome precauciones especiales con cuchillas de afeitar. Ponga la máquina de afeitar en la lámina vibratome montaje con una pinza. Si usted no puede poner la hoja con una pinza, luego lo puso en el tejido antes de añadir al baño, y no sustituir a la hoja. Al cortar termine, quite la hoja con una pinza. Rocíe la hoja con un 70% EtOH o DMQ antes de su retirada. Como siempre, a disponer de hojas en un recipiente de objetos punzantes. Cambiar los guantes externos o enjuague con desinfectante después de cada contacto con el tejido o contaminados PBS en el tanque. Cuando haya terminado, si se trabaja con material infeccioso, añadir desinfectante DMQ a PBS en el tanque y dejar reposar un par de minutos antes de retirar. Disponer de descontaminación PBS por el desagüe. Luego enjuague el tanque con agua para eliminar la sal y desinfectante. Espacio de trabajo limpio y los utensilios con DMQ. Enjuague los utensilios con agua.

Hacer tetrámeros de MHC biotinilado monómeros:

Obtener la clase I del MHC moléculas con biotina como HLA-A * 0201 / B ₂ m / moléculas de péptidos producidos, ya sea con la mordaza (SLYNTVATL), Pol (ILKEPVHGV), o irrelevante MART péptido (ELAGIGILTV) péptidos de Beckman Coulter. Biotinilado HLA-A * 0301 / B ₂ m / moléculas de péptidos producidos, ya sea con la mordaza (KIRLRPGGK) o NEF (QVPLRPMTYK) en las instalaciones de tetrámero NIAID. Tetrámeros se generan mediante la adición de seis alícuotas de marcado con FITC ExtraAvidin (Sigma) a la biotina Mamu A. * 01 / B ₂ m / monómeros de péptidos en el curso de 8 horas a una relación molar final de 4.5:1 El fundamento de la adición de la Extravidin lentamente es que durante los intervalos de tiempo temprano hay un exceso de monómero que asegura que todos los Extravidin se añade a los cuatro sitios de biotina unido. Más tarde, en la reacción, este proceso es menos eficiente porque hay menos monómero a la izquierda y más de una oportunidad que no se han Extravidin los 4 sitios vinculados. Si se añaden todos los Extravidin a la vez que la reacción sería menos eficiente y más moléculas de Extravidin tendría sólo 2 o 3 monómeros unidos.

Discusión

Puesto que el ARN del virus se utiliza como marcador para las células infectadas por el virus en este informe, todos los reactivos antes de la hibridación debe ser libre de ARNasa. El procedimiento de hibridación in situ descrito aquí ha sido modificado para preservar la señal fluorescente en la tinción de tetrámero situ. Ya que la señal radioautographic de infectados por el virus de las células detectadas por hibridación in situ está a una profundidad de alrededor de un celular de diámetro, las secciones de grueso que se utiliza para la tinción tetrámero situ tienen que ser recortados en 5-8 micras de espesor secciones.

Esta nueva técnica de combinar en tetrámeros situ e hibridación in situ (ISTH) se describe aquí permite la visualización simultánea, la cartografía y el análisis de la relación espacial de virus específicos de las células CD8 + T y las células infectadas por el virus de destino. Este método puede ser aplicado para evaluar la vacuna de células CD8 + T y basado en otros que no son virus patógenos y las interacciones huésped. El método de análisis de imagen se describe aquí también se puede adaptar para estudiar las relaciones espaciales de cualquier población de dos células que interactúan en situ, por ejemplo, recientemente hemos utilizado el procedimiento de asignación de centro de gravedad en el estudio del VIH-1 la transmisión sexual en el modelo de primate no humano de la inmunodeficiencia simia infección por el virus de macacos rhesus ⁶

Materiales