Оценка функции сердца и энергетика в изолированном сердце мыши, используя 31 P ЯМР-спектроскопии

Резюме

Langendorff режиме изолированной перфузии сердца, в сочетании с ³¹ P ЯМР-спектроскопии, сочетает области биохимии и физиологии в одном эксперименте. Протокол позволяет динамических измерений с высоким содержанием фосфатов энергии и оборот в сердце при одновременном мониторинга физиологических функций. При правильном выполнении это ценный метод в оценке сердечной энергетики.

Аннотация

Биоинженерных модели мыши стали мощными инструментами исследования в определении причинно-следственные связи между молекулярными изменениями и моделей развития сердечно-сосудистых заболеваний. Хотя молекулярная биология необходимо определить ключевые изменения в сигнальный путь, это не суррогат функциональное значение. Хотя физиология может дать ответы на вопрос о функции, совмещая физиологии с биохимической оценки метаболитов в неприкосновенности, бьющееся сердце обеспечивает полное представление о функции сердца и энергетики. На протяжении многих лет наша лаборатория использовала изолированных перфузии сердца в сочетании с ядерно-магнитного резонанса (ЯМР), чтобы выполнить эту задачу. Функция левого желудочка оценивается Langendorff режиме изолированной перфузии сердца при сердечной энергетики измеряется путем проведения

протокол

1. Для этих экспериментов две отдельные системы используются одновременно. Для приобретения ³¹ спектров P, магнит Bruker 14T сопряжено с Avance III консоль и компьютер, оснащенный TopSpin V2.1 программного обеспечения. Для оценки функции сердца, обычай построен системы перфузии сердца сопряжена с PowerLab 4 / 30 сбора данных, оснащенный LabChartPro 6 программное обеспечение для анализа данных.
2. В день эксперимента, 1 литр Кребса Henseleit буфер готовят следующим образом: 0,5 мм ЭДТА, 5.3mM KCl, 1,2 MgSO _4, 118 мм NaCl, и 25 мм NaHCO _3. Затем смесь пропускают с 5% CO ₂ / 95% O ₂ в течение 10-15 минут до добавлением 2 мМ CaCl _2. Наконец, субстраты, в виде 10 мМ глюкозы и 0,5 мм пируват, не добавляются.
3. Регулировка температуры в ходе эксперимента является критической. Подогрев циркуляторы используются для поддержания температуры между 37,0 - 37,5 ° C в то время как сердце внутри магнита. Температура контролируется в течение всего эксперимента с использованием волоконно-оптический датчик температуры.
4. Перфузионного давления и давления в левом желудочке контролируется с помощью датчиков давления подключен к системе сбора данных и отображаются с помощью прилагаемого программного обеспечения. Это калиброванный со стандартным сфигмоманометра до эксперимента. Кроме того, давление линии сбрасываются адекватным для того, чтобы удалить все пузырьки воздуха.
5. Стандартного образца 150 мМ фосфата натрия (что соответствует ионной силы буфера KH) используется для "калибровки" зонда до вставки сердце. Это облегчает сигнала и уменьшает время, необходимое для начала периода сбора раз сердце располагается внутри зонда.
6. Чтобы уменьшить коагуляции, мыши вводили 200 единиц гепарина IP Через 5 минут, натрия фенобарбитала (175 мг / кг), IP-дается.
7. Сердце быстро вырезали (с легких и вилочковой железы без изменений) и арестован в ледяной KH буфера.
8. Хотя держится на льду, легкие, быстро удаляется. Доли вилочковой железы были выявлены и мягко очищенные назад подвергать аорты. Вилочковой железы удаляют. Аорты затем выделяют путем тщательного удаления любых окружающих тканей.
9. Micro ушивание щипцы используются для мягко держать обе стенки аорты подвергать просвет. Аорты осторожно помещают на канюлю из 0,965 мм OD полиэтиленовый трубопровод (PE50). Аорты удерживается на месте с микро зажим судна в то время как швы быстро связали вокруг аорты. Клип снимается и щипцов используются тщательно проверить, что канюля выше корня аорты. Дополнительная связей добавляются по мере необходимости провести сердце на месте.
10. Любая дополнительная ткань удаляется с помощью щипцов и microscissors. Маленький разрез сделан в левое предсердие. 0,61 мм OD полиэтиленовый трубопровод (PE10) тщательно вводится через левое предсердие, LV полости, и через вершину, мягко проведение сердце. Избыток труба обрезается.
11. Спущенный с водой воздушный шар вводится через предсердия в ЛЖ и удерживается на месте с помощью клейкой ленты или швов. Перистальтического насоса скорость постепенно увеличивается обеспечить поток, достаточный для сердца. До сердце место в ЯМР-зонд, сердце будет по-прежнему будет озарен постоянный поток эквивалентно примерно 2 мл / мин. Воздушный шар надувается LV с малым объемом использованием микрометра шприц, чтобы убедиться, что датчик давления LV функционирует.
12. Сердце аккуратно вставляется в 10 мм ЯМР трубки. Широкое отверстие "Счетчик" используется, чтобы помочь вести трубу в нужном положении внутри зонда. Весь аппарат затем прочно прикреплены к "пуповину" с помощью клейкой ленты.
13. Пуповины медленно опускается в верхние отверстия магнита до сердца / ЯМР трубка находится внутри катушки 10 мм зонд ЯМР.
14. Как только сердце находится в правильном положении внутри зонда, перистальтического насоса поток регулируется в целях достижения перфузионного давления 80mmHg. (Помните, что до этого момента сердце озарен постоянный поток около 2 мл / мин). Перфузионного давления является то, позволяя поддерживать "держать" механизма на контроллер насоса. Сердце затем дают 15-20 периода уравновешивания минуту. За это время объем шара LV регулируется для достижения конечного диастолического давления в 8-10 мм рт.
15. Во время периода равновесия, необходимо оптимизировать параметры спектрометра для получения наилучшего фосфора сигнала. Это достигается путем установки радиоимпульса на частоту, на которой фосфор ядра резонирует ("настройка") и сделать однородное магнитное поле ("прокладок").
16. После уравновешивания период, несколько ³¹ Р-ЯМР-спектры могут быть получены. Периода сбора для каждого спектра зависит от тон напряженность поля магнита, размер выборки, а соотношение сигнал-шум, необходимое для конкретного эксперимента. Спектры получены с использованием 14 Telsa магнит путем усреднения сигнала, полученного от 256 радиочастотных импульсов 20 мкс с 60 градусов флип угол и задержки в 2,0 секунды. Этот эксперимент потребуется около 10 мин.

Представитель Результаты

С аппаратной сбора данных и программного обеспечения LabChart из нескольких параметров сердечной деятельности может быть измерена всему протоколе исследования. Типичная мера функции сердца, левого желудочка развиваемое давление (LVDevP), получается вычитанием конечного диастолического давления (EDP) с систолическим давлением (рис. 1). Эта мера может варьироваться в зависимости от штамма мыши и состояние сердца (например, давление перегрузки). Однако в нормальных C57BL6 LVDevP сердце мыши, как правило, между 100-110 мм рт.ст. при фиксированном конечного диастолического давления в 8-10 мм рт. Кроме того, LabChart Программа позволяет производить измерение частоты сердечных сокращений на основе циклических измерений волны LV давления. Опять же, эта мера может варьироваться, но типичные значения 350-400 ударов в минуту, когда сердце разрешается бить по внутренним ценам. Тем не менее, сердце может быть стандартизированы использованием стимуляции системы, где частота сердечных сокращений держится на уровне 420 ударов в минуту. Кроме того, меры сократимости (+ дР / д) и расслабления (-dP/dt) можно оценить с помощью первой производной от волны давления ЛЖ. Во время экспериментального протокола, легко оценить Старлинг механизм за счет включения давление-объем отношений. Это достигается путем постепенного увеличения объема шара LV и отмечая LVDevP, а также электронной обработки данных. Эти значения могут быть построены как показано на рисунке 2. В то время как кривая Старлинг является оптимальным, отметив, объеме, необходимом для достижения электронной обработки данных в 8-10 мм рт.ст. может дать косвенное представление размерности Л. В. камере. Это может быть использовано в моделях аорты полосы, как правило, гипертрофированного сердца потребует меньшего объема шара в то время как расширенные сердца требуют больший объем по сравнению с контрольной группой. Таблица 1 показывает данные представителя сердечной функции, приобретенных в течение перфузии протокола.

³¹ Р-ЯМР-спектрометр обеспечит сигналы фосфокреатина (ПЦР) и три фосфатов АТФ (γ-АТФ, α-АТФ и β-ATP), а также неорганического фосфата (Pi), как показано на рисунке 2. Анализ каждого из этих пиков обеспечивает значение площади под кривой. Количество АТФ оценивается путем усреднения γ-АТФ и β-АТФ областях. (Α-АТФ не используется, потому NAD молекул вклад в неизвестном часть суммарного сигнала). Энергетического статуса сердца определяется фактор PCr и АТФ областях (ПЦР: ATP отношение). Эта величина, как правило, 1,5 - 1,7 в сердце мыши поставляются с глюкозой в качестве основного субстрата. Хотя ³¹ Р-ЯМР не содержит прямых мер АТФ или ПЦР, площадь пика пропорциональна количество фосфорсодержащих соединений в образце. Значения этих сигналов может быть оценена с помощью других методов. Например, прямые меры АТФ высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в группе из сердца могут привести к средней концентрации. Это значение может быть использован для калибровки среднем областях АТФ наблюдается в спектрах. Концентрация ПЦР может быть рассчитана на основе области PCr по отношению к области АТФ. Кроме того, можно оценить рН, анализируя относительный сдвиг химического неорганического фосфата (Pi) сигнал в сигнал ПЦР. ¹ Использование различных радио-импульсных последовательностей, креатина киназы скорости реакции или реакции синтеза АТФ скорость может быть измерена. ²

Таблица 1. Базовые функции сердца из изолированных перфузии сердца. LVDevP: левого желудочка достигаемое давление; LVEDP: левого желудочка конечного диастолического давления; HR: частота сердечных сокращений; РПП: ставка давление продукта; + дР / д: первая производная давления LV положительным; -dP/dt: первая производная давления LV отрицательным; ПП : перфузионного давления; CF: коронарного кровотока.

Рисунок 1. Представитель LV волн давления от LabChart Pro программное обеспечение.

Рисунок 2. Представителю Старлинг кривые из-под контроля (сплошная линия) и аорты диапазонов (пунктирная линия) мышей. ) Систолическое функции в лице LVDevP за увеличения объемов ЛЖ, как это определено объема шара LV. Б) Диастолическая функция в лице ПРП по увеличению объемов ЛЖ, определяемой по объему шара LV. LVDevP: левого желудочка развиваемое давление (систолическое минус диастолическое рressure); EDP: конечно-диастолического давления.

Рисунок 3. Представителем ³¹ Р-ЯМР спектры изолированных перфузии сердца мыши. Обратите внимание на относительно небольшой Pi пика. В аэробных перфузии сердца поставляется с пируват или жирных кислот в дополнение к глюкозе, этот пик должен быть минимальным. В периоды ишемии, этот пик растет, а пик PCr уменьшается. Обратите внимание на плечо справа от α-АТФ пика. Это вклад молекул НАД. Pi: неорганический фосфат; ПЦР: фосфокреатина; СПС: аденозинтрифосфата.

Обсуждение

³¹ Р-ЯМР-спектроскопии в Langendorff-перфузии изолированного сердца мышь обеспечивает надежные и воспроизводимые данные. ^{3, 4} Тем не менее, крайне важно, чтобы катетеризации аорты и вставки шар LV сделаны правильно, чтобы такой стабильной работы сердца, а внутри ЯМР трубки. Кроме того, регулирование температуры имеет первостепенное значение для достижения правильного функционирования базового уровня. Одним из важнейших условий получения хороших, анализируемых спектров ЯМР увеличивается отношение сигнал-шум. Это может быть достигнуто за счет обеспечения оптимального "тюнинг" и "прокладок" на образце. Как уже упоминалось в текст протокола, использование стандартного образца до введения сердца может способствовать этому. Это также полезно иметь адекватные размеры "образец". Сердца с массой тела менее 100 мг правило, обеспечивают более низкое PCr и АТФ сигналы так, увеличение времени захвата необходимо будет получить хорошие спектры фосфор.

Есть несколько способов изменения существующего протокола, чтобы собрать дополнительную информацию о функции сердца и энергетики. В нашей лаборатории мы перфузии сердца со смешанными буферов подложки, которые могут включать наличие различных комбинаций жирных кислот (в странах с низкими и высокими концентрациями), лактат, кетоны, и инсулина. С помощью стабильных изотопов в перфузии буфера (то есть, ¹³ C меченых субстратов), у нас есть возможность оценить утилизации субстрата от относительного вклада меченого ацетил КоА в ЦТК. ^5-7 В этом приложении мы выполняем isotopomer Анализ ¹³ С3-С4 и ^{13-глутамата} с ¹³ C-ЯМР-спектроскопии. Это требует заморозить зажима сердце в конце перфузии протокола и выполнения извлечения замороженных тканей. Это будет дополнительный эксперимент, как анализ требует использования различных зонд с отдельными параметрами настройки. Другие области применения включают замена глюкозы с дезоксиглюкозы в буфере при мониторинге зависящих от времени накопления 2-дезоксиглюкозы фосфатов в сердца, используя ³¹ P-ЯМР-спектроскопии. Этот метод позволяет для измерения инфаркт усвоения глюкозы. ^{7, 8} Кроме того, наша лаборатория провела анализ функции сердца и энергетики в перфузии протоколов, состоящий из ишемии / реперфузии и высокой задачей рабочей нагрузки. ^{6, 8-10}

Таким образом, ³¹ Р ЯМР-спектроскопии в изолированных сердцах мышь технически сложных процедура, требующая использования сложного оборудования. Тем не менее, данные, которые она дает имеет неоценимое значение для исследователя, который хочет проанализировать функции и энергетики биоинженерных модели мыши. Для нашей лаборатории, эти методы были жизненно важное значение для нашего понимания последствий различных стрессоров на функцию сердца, энергетики, и обмен веществ. ^{1, 11, 12}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Magnesium Sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	M7506
EDTA	Reagent	Sigma-Aldrich	E1644
Potassium chloride	Reagent	Sigma-Aldrich	P4505
Sodium bicarbonate	Reagent	Sigma-Aldrich	S6297
Sodium chloride	Reagent	Sigma-Aldrich	S7653
Calcium chloride dihydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	C5080
D-Glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	G7528
Sodium Pyruvate	Reagent	Sigma-Aldrich	P2256
Bruker Ultrashield 600WB Plus	Equipment	Bruker Corporation
PowerLab 4/30	Equipment	ADInstruments	ML866/P
LabChart 6 Pro	Equipment	ADInstruments	MLS260/6
Quad Bridge Amp	Equipment	ADInstruments	ML224
STH Pump Controller	Equipment	ADInstruments	ML175
Minipuls 3 Peristaltic Pump	Equipment	ADInstruments	ML172
Disposable BP Transducer	Equipment	ADInstruments	MLT0699
10mm NMR Sample Tube	Equipment	Wilmad LabGlass	513-7PP-7
Polyethylene tubing PE10	Equipment	BD Biosciences	427401
Physiological Pressure Transducer	Equipment	ADInstruments	MLT844
Polyethylene tubing PE50	Equipment	BD Biosciences	427411
Micrometer syringe	Equipment	Gilmont Instruments	GS-1101
McPherson Forceps	Equipment	Miltex Inc.	18-949
Castraviejo microscissors	Equipment	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5650
Neoptix Signal Conditioner	Equipment	Neoptix, Inc.	Reflex - 1