تقييم وظيفة القلب وعلم الطاقة في قلوب معزولة عن طريق الماوس 31 P الرنين المغناطيسي الطيفي

Summary

Langendorff وضع التروية القلبية معزولة ، بالاشتراك مع ³¹ P الرنين المغناطيسي الطيفي ، يجمع بين مجالات الكيمياء الحيوية وعلم وظائف الأعضاء في تجربة واحدة. ويسمح البروتوكول لقياس ديناميكية عالية الطاقة محتوى الفوسفات ودوران في القلب في حين رصد في الوقت نفسه وظيفة فيزيولوجية. عندما يقوم بشكل صحيح ، وهذا هو أسلوب قيمة في تقييم علم الطاقة القلبية.

Abstract

فقد أصبحت النماذج الماوس راثيا أدوات البحث القوية في تحديد العلاقات السببية بين التغيرات الجزيئية ونماذج من مرض القلب والأوعية الدموية. على الرغم من أن البيولوجيا الجزيئية هو ضروري في تحديد تغييرات رئيسية في مسار الإشارات ، فإنه ليس هناك بديل عن أهمية وظيفية. في حين يمكن أن تقدم إجابات الفيزيولوجيا إلى مسألة مهمة ، والجمع بين علم وظائف الأعضاء مع تقييم البيوكيميائية الأيضات في سليمة ، وضرب قلب يسمح للحصول على صورة كاملة من وظيفة القلب وعلم الطاقة. لسنوات ، وقد استخدمت مختبرنا perfusions القلب المعزولة جنبا إلى جنب مع التحليل الطيفي المغناطيسي النووي (NMR) صدى لإنجاز هذه المهمة. ويتم تقييم وظيفة البطين الأيسر عن طريق وضع Langendorff perfusions القلب المعزولة في حين يقاس علم الطاقة عن طريق أداء القلب

Protocol

1. لهذه التجارب ، تستخدم نظامين منفصلين في وقت واحد. لاقتناء أطياف ف ³¹ ، مغناطيس 14T بروكر هو ربطه مع وحدة سميت بال الثالث وجهاز كمبيوتر مجهزة ببرامج TopSpin V2.1. لتقييم وظيفة القلب ، ونضح القلب مخصصة بنيت النظام هو ربطه مع PowerLab 30/04 الحصول على البيانات ، ومجهزة البرنامج 6 LabChartPro لتحليل البيانات.
2. في يوم من التجربة ، على استعداد 1 لتر من كريبس - هنسلايت العازلة على النحو التالي : 0.5mM EDTA ، بوكل 5.3mM ، 1.2mM MgSO ₄ ، 118mM كلوريد الصوديوم ، و25mM NaHCO _3. ومن ثم انفجر هذا الخليط مع 5 ٪ CO ₂ / O ₂ 95 ٪ لمدة 10-15 دقيقة قبل إضافة 2mm وCaCl _2. أخيرا ، ركائز ، في شكل من الجلوكوز 10 مم والبيروفات 0.5mM ، تضاف.
3. تنظيم درجة الحرارة أثناء التجربة أمر بالغ الأهمية. وتستخدم ساخنة المروجون للحفاظ على درجة الحرارة بين 37،0-37،5 درجة مئوية في حين أن القلب هو داخل المغناطيس. ويتم رصد درجة الحرارة لمدة التجربة باستخدام الألياف البصرية التحقيق في درجة الحرارة.
4. يتم مراقبة ضغط التروية ضغط البطين الأيسر وعبر محولات الضغط تعلق على نظام الحصول على البيانات وعرضها باستخدام البرمجيات المضمنة. هذه هي معايرة مع مقياس ضغط الدم القياسية السابقة للتجربة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم مسح خطوط ضغط كاف من أجل إزالة جميع فقاعات الهواء.
5. ويستخدم نموذج قياسي من 150 مم فوسفات الصوديوم (وهو ما يعادل قوة الأيونية للالعازلة KH) إلى "معايرة" لجنة التحقيق قبل الإدراج من القلب. هذا يسهل الإشارة ويقلل من الوقت اللازم لبدء فترة شراء مرة واحدة يتم وضع القلب في التحقيق.
6. لتقليل تخثر الدم ، تحقن الفأر مع 200 وحدة الملكية الفكرية الهيبارين بعد 5 دقائق ، وتعطى بنتوباربيتال الصوديوم (175 ملغ / كلغ) IP.
7. ويستأصل قلب بسرعة (مع الرئتين والغدة الصعترية سليمة) ، وألقي القبض عليه في KH العازلة الجليد الباردة.
8. في حين أبقى على الجليد ، وإزالتها بسرعة الرئتين. يتم تحديد فصوص من الغدة الصعترية ومقشر بلطف مرة أخرى لفضح الأبهر. تتم إزالة الغدة الصعترية. ثم يتم عزل الشريان الأورطي عن طريق إزالة أي نوع من الأنسجة المحيطة بها بعناية.
9. وتستخدم الدقيقة ملقط لاجراء خياطة بلطف كلا جدران الشريان الأورطي لكشف التجويف. وضعت بعناية في قنية الأبهر على 0،965 ملم مصنوعة من أنابيب البولي ايثيلين OD (PE50). يقام في مكان الشريان الأورطي مع المشبك السفينة الصغيرة ، بينما ترتبط بسرعة الغرز حول الأبهر. إزالة مشبك ويتم استخدام ملقط لفحص دقيق أن قنية فوق جذر الأبهر. تضاف العلاقات إضافية حسب الضرورة لاجراء القلب في المكان.
10. تتم إزالة أي نوع من الأنسجة الإضافية باستخدام ملقط وmicroscissors. يتم إجراء شق صغير في الأذن اليسرى. تم إدراج بعناية 0.61 ملم أنابيب البولي ايثيلين OD (PE10) من خلال الأذين الأيسر ، وتجويف والوقف ، والخروج من خلال عقد قمة في حين بلطف القلب. يتم قطع الأنبوب الزائدة.
11. يتم إدراج قلصت بالون مملوء بالمياه من خلال الأذين في LV والذي عقد في مكان باستخدام شريط لاصق أو الغرز. وتزداد تدريجيا سرعة ضخ تمعجية لتوفير تدفق كاف للقلب. حتى القلب هو مكان في التحقيق الرنين المغناطيسي النووي ، وسوف يستمر القلب perfused مع تدفق مستمر أي ما يعادل حوالي 2 مل / دقيقة. يتم نفخ البالون LV مع حجم صغير باستخدام حقنة ميكرومتر للتحقق من أن محول الضغط المنخفض يعمل.
12. تم إدراج بعناية القلب في أنبوب NMR 10 مم. ويستخدم واسعة تتحمل "الدوار" للمساعدة في توجيه الأنبوب الى المكانة التي تليق بها في التحقيق. ومن ثم الجهاز بأكمله تعلق بحزم "الحبل السري" مع شريط لاصق.
13. ينخفض ​​ببطء الحبل السري في تحمل الجزء العلوي من المغناطيس حتى أنبوب القلب / الرنين المغناطيسي داخل لفائف من التحقيق ملم NMR 10.
14. مرة واحدة في القلب في المكانة التي تليق بها داخل لجنة التحقيق ، يتم ضبط تدفق مضخة تمعجية من أجل تحقيق ضغط التروية من 80mmHg. (تذكر ، أن ما يصل إلى هذه النقطة كان perfused القلب مع تدفق مستمر من حوالي 2 مل / دقيقة). ثم يبقى ضغط الارواء عن طريق تمكين "عقد" آلية على وحدة تحكم المضخة. وسمح للقلب موازنة دقيقة 15-20 الفترة. خلال ذلك الوقت ، ويتم ضبط حجم البالون LV لتحقيق ضغط الانبساطي النهائي من 80-10 مم زئبق.
15. خلال الفترة موازنة ، فمن الضروري لتحسين المعلمات مطياف من أجل الحصول على إشارة الفوسفور أفضل وجه ممكن. ويتم تحقيق هذا عن طريق تعيين نبض الراديو على التردد الذي نواة الفسفور صدى ("ضبط") وجعل المجال المغناطيسي متجانسة ("الملئ").
16. بعد فترة موازنة ، يمكن الحصول على ³¹ ف NMR متعددة الأطياف. فترة اكتساب لكل الطيف يعتمد على رانه قوة المجال المغنطيسي ، وحجم العينة ، وإشارة إلى نسبة الضوضاء المطلوبة لإجراء تجربة معينة. ويتم الحصول على أطياف باستخدام مغناطيس Telsa 14 عن طريق حساب متوسط ​​إشارة تم الحصول عليها من 256 نبضات الترددات الراديوية من 20 ميكرو ثانية مع زاوية 60 درجة الوجه والتأخير من 2.0 ثانية. وسوف تتطلب هذه التجربة حوالي 10 دقيقة.

ممثل النتائج

من الحصول على البيانات والأجهزة والبرمجيات LabChart ، يمكن قياس العديد من المعلمات من وظيفة القلب في جميع أنحاء بروتوكول التجريبية. المقياس النموذجي من وظيفة القلب ، ويتم الحصول على البطين الأيسر الضغط المتقدمة (LVDevP) ، وذلك بطرح ضغط الانبساطي النهائي (EDP) من الضغط الانقباضي (الشكل 1). ويمكن قياس هذا يختلف تبعا لسلالة من الفأرة وحالة القلب (أي الضغط الزائد). ومع ذلك ، في الماوس العادي C57BL6 LVDevP القلب عادة ما بين 100-110 مم زئبق في الضغط الانبساطي نهاية ثابتة من 80-10 مم زئبق. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح البرنامج LabChart لقياس معدل ضربات القلب بناء على قياسات دورية لموجات الضغط المنخفض. مرة أخرى ، يمكن أن تختلف ولكن هذا الاجراء القيم النموذجية هي 350-400 نبضة في الدقيقة عندما يسمح للفوز بقلوب بالمعدلات الحقيقية. ومع ذلك ، يمكن أن تكون موحدة القلب باستخدام نظام سرعة حيث يتم الاحتفاظ في معدل ضربات القلب نبضة في الدقيقة 420. بالإضافة ، يمكن تقدير تدابير انقباض (+ DP / DT) والاسترخاء (-dP/dt) باستخدام المشتقات الأولى من موجة الضغط المنخفض. خلال بروتوكول التجريبية فمن السهل لتقييم آلية ستارلينغ من خلال دمج علاقة ضغط الصوت. ويتم تحقيق هذا عن طريق الزيادات التدريجية في حجم البالون LV وتلاحظ LVDevP فضلا عن التجهيز الالكتروني للبيانات و. ويمكن بعد هذه القيم يمكن رسم كما هو مبين في الشكل 2. في حين أن منحنى ستارلينغ هو الأمثل ، مشيرا الى ان حجم اللازمة لتحقيق التجهيز الالكتروني للبيانات من 80-10 مم زئبق يمكن أن تعطي فكرة غير مباشرة من غرفة البعد LV. ويمكن استخدام هذه النماذج في الأبهر من النطاقات وقلوب متضخما عادة سيتطلب أصغر حجم البالون بينما قلوب متسعة تحتاج إلى حجم أكبر بالمقارنة مع الضوابط. يعرض الجدول 1 بيانات ممثل وظيفة القلب كما حصل خلال بروتوكول الارواء.

سوف مطياف الرنين المغناطيسي ³¹ ف توفر إشارات فسفوكرياتين (PCR) وثلاثة من الفوسفات ATP (γ - ATP ، α - ATP ، وβ ATP) وكذلك الفوسفات غير العضوية (بي) كما هو مبين في الشكل 2. تحليل كل من هذه القمم يوفر قيمة للمنطقة تحت منحنى. وتقدر كمية ATP عن طريق حساب متوسط ​​γ - ATP والمناطق β - ATP. (لا يتم استخدام α - ATP لأن جزيئات NAD المساهمة في جزء غير معروف من الإشارة المجموع). يتم تحديد حالة نشطة من القلب من قبل القسمة على PCR والمناطق ATP (PCR : بطولة نسبة). هذه القيمة هي عادة 1،5-1،7 في قلب الماوس المتوفرة مع الجلوكوز باعتباره الركيزة الأساسية. على الرغم من أن ³¹ ف الرنين المغناطيسي النووي لا يوفر تدابير مباشرة لاعبي التنس المحترفين أو PCR ، ومنطقة للقمم غير متناسبة مع كمية من المركبات المحتوية على الفوسفور في العينة. ويمكن تقدير قيم هذه الاشارات عن طريق استخدام أساليب أخرى. على سبيل المثال ، يمكن لتدابير مباشرة لاعبي التنس المحترفين قبل عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) في فوج من قلوب تسفر عن متوسط ​​التركيز. ويمكن بعد ذلك تكون هذه القيمة تستخدم لمعايرة متوسط ​​المناطق التي لوحظت في بطولة الأطياف. ويمكن حساب تركيز PCR على أساس مساحة PCR النسبي الى المنطقة للاعبي التنس المحترفين. ومن الممكن أيضا لتقدير درجة الحموضة عن طريق تحليل التحول الكيميائي النسبية للفوسفات غير عضوية (بي) إشارة إلى إشارة PCR ويمكن أيضا استخدام مختلف متواليات ¹ نبض الإذاعة وسرعة رد الفعل كيناز الكرياتين أو رد فعل التوليف ATP تقاس سرعة ²

وظيفة الجدول 1 الأساس. القلب من قلوب perfused معزولة. LVDevP : غادر الضغط البطيني المتقدمة ؛ LVEDP : البطين الأيسر نهاية الانبساطي الضغط ؛ الموارد البشرية : معدل ضربات القلب ؛ RPP : الضغط سعر المنتج ؛ + DP / DT : أولا الضغط LV المشتقة إيجابية ؛ -dP/dt : أولا الضغط LV المشتقة السلبية ؛ PP : ضغط التروية ؛ CF : التدفق التاجي.

الشكل 1. الضغط المنخفض الموجات الممثل من البرامج LabChart برو.

الشكل 2. منحنيات ستارلينغ الممثل من سيطرة (خط الصلب) والأبهر النطاقات (الخط المنقط) الفئران. أ) الانقباضي وظيفة ممثلا LVDevP على زيادة حجم الجهد المنخفض على النحو الذي يحدده حجم البالون LV. ب) وظيفة الانبساطي كما يمثلها EDP على زيادة حجم الجهد المنخفض على النحو الذي يحدده حجم البالون LV. LVDevP : غادر الضغط البطيني المتقدمة (الانقباضي الانبساطي ناقص عressure) ؛ EDP : نهاية الضغط الانبساطي.

الشكل 3. الممثل أطياف الرنين المغناطيسي ف ³¹ من عزلة القلب perfused الماوس. إشعار ذروة بي صغيرة نسبيا. في قلب perfused هوائيا الموردة مع الأحماض الدهنية في البيروفات أو بالإضافة إلى الجلوكوز ، وهذا ينبغي أن يكون الحد الأدنى الذروة. خلال فترات نقص التروية ، وهذا يزيد من ذروة الذروة في حين PCR النقصان. لاحظ الكتف إلى يمين ذروة α - ATP. هذه هي مساهمة من جزيئات NAD. بي : الفوسفات غير العضوية ؛ PCR : فسفوكرياتين ؛ ATP : الأدينوساين ثلاثي.

Discussion

³¹ ف الرنين المغناطيسي الطيفي في قلب Langendorff - perfused الماوس معزولة توفر بيانات موثوقة وقابلة للتكرار ^{3 و 4} ومع ذلك ، فمن الضروري أن تتم إقناء ؛ إدخال القنية من الشريان الأورطي وإدخال البالون LV هذه بشكل صحيح للسماح للأداء القلب مستقرة بينما داخل NMR الأنبوب. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تنظيم درجة الحرارة القصوى من أجل تحقيق السليم وظيفة أساسية. واحد العوامل المهمة في الحصول على جيد ، أطياف الرنين المغناطيسي للتحليل هو زيادة إشارة إلى نسبة الضوضاء. ويمكن تحقيق ذلك من خلال ضمان الأمثل "ضبط" و "الملئ" على عينة. كما ورد في نص البروتوكول ، ويمكن استخدام نموذج قياسي قبل الإدراج للقلب تسهيل ذلك. ومن المفيد أيضا أن يكون لها الحجم الكافي "عينة". قلوب وزنها أقل من 100 ملغ توفر عادة أقل PCR وإشارات ATP ذلك الزيادات في وقت الاستحواذ سيكون من الضروري الحصول على أطياف جيدة الفوسفور.

هناك عدة طرق لتعديل بروتوكول القائمة لجمع معلومات إضافية بشأن وظيفة القلب وعلم الطاقة. في المختبر لدينا ، ونحن قلوبنا مع perfused مخازن مختلطة الركيزة التي يمكن أن تشمل وجود تركيبات مختلفة من الأحماض الدهنية (في تركيزات منخفضة ومرتفعة) ، وأملاح ، الكيتونات ، والانسولين. مع استخدام النظائر المستقرة في المنطقة العازلة التروية (أي ¹³ C المسمى ركائز) ، ونحن نمتلك القدرة على تقدير استخدام الركيزة التي المساهمة النسبية للأسيتيل التميم المسمى لدورة TCA. ^5-7 للحصول على هذا التطبيق ، ونحن أداء isotopomer تحليل C3 - ¹³ و ¹³ الغلوتامات C4 - ¹³ مع مطياف الرنين المغناطيسي C. وهذا يتطلب تجميد لقط القلب في نهاية البروتوكول نضح وإجراء عملية استخراج الانسجة المجمدة. وسوف تكون هذه التجربة إضافية حسب التحليل يتطلب استخدام مسبار مختلفة مع معلمات الإعداد منفصلة. تطبيقات أخرى تشمل استبدال السكر مع deoxyglucose في المنطقة العازلة في حين رصد تراكم تعتمد على الوقت من 2 deoxyglucose الفوسفات في القلب باستخدام الرنين المغناطيسي الطيفي ³¹ ف. هذا الأسلوب يسمح لقياس امتصاص الغلوكوز عضلة القلب. ^{7 ، 8} وبالإضافة إلى ذلك ، لدينا مختبر وحللت وظيفة القلب وعلم الطاقة في بروتوكولات نضح تتألف من نقص التروية / ضخه ، وارتفاع عبء التحدي ^{6 ، 10/08}

باختصار ، ف ³¹ الطيفي NMR في قلوب الماوس معزولة هو إجراء تحديا تقنيا التي تتطلب استخدام معدات متطورة. ومع ذلك ، فإن البيانات التي لا تقدر بثمن لغلة الباحث الذي يرغب في تحليل وظيفة و طاقة من نماذج الماوس راثيا. لدينا مختبر ، كانت هذه التقنيات الحيوية في فهمنا لعواقب مجموعة متنوعة من الضغوطات على وظيفة القلب ، وعلم الطاقة ، والتمثيل الغذائي ^{1 ، 11 ، 12}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Magnesium Sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	M7506
EDTA	Reagent	Sigma-Aldrich	E1644
Potassium chloride	Reagent	Sigma-Aldrich	P4505
Sodium bicarbonate	Reagent	Sigma-Aldrich	S6297
Sodium chloride	Reagent	Sigma-Aldrich	S7653
Calcium chloride dihydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	C5080
D-Glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	G7528
Sodium Pyruvate	Reagent	Sigma-Aldrich	P2256
Bruker Ultrashield 600WB Plus	Equipment	Bruker Corporation
PowerLab 4/30	Equipment	ADInstruments	ML866/P
LabChart 6 Pro	Equipment	ADInstruments	MLS260/6
Quad Bridge Amp	Equipment	ADInstruments	ML224
STH Pump Controller	Equipment	ADInstruments	ML175
Minipuls 3 Peristaltic Pump	Equipment	ADInstruments	ML172
Disposable BP Transducer	Equipment	ADInstruments	MLT0699
10mm NMR Sample Tube	Equipment	Wilmad LabGlass	513-7PP-7
Polyethylene tubing PE10	Equipment	BD Biosciences	427401
Physiological Pressure Transducer	Equipment	ADInstruments	MLT844
Polyethylene tubing PE50	Equipment	BD Biosciences	427411
Micrometer syringe	Equipment	Gilmont Instruments	GS-1101
McPherson Forceps	Equipment	Miltex Inc.	18-949
Castraviejo microscissors	Equipment	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5650
Neoptix Signal Conditioner	Equipment	Neoptix, Inc.	Reflex - 1