DNA - النظائر المستقرة جس (DNA - SIP)

Summary

DNA - النظائر مستقرة تحقق هو أسلوب زراعة مستقل لتحديد وتوصيف المجتمعات النشطة من الكائنات الحية الدقيقة التي هي قادرة على الاستفادة من ركائز محددة. استيعاب الركيزة المخصب في النظائر الثقيلة يؤدي إلى دمج ذرات المسمى في الكتلة الحيوية الميكروبية. الكثافة تنبيذ فائق التدرج يسترد الحمض النووي المسمى لتحاليل جزيئية المصب.

Abstract

DNA - النظائر مستقرة تحقق (DNA - SIP) هو أسلوب قوي للتعرف على الميكروبات النشطة التي ركائز استيعاب الكربون والمواد الغذائية ولا سيما في الكتلة الخلوية. على هذا النحو ، وقد تم زراعة هذه التقنية المستقلة منهجية هامة لإسناد وظيفة التمثيل الغذائي للمجتمعات التي تسكن مجموعة متنوعة واسعة من البيئات البرية والمائية. بعد حضانة عينة بيئية مستقرة ، مع النظائر المركبات المسمى ، يخضع لاستخراج الحمض النووي تنبيذ فائق التدرج الكثافة واللاحقة تجزيء متدرجة لفصل الأحماض النووية للكثافات مختلفة. باسترداد المسمى تنقية الحمض النووي من كلوريد السيزيوم ولا تحمل علامات الحمض النووي لالتوصيف الجزيئي لاحقة (مثل بصمات الأصابع ، ميكروأرس والمكتبات استنساخ ، metagenomics). إن الرب الفيديو هذا البروتوكول يوفر البصرية خطوة بخطوة تفسيرات للبروتوكول للتجزيء الكثافة تنبيذ فائق التدرج التدرج ، والانتعاش من الحمض النووي المسمى. البروتوكول يتضمن أيضا نموذج بيانات المسبار ويسلط الضوء على النصائح الهامة ويحذر التي يجب مراعاتها لضمان نجاح المسبار الحمض النووي التحليل.

Protocol

1. إعداد الكواشف

DNA - SIP يتطلب استخدام الكواشف التي ينبغي أن تكون معدة مسبقا من الإجراء الفعلي. يتم سرد كل الاتجاهات لإعداد كاشف في هذا القسم ويتم تعديلها من بروتوكول SIP السابق ^1.

1. السيزيوم كلوريد (CSCL) حل لإعداد التدرجات SIP -- إعداد حل 7،163 CSCL M تدريجيا عن طريق تذويب 603،0 غراما من CSCL في الماء المقطر منزوع الأيونات و(DDH ₂ O) إلى الحجم النهائي من 500 مل. كن حذرا لا تتجاوز 500 مل! والاحترار الحل قليلا مع التحريك يساعد على إذابة جميع CSCL. قسامة الحل النهائي في aliquots مختومة. في المختبر ، وهي ممارسة شائعة لتخزين إعداد 100 مل aliquots في 125 مل قارورة المصل ، والتي هي ثم تجعيد مختومة مع سدادات المطاط بوتيل. ويمكن تخزين aliquots مختومة إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة (20 درجة مئوية). الاختام تساعد على منع التبخر وCSCL "قشرة" التشكيل. تحديد كثافة المحلول قبل ثلاث نسخ وزنها 100 ميكرولتر aliquots ، أو باستخدام مقياس الإنكسار الرقمية (مثل رايشرت AR200) ​​التي تم معايرتها بعناية لحلول CSCL. معايرة مرة واحدة بنجاح ، AR200 رايشرت ثابت ويقدم قراءات دقيقة لعدة سنوات. في درجة حرارة الغرفة (20 درجة مئوية) ، والكثافة النهائية لهذا الحل عادة ما يتراوح 1،88-1،89 ^-1 مل ز. الكثافة يختلف قليلا في كل مرة يتم إعداد الأوراق المالية الجديدة.
2. محلول كلوريد السيزيوم لإعداد التدرجات مع بروميد إيثيديوم (EtBr) -- ضم 250 غرام من CSCL مع 250 مل من الماء المعقم DDH O _2. قسامة هذا الحل في قارورة المصل منفصلة التي تم تجعيد مختومة بأختام بوتيل المطاط كما هو موضح في 1.1.
3. التدرج العازلة -- ضم 50 مل من 1 M - تريس حمض الهيدروكلوريك ، 3.75 بوكل ز و 1 مل من EDTA M 0،5-400 مليلتر من الماء. حل بوكل ، ثم تضاف DDH ₂ O إلى 500 مل. فلتر تعقيم وتعقيم. الحل النهائي هو 0.1 م تريس ، 0.1 و 1 بوكل M EDTA ملم.
4. البولي ايثيلين جلايكول (PEG) حل -- إعداد حل الربط عن طريق تذويب 150 غ من مادة البولي ايثيلين جلايكول 6000 و 46.8 غرام من كلوريد الصوديوم في المياه المعقمة DDH O ₂ لإجمالي حجم 500 (PEG 30 ٪ ، 1.6 M كلوريد الصوديوم) مل. الأوتوكلاف.
   ملاحظة : هذا الحل إلى مرحلتين يفصل مع التعقيم. وتشمل بقضيب في زجاجة تعقيمها بحيث يمكن أن تكون الحل مختلطة بشكل صحيح عند حدوث ذلك.
5. TE العازلة -- تحضير محلول من 10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك (8.0 درجة الحموضة) و 1 ملي EDTA (8.0 درجة الحموضة) في المياه المعقمة DDH O ₂ ، وذلك باستخدام حلول الأسهم تعقيمها من 1 EDTA M - M تريس حمض الهيدروكلوريك (8.0 درجة الحموضة) و 0.5 ( 8.0 درجة الحموضة). تصفية وتعقيم الأوتوكلاف.
6. الايثانول 70 ٪ -- الجمع بين 350 مل من الايثانول عالية النقاء مع 150 مل من الماء المعقم DDH O _2.

2. حاضنات العينة واستخراج الحمض النووي

الحمض النووي للSIP حضانات ، وحضنت العينات عادة مع نظائر الكربون الثقيل ⁽¹³ C) الركيزة. وفترات الحضانة وشروط (مثل المواد الغذائية التكميلية ، والرطوبة ، الضوء) تختلف تبعا لنوع العينة التي حضنت وطبيعة الركيزة. وقد الحمض النووي SIP تجارب أجريت بنجاح باستخدام مجموعة متنوعة من مركبات الكربون واحدة ^2،3 متعددة مركبات الكربون ^4،5،6 ، وباستخدام النيتروجين أو الأكسجين المسمى ^{7،8 9.} ومع ذلك ، فإن العائق إلى استخدام ¹⁵ أو ¹⁸ N - O - مركبات المسمى هو فصل انخفض المادية للحامض النووي المسمى ، ويرجع ذلك أساسا إلى وجود عدد أقل من ذرات النيتروجين والأكسجين في الحمض النووي الريبي وبالنسبة لذرات الكربون.

A المراقبة الحرجة لتجارب الحمض النووي SIP هو الحضانة المنشأة متطابقة مع الركيزة (على سبيل المثال ¹² C) الأم. هذا الاحتضان يوفر المقارنة اللاحقة للتأكد من أن أي وضع العلامات واضحة للحمض النووي ليست قطعة أثرية من تنبيذ فائق أو اختلافات المحتوى G C + كثافة الحمض النووي في المساهمة في الفصل ^10. من المهم أيضا للحفاظ على المواد المجمدة عينة للمقارنة "خفيف" و "الثقيلة" الحمض النووي ، وقيمتها بما في ذلك السيطرة عدم الركيزة لتقييم التغيرات السكانية في جميع أنحاء خلفية حضانة SIP.

1. احتضان العينات البيئية في عوالم مصغرة تحتوي الركيزة المسمى (الشكل 1). في تجربتنا ، وجدنا أن الحد الأدنى للإدماج بين 500-500 μmol من الكربون C ¹³ جرام من العينة وسوف تكون مناسبة للعينات التي تحتوي على الكتلة الحيوية العالية مثل عينات التربة ^1. للعينات المائية التي تحتوي على أقل من الكتلة الحيوية التربة ، قد أدرجت 100-100 μmol من الكربون ¹³ C للتر الواحد تسفر عن كشف النظائر الثقيلة التوقيع ^1. كمية الكربون التعديل ، سوف نسبة الكربون في الكتلة الحيوية وأدرجت شرط إضافة المغذيات التكميلية لاستيعاب جميعها تعتمد على خصائص العينات التي تم تحليلها واستهدفت سrganisms المصالح. وهناك مجموعة واحدة من المبادئ التوجيهية حضانة العينة لا تكون قابلة للتطبيق بالنسبة لجميع العينات. الأهم من ذلك ، ينبغي تركيز الركيزة المستخدمة في الحضانة SIP يكون مثاليا أقرب وقت ممكن لتركيز واجه عادة في الموقع ؛ التحيز التجريبية قد يكون نتيجة لظروف ثقافة تخصيب ^10.
2. بعد حضانة مع عينة ركيزة مستقرة - النظائر المسمى ، واستخراج الحمض النووي من عوالم مصغرة باستخدام بروتوكول استخراج الدقيق (PCR أو صغيرة لادخال الاستنساخ) أو انحلال موثوق الأنزيمية للاستنساخ الوزن الجزيئي عالية (مثل إدراج metagenomics واسعة). شارك في استخراج الحمض النووي الريبي لا يؤثر عموما التحليل ، لذلك يمكن استخدام البروتوكولات التي تسفر RNA وكذلك الحمض النووي. سوف تنبيذ فائق من الحمض النووي المستخرج لا القص شظايا أقصر من أزواج كيلوبايت ~ 50 ^1.
3. تحديد الحمض النووي المستخرج قبل الإعداد للأنابيب تنبيذ فائق التدرج CSCL. تحديد الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي (مثل Nanodrop 2000) إذا كان البروتوكول استخراج الحمض النووي غلة فقط (مثال : العمود القائم على مجموعات). بدلا من ذلك ، كميا باستخدام agarose هلام الكهربائي.

3. إعداد حلول متدرجة لتنبيذ فائق

ويشمل هذا الإجراء بإضافة الحمض النووي لأنابيب نابذة فائقة السرعة. هناك أكثر من نوع واحد من الأنابيب والدوار حتى الدقيقة البروتوكول سوف تختلف وسوف تعتمد على تعليمات الشركة المصنعة. قالت فيه ان نوصي استخدام الدوار العمودي جيدا لضمان أقصى قدر ممكن من فصل الحمض النووي الخفيفة والثقيلة. نستخدم بيكمان كولتر VTI - 65.2 الدوار مع 16 بئرا لعقد Polyallomer QuickSeal 5.1 مل أنابيب والبروتوكول سيوفر خطوات واعتبارات لهذه الشروط.

1. باستخدام تركيزات الحمض النووي تحديدها في الخطوة 2.3 ، حساب حجم استخراج الحمض النووي المطلوب من ما هو مطلوب لتوفير 0.5 ميكروغرام -- 5 ميكروغرام من الحمض النووي في أنابيب نابذة فائقة السرعة.
2. الجمع بين الحمض النووي المستخرج (0.5 -- 5 ميكروغرام) مع مخزن التدرج (راجع الخطوة 1.3) و 4.8 مل من CSCL M 7،163 إلى إجمالي حجم مل 6 ~ في أنبوب 15 مل القابل للتصرف العقيمة. علما بأن كثافة المحلول CSCL يمكن أن تختلف حتى في نفس molarity (انظر الخطوة 1.1). ويمكن استخدام المعادلة التالية لتحديد حجم الاحتياطي من خليط / DNA التدرج المطلوب لتوليد نسبة الخلط المناسبة :
   
   وأضاف X حجم محلول المخزون CSCL X 1.52 -- حجم الانحدار حل العازلة والحمض النووي (مل) = (الكثافة النهائية المرجوة CSCL كثافة محلول المخزون)
   
   تحديد حجم المخزون حل CSCL في 4.80 مل. ينبغي أن تكون الكثافة النهائية المرجوة 1.725 مل ز ^-1. تم تحديد كثافة محلول المخزون في الخطوة 1.1.
   
   نلاحظ أيضا أن كميات النسبية للCSCL والتدرج العازلة / الحمض النووي سيؤدي إلى زيادة حجم مجتمعة من 5.1 مل. وتستعد وحدات التخزين أكبر من حجم القدرة القصوى للأنابيب نابذة فائقة السرعة (أكثر من 5.1 مل) ضمان عدم وجود حل ما يكفي لملء الأنبوب تماما.
3. مزيج من قبل 10 مرات عكس. الحمض النووي هو مستقر في درجة حرارة الغرفة في CSCL.

4. إنشاء التدرج EtBr التحكم (اختياري)

لأن EtBr هو صبغ الإقحام أن المجمعات مع الحمض النووي مما يجعلها مرئية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، والتدرجات التحكم التي تحتوي على EtBr هي مفيدة لأنها توفر تأكيد فوري للتشكيل البصري قبل التدرج تجزيء عينة من أنابيب (مثل الشكل 1). إدراج أنبوب التحكم التي تحتوي على EtBr وخليط من كل من DNA - C ¹² و ¹³ من طراز C - DNA (أو ¹⁴ N - DNA و ¹⁵ N - DNA) تتيح لرؤية الفوري لتشكيل الفرقة داخل الأنابيب عند الانتهاء من تنبيذ فائق. هذا مهم لأن وجود تمزق الأنبوب خلال تنبيذ فائق أو ظروف تشغيل مبرمجة بشكل غير صحيح يمكن أن يؤدي إلى فشل في تكوين التدرج. منضمة إلى الحمض النووي ، ويقلل من كثافة EtBr من الحمض النووي ونتيجة لذلك ، يتبع بروتوكول مختلفة لإعداد التدرجات. علما أنه يمكن استخدام غيرها من البقع الحمض النووي بدلا من ¹¹ EtBr لكن البروتوكول يتطلب التحسين مع fluorophores الأخرى.

1. التدرج المكافحة تتطلب مجلدين من الحمض النووي الجيني : واحد يسمى كاملا مع النظائر مستقرة واحد من دون تسمية. نستخدم عادة إما Sinorhizobium meliloti مثقف في وسائل الإعلام التي تحتوي على ¹³ أو ¹² C - C - الجلوكوز كمصدر وحيد للكربون ، أو سلالة الحمام Methylococcus الممحفظة مثقف في وجود ¹³ أو ¹² C - C - الميثان وضوابط لدينا.
2. الجمع بين 5 -10 ميكروغرام كمية من كلا من C - ¹² و ¹³ الحمض النووي DNA مع C - الاحتياطي التدرج إلى الحجم النهائي من 1.00 مل في أنبوب المتاح المسمار الحد الأقصى 15 مل.
3. إضافة 1،00 غرام من CSCL الصلبة في أنبوب واحد. مزيج بواسطة انقلاب.
4. إضافة 110 ميكرولترمن 10 مجم مل حل EtBr ^-1 و 4.3 مل من محلول 1 ز ^-1 مل CSCL الأسهم إلى الحد الأقصى للأنبوب المسمار نفسها المستخدمة في الخطوة 4.2. فإن الكثافة النهائية من الحل التقريبي الذي من الحل الأسهم CSCL الأصلي.
5. وأيضا "على بياض" حل إضافية تتضمن السيطرة EtBr تكون هناك حاجة لموازنة حل بإنشائه في الخطوة 4.4. الجمع بين 1.00 مل من الاحتياطي متدرجة ، 1،00 غرام من CSCL ، 110 ميكرولتر من 10 ملغ مل حل EtBr ^-1 و 4.3 مل من محلول 1 ز ^-1 مل الأسهم CSCL منفصلة في أنبوب 15 مل المسمار الحد الأقصى وتخلط بواسطة انقلاب.

5. تنبيذ فائق

1. استخدام لمبة وماصة باستور ، وملء بعناية أنابيب نابذة فائقة السرعة مع حلول متدرجة أعد في خطوة 3.2 (4.4 أو الخطوات إذا إعداد التدرج السيطرة EtBr). إضافة بعناية حلول للأنابيب باستخدام ماصة باستور. تسمية أنابيب على الكتف أنبوب مع علامة دائمة الغرامة. تنبيه : تأكد من أن يتم تعبئة أنابيب تماما مع قاعدة العنق الأنبوب. أنابيب مليئة كاف من المحتمل أن تنفجر خلال تنبيذ فائق.
2. عندما يتم شغل كل من أنابيب المطلوبة مع حلول العينة ، سجل الشامل الدقيق لكل أنبوب. أنابيب الزوج والتوازن لهم داخل 00-10 ملغ. للموازنة ، والعثور على أزواج متماثلة تقريبا ، وإضافة أو إزالة كميات دقيقة حتى يتم حل متوازن ، والحفاظ على مستوى حل أقرب إلى قاعدة رقاب أنبوب ممكن. علما بأن لوزن الأنابيب ، ونحن نستخدم مقلوب 15 مل المسمار غطاء الأنبوب الذي تم قطع نصف حامل أنبوب للتوازن.
3. ختم الأنابيب باستخدام "أنبوب ممتاز" وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
4. تأكد من أن يتم ختم الأنابيب بشكل صحيح عن طريق عكس الضغط عليهم ومعتدلة. وزن الأنابيب مرة أخرى للتأكد من أنها لا تزال قادرة على تحقيق التوازن بعد تسرب الى داخل 00-10 ملغ.
5. التحقق من كل جانب الدوار بعناية للتأكد من أن الآبار نظيفة وخالية من الحطام أو الغبار الذي قد ثقب الأنابيب أثناء تنبيذ فائق.
6. إدراج هذه الانابيب بداخل الدوار مع أزواج متوازنة عكس بعضها البعض. سجل موقع الدوار من كل عينة لأن عملية تنبيذ فائق يمكن أن يؤدي إلى تلف أو تسميات علامة تمحى. ختم بعناية الآبار الدوار كما هو مبين من قبل الشركة المصنعة.
7. تحميل الدوار في نابذة فائقة السرعة. إغلاق الباب نابذة فائقة السرعة وتطبيق فراغ. إذا باستخدام 65.2 VTI الدوار ، تعيين سرعة دوران إلى 44100 دورة في الدقيقة (~ 177000 XG _AV) ، ودرجة الحرارة عند 20 درجة مئوية ، وتنبيذ فائق الوقت ل36-40 ساعة. حدد فراغ ، والتسارع الأقصى ، وإيقاف الفرامل (لا يضمن التدرج تعطلت بسبب التباطؤ). علما أن إيقاف الفرامل سيضيف مبلغا إضافيا إلى 1-2 ساعات وقت التشغيل. نلاحظ أيضا أن أقصر الأوقات تشغيل قد لا تحقق ما يكفي من قرار الفرقة. ينصح يدير تنبيذ فائق طويلة ، لأنها تؤدي إلى مزيد من قرار متميزة العصابات الحمض النووي.
8. فور الانتهاء من إجراء تنبيذ فائق ، إزالة الدوار بعناية. تجنب أي إمالة أو الاهتزاز من الدوار ، وإزالة أنابيب بلطف من الدوار لتجنب تعكير التدرجات داخل الأنابيب. في الحالات النادرة ، وسوف تنفجر خلال أنبوب للتشغيل. إذا كان الأمر كذلك ، فإن هناك فرصة أن التدرجات في أنابيب أخرى لا تشكل بشكل صحيح. إذا تم تضمين الانحدار السيطرة ، والتحقق من هذا الأنبوب بعناية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتأكيد تشكيل التدرج. إذا لم تدرج بشكل صحيح في شكل أنبوب السيطرة ، فمن الأفضل أن نكرر كل خطوة 5. لاحظ أنه قد يتم تخزين أنبوب EtBr تحكم سيطرتها وفارغة في الظلام وإعادة استخدامها لمدة تصل إلى ستة أشهر. الحرص على تنظيف الدوار بعناية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة مرة واحدة تمت إزالة أنبوب تنفجر. لا تستخدم فرشاة معدنية أو عمال النظافة لتنظيف الآبار جلخ الدوار من أجل تجنب الخدوش على الآبار الدوار! ويمكن شراء الدوار محددة الفرش ومحلول التنظيف من بيكمان.

6. التدرج تقطير

هناك نوعان من الأساليب التي تستخدم حاليا لاستعادة الحمض النووي من الأنابيب نابذة فائقة السرعة : تجزئة واستخراج الإبرة. ووصف هذا البروتوكول فقط عملية استخراج الحمض النووي باستخدام تقنية تجزيء. وذلك لأن معظم لتجارب SIP ، الحمض النووي المسمى لا يمكن تصور مع EtBr ويجب بدلا من ذلك يتم الكشف عن طريق مقارنة الكسور الخفيفة والثقيلة ما يعادلها من أنابيب العينات متعددة. ينصح بشدة مضخة محقنة لاسترداد كسور متساوية التدرج الكثافة من أنابيب نابذة فائقة السرعة. نستخدم نموذج BSP مضخة التسريب (برينتري العلمية المحدودة). ويمكن أيضا مضخة منخفضة تدفق تمعجية أو مضخة HPLC استخدامها.

1. ملء 60 مل العقيمة المحاقن المعقمة مع DDH ₂ O تحتوي على ما يكفي من صبغة زرقاء bromophenol لتوفير اللون الأزرق الداكن. مكان الحقنة على ذراع التحميل في ضخ حقنة. نعلق أنبوب مضخة مزودة إبرة عيار 23 "(1) وتشغيل المضخة حتى بعض DDH ₂ O قد حان حتى نهاية مذكرة الإبرة. أن أي فقاعات هواء في هذا العرض DDH O ₂ سوف تؤثر سلبا على عملية التجزيء.
2. الإصلاح واحد من أنابيب تنبيذ فائق الى وقفة المشبك. تأكد من أن المشبك ضيق بما فيه الكفاية لمنع أنبوب من النازحين ولكن لا يجري مثل هذا الضغط على الانبوب سيؤدي الافراج عن حل CSCL عندما اخترقت الأنبوب. ثقب في أسفل جدا من الأنبوب على طول خط التماس أنبوب باستخدام مقياس الطازجة 23 1 "إبرة. للحصول على أفضل النتائج ، يخترق الأنبوب في الطريقة التي تسيطر عليها ، وسريعة ، وثقة ، وهذا من الصعب جدا القيام بعمل جيد ، وممارسة عدة مرات قبل وحاولت في البداية مع هذا أنابيب العينات.
3. لكل عينة ، وإعداد 12 العقيمة microcentrifuge 1.5 مل أنابيب مع تسميات تشير إلى عدد العينات ونسبة (1-12 ؛ الثقيلة للضوء). باستخدام إبرة تعلق على أنابيب ضخ (الخطوة 6.1) ، يخترق الجزء العلوي من أنبوب على أنبوب الكتف العلوي ، على طول خط التماس. جمع حل التدرج باستخدام أنابيب microcentrifuge. كما أجريت لأسفل الأنبوب ، يخترق الأنبوب بطريقة سريعة والسيطرة عليها. الممارسة مسبقا ونكون حذرين للغاية لاستخدام تسيطر عليها حركة سحب للحيلولة دون تمرير إبرة القسري من خلال أنبوب والى الاصبع! معدل استخدام مضخة معايرة في وقت سابق ان تسفر 12 × 425 ميكرولتر كسور في 12 دقيقة (425 دقيقة ميكرولتر ^-1).
4. استخدام الإنكسار الرقمية (مثل رايشرت AR200 ؛ مستحسن) أو وجود رصيد التحليلية لفحص كثافة من كسور التدرج السليم لتأكيد تشكيل التدرج. وسوف تحتاج إلى استخدام ~ 50 ميكرولتر من العينة لهذا الاختبار. نحن غالبا ما تشمل الحمض النووي محض الثقافة في أنبوب واحد (كما هو موضح لإعداد التدرجات السيطرة EtBr) ليكون بمثابة الرقابة على تجزيء واستخدام ذلك لتحديد الكثافة. ويتوقع أن تتراوح كثافة من ~ 1،690-1،760 ^-1 مل غرام ، مع كثافة وسيطة من ~ 1.725 مل ز ^-1.

7. الحمض النووي الأمطار

1. الحمض النووي يعجل من جميع الكسور بإضافة أول 20 ميكروغرام من بولي أكريلاميد خطية كحامل لهطول الأمطار. مزيج بواسطة انقلاب. إضافة 2 مجلدات من حل PEG (راجع الخطوة 1) وتخلط بواسطة انقلاب. وينبغي أن تستخدم لاحظ أن حاملة لهطول الأمطار (مثل الجليكوجين أو بولي أكريلاميد الخطي) هو أمر حاسم لاستعادة كمية من الحمض النووي من الفصائل الانحدار ، ولكن الحذر إذا تم استخدام الجليكوجين كحامل لهطول الأمطار لهذا البروتوكول. وقد تبين أن التحضيرات لالجليكوجين تكون ملوثة الحمض النووي والتلوث الجرثومي يمكن بسهولة الخلط بين التفسير الكسور التدرج SIP ^12.
2. ترك أنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة للسماح لترسيب الحمض النووي. إذا رغبت في ذلك ، يمكن ترك أنابيب بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
3. ز الطرد المركزي في 13000 لمدة 30 دقيقة مع الجزء الخلفي من الأنابيب التي تواجه الخارج عن اتجاه ثابت في الأنبوب الدوار. نضح بعناية وتجاهل طاف. وينبغي أن يكون بيليه تكون مرئية ولكن يمكن أن يكون من الصعب جدا أن نرى في هذه المرحلة. العمل تحت مصدر الضوء الساطع (مثل مصباح مكتبي) للمساعدة في وضع الرؤية وبيليه.
4. غسل بيليه مع 500 ميكرولتر من الايثانول 70 ٪. ز الطرد المركزي في 13000 لمدة 10 دقيقة. نضح بعناية وتجاهل طاف. سيكون بيليه وعادة ما تكون أكثر وضوحا لهذه الخطوة ، ولكن سوف تنأى عن جدار الأنبوب بسهولة أكبر.
5. السماح لبيليه لتجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
6. تعليق كل بيليه في 50 ميكرولتر من العازلة TE (انظر الخطوة 1.5). تشغيل 5 ميكرولتر من كل جزء على agarose هلام وفقا لبروتوكولات المختبر القياسية.

8. جزء توصيف

والطريقة المستخدمة لتوصيف الكسور التدرج لتقييم نجاح أي حضانة SIP تختلف تبعا لتوافر المختبرات والمعدات. باستخدام طريقة أخذ البصمات لاستهداف الجينات 16S الرنا الريباسي هو النهج والأساليب المشتركة مثل تقييد تعدد الأشكال المحطة جزء طول (T - RFLP) ، أو تغيير طبيعة التدرج الكهربائي للهلام (DGGE) مناسبة (الشكل 1). بعد بروتوكول المبينة أعلاه ، نتوقع أن تكون مرتبطة الحمض النووي الضوء لتكون مرتبطة مع الكسور 9-11 (~ 1،705-1،720 مل ز ^-1) وبصمات الحمض النووي داخل الكسور الثقيلة 5-8 (~ 1،720-1،735 مل ز ^-1 ). بصمات فريدة المرتبطة الكسور 5-8 من النظائر مستقرة ، حضنت العينات ، ولكن ليس مع السكان الأصليين ، الركيزة ضوابط المحتضنة يقدم أدلة قوية تربط بين الكائنات الحية محددة مع استقلاب الركيزة المسمى معين. وإن كانت غير كافية الحمض النووي المسمى يبقى لبعض التطبيقات (التهجين ، metagenomics) ، قد يتم استخدام عدة التضخيم التشريد لإنتاج كميات أكبر ^13-15 ولكن هذا الوهم يمكن إدخال الحمض النووي في تضخيم ^14،16.

"jove_title"> 9. النتائج

سوف نموذجية الحمض النووي SIP النتائج تبرهن على فصل الحامض النووي لا تحمل علامات وصفت في الانحدار التي شكلتها تنبيذ فائق. مثالي ، لن يتحقق حل كامل للمواد عالية الوزن الجزيئي وراثية (مثل C ¹³ ، ¹⁵ N) من مواد لا تحمل علامات. يمكن شهد القرار بصريا من خلال مراقبة تشكيل الفرقة في أنابيب EtBr السيطرة. ويمكن أيضا أن تركيزات من الحمض النووي الجينومي استرجاع الواردة في الكسور التدرج الفردية يمكن استخدامها لتأكيد السليم تشكيل التدرج.

لهذا البروتوكول ، ونحن وتشمل النتائج ممثل تنبيذ فائق التدرج تنفيذها باستخدام الحمض النووي من ثقافتين النقي (الشكل 2). التدرج مجزأة تضمين هنا أعدت باستخدام الحمض النووي المستخرج من الجينومية س. meliloti (ATCC 1021) ، و ¹³ C - المسمى م. الممحفظة شارع. الحمام. تنبيذ فائق التالية ، تجزيء والحمض النووي الانتعاش ، والمسمى لا تحمل علامات الحمض النووي الجيني منفصلة في أجزاء منها مع التدرج كثافات مختلفة (الشكل 2A). ويمكن ملاحظة النظائر الثقيلة في الحمض النووي المسمى الكسور 4-5 ، في حين تم العثور على الحامض النووي لا تحمل علامات بتركيزات عالية في الكسور 9-10. اتسمت الحمض النووي من كل جزء مع تغيير طبيعة التدرج الكهربائي للهلام ⁽¹⁷⁾ ومنتجات PCR - تضخيم المتولدة المنفصلة الأنماط المقابلة لربط الكائنات المشمولتين في الانحدار (الشكل 2B). وتراوح كثافة من كسور ~ 1،580-1،759 مل ز ^-1 ، وتظهر أنهم من أجل تقليل كثافة من اليسار إلى اليمين.

على الرغم من أن الفصل ¹³ نقية و ¹² C - C - الحمض النووي يمكن أن تكون وضوحا (الشكل 2) ، قد حضانات عينة بيئية يكون من الصعب تفسيرها. على سبيل المثال ، فإننا المحتضنة التندرا التربة من خليج حازمة (نونافوت ، كندا) إما مع الجلوكوز C - C - ¹² المسمى أو ¹³ لمدة 14 يوما حتى 15 درجة مئوية. أظهرت المواد الهلامية agarose أيرزمري التدرج الحمض النووي التي تم كسر 'طخت" الحمض النووي الجيني عبر كسور 70-10 لكلا ¹² و ¹³ من طراز C - C - حضانات (الشكل 3A و3C ، على التوالي). في هذه الحالة ، لا يمكن إلا ¹³ C - تخصيب الكتلة الحيوية من الأنواع الجرثومية معينة يتم تحديدها مع نهج مثل DGGE الجينات الرنا الريباسي 16S. ¹² C - DNA الجلوكوز التربة المحتضنة يولد أنماط متشابهة في جميع أجزاء الانحدار (الشكل 3B) ، ولكن C - ¹³ عينة الجلوكوز المحتضنة ولدت بصمات DGGE التي ترتبط بشكل فريد مع الكسور 5-8 (الشكل 3D). ذات أهمية خاصة هي عصابات الحفظ المشار إليها بواسطة الأسهم. هذا المهيمنة 'phylotype' متناسقة عبر جميع أجزاء متدرجة ولكن التحولات في الحمض النووي لأثقل الكسور التي تم الحصول عليها من التربة C - ¹³ المحتضنة الجلوكوز. والحمض النووي لاحقة تتابع هذه الفرقة و / أو استنساخ التحليل مكتبة التأكد من هوية هذا الجين وبخاصة الرنا الريباسي 16S دليل metagenomic لاحقة أو زراعة المستندة إلى النهج.

الشكل 1. الخطوط العريضة للتجربة الحمض النووي SIP تشمل عينة الحضانة ، واستخراج الحمض النووي ، CSCL تنبيذ فائق التدرج الكثافة وتوصيف الحمض النووي مع التقنيات الجزيئية.

الشكل 2. النتائج المتوقعة لتجزيء التدرج SIP بما في ذلك الحمض النووي من ثقافتين النقي. (أ) تم تشغيل Aliquots من الحمض النووي من الكسور الانحدار 1-12 على agarose هلام 1 ٪ من الانحدار التي تحتوي على ¹³ C - المسمى م. الممحفظة حمام سلالة (الكسور 4-6) و ¹² C - المسمى س. meliloti (الكسور 8-10). يتم تضمين سلم 1 - KB للمقارنة (B) PCR - تضخيم الحمض النووي من نفس الكسور وتعمل على جل DGGE 10 ٪. أنماط البصمات تكشف اختلافات واضحة بين 5 و 9 كسور ، على سبيل المثال.

الشكل 3. النتائج المتوقعة لfractionations التدرج SIP من حضانات عينة التربة. وAliquots الكسور التدرج من كل من التربة C - ¹² المعدلة الجلوكوز (A) و ¹³ C - الجلوكوز التربة المعدلة (C) تعمل على 1 ٪ agarose المواد الهلامية ويضم سلم 1 - KB للمقارنة. وتظهر بصمات DGGE المقابلة لكل من هذه العينات في الفقرة (ب) و (D) أخذ البصمات من الكسور يكشف تخصيب الأصناف البكتيرية سيما في عينة C - ¹³ المعدلة الجلوكوز في الكسور 5-8 (D).

Discussion

التصميم السليم للنظائر مستقرة ، يحقق التجارب ذات أهمية حاسمة للحصول على الحمض النووي المسمى أعلاه المجتمع الخلفية لا تحمل علامات. وقد نوقشت الاعتبارات المتصلة عينة مرات الحضانة ، وتركيزات الركيزة ، وشروط الحضانة (المواد الغذائية على سبيل المثال ، رطوبة التربة) ، عب?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bromophenol Blue	Reagent	Fisher Scientific	BP115-25
Cesium chloride	Reagent	Fisher Scientific	BP210-500
Ethanol, reagent grade	Reagent	Sigma-Aldrich	652261
Ethidium bromide	Reagent	Sigma-Aldrich	E1510
Hydrochloric acid	Reagent	Fisher Scientific	351285212
Linear polyacrylamide	Reagent	Applichem	A6587
Polyethylene Glycol 6000	Reagent	VWR international	CAPX1286L-4
Potassium Chloride	Reagent	Fisher Scientific	AC42409-0010
Sodium Chloride	Reagent	Fisher Scientific	S2711
Sodium Hydroxide pellets	Reagent	Fisher Scientific	S3181
Tris base	Reagent	Fisher Scientific	BP1521
Dark Reader	Equipment	Clare Chemical	DR46B
Microcentrifuge	Equipment	Eppendorf	5424 000.410
Nanodrop 2000	Equipment	Fisher Scientific	361013650
Infusion pump	Equipment	Braintree Scientific, Inc.	N/A	Model Number: BSP See www.braintreesci.com for ordering details.
Tube sealer	Equipment	Beckman Coulter Inc.	358312
Ultracentrifuge	Equipment	Beckman Coulter Inc.
Ultracentrifuge rotor	Equipment	Beckman Coulter Inc.	362754
Ultraviolet light source	Equipment	UVP Inc.	95-0017-09	Any UV source will suffice
Ultraviolet light face shield	Equipment	Fisher Scientific	114051C
Butyl rubber stoppers, gray	Material	Sigma-Aldrich	27232
Centrifuge tubes	Material	Beckman Coulter Inc.	342412
Hypodermic needle, 23 gauge, 2” length	Material	BD Biosciences	305145
Microfuge tubes, 1.5 mL	Material	DiaMed	AD151-N500
Open center seals, 20 mm diameter	Material	Sigma-Aldrich	27230-U
Pasteur pipettes, glass	Material	Fisher Scientific	13-678-6C
Pipet tips	Material	DiaMed	BPS340-1000	Catalogue number is for 200 μl tips. 10 or 20 μl tips may be purchased from the same source
Pump tubing 1.5 mm bore x 1.5 mm wall	Material	Appleton Woods
Screw-cap tubes, 15 mL	Material	DiaMed	AD15MLP-S
Serum vials, 125 mL volume	Material	Sigma-Aldrich	Z114014
Syringe, 60 mL	Material	BD Biosciences	309653