Beurteilung der Herzfunktion und Energetik in isolierten Maus-Herzen mit 31 P-NMR-Spektroskopie

Zusammenfassung

Langendorff-Modus isolierten Herzen Perfusion, in Verbindung mit ³¹ P-NMR-Spektroskopie, kombiniert den Gebieten der Biochemie und Physiologie in einem Experiment. Das Protokoll ermöglicht die dynamische Messung von hohen Energie-Phosphat-Gehalt und Umsatz im Herzen, während gleichzeitig die Überwachung physiologischer Funktion. Wenn richtig ausgeführt, ist dies eine wertvolle Technik für die Beurteilung von Herz-Energetik.

Zusammenfassung

Biotechnologisch Mausmodellen haben mächtig geworden Recherche-Tools bei der Bestimmung kausaler Zusammenhänge zwischen molekularen Veränderungen und Modelle von Herz-Kreislauf-Erkrankung. Obwohl der Molekularbiologie ist notwendig, in denen die wichtigsten Änderungen in den Signalweg, ist es nicht ein Surrogat für funktionelle Bedeutung. Während Physiologie Antworten auf die Frage nach der Funktion bereitstellen kann, die Kombination von Physiologie mit biochemischen Beurteilung der Metaboliten in die intakte, schlagende Herz erlaubt ein vollständiges Bild der Herzfunktion und Energetik. Seit Jahren hat unser Labor isolierten Herzen Infusionen mit Kernspinresonanz (NMR)-Spektroskopie kombiniert, um diese Aufgabe zu erfüllen genutzt. Die linksventrikuläre Funktion wird von Langendorff-Modus isolierten Herzen Perfusionen beurteilt, während kardiale Energetik, indem gemessen wird

Protokoll

1. Für diese Experimente werden zwei getrennte Systeme genutzt gleichzeitig. Für den Erwerb von ³¹ P-Spektren wird ein Bruker 14T Magnet Schnittstelle mit dem Avance III-Konsole und einen Computer mit TopSpin V2.1 Software ausgestattet. Für die Beurteilung der Herzfunktion ist ein custom built Herz Perfusion System über Schnittstellen mit den PowerLab 4 / 30 Datenerfassung, mit der LabChartPro 6 Software für die Datenanalyse ausgestattet.
2. 0,5 mM EDTA, 5,3 KCl, 1,2 MgSO _4, 118mm NaCl und 25 mM NaHCO _3: Am Tag des Experiments wird 1 Liter Krebs-Henseleit-Puffer wie folgt hergestellt. Die Mischung wird dann mit 5% CO ₂ / 95% O ₂ für 10-15 Minuten vor der Zugabe von 2 mM CaCl ₂ geleitet. Schließlich Substrate in Form von 10 mM Glukose und 0,5 mM Pyruvat, hinzugefügt werden.
3. Temperaturregelung während des Experiments ist von entscheidender Bedeutung. Beheizte Umwälzpumpen werden verwendet, um die Temperatur zwischen 37,0 pflegen - 37,5 ° C, während das Herz im Inneren des Magneten ist. Die Temperatur ist für die Dauer des Experiments mit einem faseroptischen Temperatursensor überwacht.
4. Perfusionsdruck und linksventrikulärer Druck werden über Drucksensoren an ein Datenerfassungssystem und angezeigt mit der mitgelieferten Software überwacht. Diese sind mit einem Standard-Blutdruckmessgerät vor dem Experiment kalibriert. Darüber hinaus sind Druckleitungen ausreichend, um alle Luftblasen zu entfernen gespült.
5. Ein Standard-Probe von 150 mM Natriumphosphat (was gleichbedeutend ist mit der Ionenstärke der KH-Puffer) wird verwendet, um "kalibrieren" der Sonde vor dem Einsetzen des Herzens. Dies erleichtert das Signal und verringert die notwendige Zeit, um den Erwerb Zeitraum beginnen, sobald das Herz in der Sonde positioniert ist.
6. Zur Verringerung der Koagulation wird die Maus mit 200 Einheiten Heparin IP Nach 5 Minuten, Natrium-Pentobarbital (175 mg / kg) IP gegeben injiziert.
7. Das Herz ist stark ausgeschnitten (mit Lungen und der Thymusdrüse intakt) und verhaftet in eiskaltem KH-Puffer.
8. Während auf Eis gehalten, sind die Lungen schnell entfernt. Die Lappen des Thymus identifiziert und sanft zurück in die Aorta aussetzen geschält. Der Thymus ist entfernt. Die Aorta wird dann durch vorsichtiges Entfernen von umgebenden Gewebe isoliert.
9. Micro Naht Pinzette werden verwendet, um sanft halten beide Wände der Aorta in das Lumen aussetzen. Die Aorta ist sorgfältig auf die Kanüle aus 0,965 mm OD Polyethylen-Schlauch (PE50) gemacht platziert. Die Aorta ist in Ort mit einem Mikro-Behälter Klammer gehalten, während Nähte schnell um die Aorta gebunden sind. Der Clip wird entfernt und die Zangen werden verwendet, um sorgfältig zu prüfen, dass die Kanüle über Aortenwurzel ist. Zusätzliche Verbindungen werden als notwendig, um das Herz in Position zu halten aufgenommen.
10. Alle zusätzlichen Gewebe entfernt mit einer Pinzette und Mikroschere. Durch einen kleinen Schnitt in der linken Ohrmuschel. Ein 0,61 mm OD Polyethylen-Schlauch (PE10) ist vorsichtig durch den linken Vorhof, LV Hohlraum, und durch den Scheitelpunkt eingefügt werden, während sanft hält das Herz. Die überschüssige Schlauch wird getrimmt.
11. Ein deflationiert mit Wasser gefüllten Ballon wird durch das Atrium in die LV eingesetzt und ist in Ort mit Klebeband oder Fäden gehalten. Die Schlauchpumpe Geschwindigkeit schrittweise erhöht, um eine ausreichende Strömung des Herzens geben. Bis das Herz ist Platz in der NMR-Sonde, wird das Herz auch weiterhin mit konstantem Durchfluss entspricht etwa 2 ml / min perfundiert werden. Die LV Ballon wird mit einem kleinen Volumen mit einem Mikrometer Spritze, um sicherzustellen, dass die LV Druckwandler funktioniert aufgeblasen.
12. Das Herz ist vorsichtig in eine 10 mm-NMR-Rohr eingesetzt. Eine große Bohrung "Spinner" wird verwendet, um zu helfen, die Röhre in die richtige Position innerhalb der Sonde. Die gesamte Apparatur wird dann fest mit der "Nabelschnur" mit Klebeband befestigt.
13. Die Nabelschnur wird langsam in die obere Bohrung des Magneten abgesenkt, bis das Herz / NMR-Rohr ist im Inneren der Spule des 10 mm-NMR-Sonde.
14. Sobald das Herz in die richtige Position innerhalb der Sonde ist die Schlauchpumpe flow angepasst, um ein Perfusionsdruck von 80mmHg zu erreichen. (Denken Sie daran, dass bis zu diesem Zeitpunkt das Herz mit einem konstanten Durchfluss von ca. 2 ml / min wurde perfundierten). Der Perfusionsdruck wird dann, indem Sie die "Hold"-Mechanismus auf die Pumpe-Controller erhalten. Das Herz wird dann 15-20 Minuten Äquilibrierung Frist. Während dieser Zeit ist das Volumen des LV Ballon angepasst, um eine End-diastolische Druck von 8-10 mmHg zu erreichen.
15. Während der Aquilibrierungsperiode, ist es notwendig, das Spektrometer Parameter zu optimieren, um die bestmögliche Phosphor Signal zu erhalten. Dies geschieht, indem die Funk-Impuls bei der Frequenz, bei dem die Phosphor-Kern schwingt ("Tuning") und macht das Magnetfeld homogen ("Shim") durchgeführt.
16. Nach der Equilibrierung Zeitraum können mehrere ³¹ P-NMR-Spektren erhalten werden. Der Erfassungszeitraum für jedes Spektrum ist abhängig von ter Feldstärke des Magneten, die Größe der Probe, und das Signal-Rausch-Verhältnis für ein bestimmtes Experiment erforderlich. Spectra werden unter Verwendung eines 14 Tesla Magnet durch Mittelung des Signals von 256 Hochfrequenzpulse von 20 us mit einem 60-Grad-Flip-Winkel und Verzögerungen von 2,0 Sekunden erreicht. Dieses Experiment erfordert ca. 10 min.

Repräsentative Ergebnisse

Von der Hardware zur Datenerfassung und die LabChart Software, können verschiedene Parameter der Herzfunktion während des experimentellen Protokolls gemessen werden. Die typische Maßnahme der Herzfunktion, der linksventrikulären entwickelten Druck (LVDevP), durch Subtraktion der enddiastolische Druck (EDP) von der systolische Druck (Abbildung 1). Diese Maßnahme kann je nach Belastung der Maus und der Zustand des Herzens (dh Druck Überlast). Doch in einem normalen C57BL6 Mäuseherzen LVDevP ist in der Regel zwischen 100-110 mmHg zu festen end-diastolischen Druck von 8-10 mmHg. Darüber hinaus ermöglicht die LabChart Programm für die Messung der Herzfrequenz auf den zyklischen Messungen der LV Druckwellen basiert. Auch hier kann diese Maßnahme variieren, aber typische Werte sind 350-400 bpm, wenn Herzen erlaubt wird, auf intrinsische Preise schlagen. Allerdings können Herz standardisiert werden mit einer Stimulation System, in dem die Herzfrequenz bei 420 Schlägen pro Minute gehalten wird. Darüber hinaus können Maßnahmen der Kontraktilität (+ dP / dt) und Entspannung (-dP/dt) unter Verwendung der ersten Ableitung des LV Druckwelle werden. Während des experimentellen Protokolls ist es leicht, den Starling-Mechanismus durch den Einbau eines Druck-Volumen-Verhältnis zu bewerten. Dies wird durch schrittweise Erhöhung der LV Ballonvolumen und in Anbetracht der LVDevP sowie der EDV durchgeführt. Diese Werte können dann dargestellt, wie in Abbildung 2 dargestellt werden. Während die Starling-Kurve optimal ist, unter Hinweis auf die notwendige Volumen zu einem EDV von 8-10 mmHg zu erreichen kann eine indirekte Idee der LV Kammer Dimension zu geben. Dies kann in Modellen der Aorten-banding als hypertrophierten Herzen verwendet werden typischerweise eine kleinere Ballon Volumen erfordern, während dilatierten Herzen ein größeres Volumen benötigt, wenn im Vergleich zu Kontrollen. Tabelle 1 zeigt repräsentative Herzfunktion Daten während der Perfusion Protokoll übernommen.

Die ³¹ P-NMR-Spektrometer liefert Signale von Phosphokreatin (PCr) und die drei Phosphate aus ATP (γ-ATP, α-ATP und β-ATP) sowie anorganisches Phosphat (Pi), wie in Abbildung 2 dargestellt. Analyse von jedem dieser Gipfel stellt einen Wert für die Fläche unter der Kurve. Die Höhe des ATP wird durch Mittelung der γ-ATP und β-ATP Bereichen geschätzt. (Die α-ATP wird nicht verwendet, weil NAD-Moleküle zu einem unbekannten Teil der gesamten Signal beitragen). Die energetische Zustand des Herzens ist durch den Quotienten aus der PCr und ATP Bereichen (: ATP-Verhältnis PCr) bestimmt. Dieser Wert wird in der Regel 1,5 bis 1,7 in einem Maus-Herz mit Glukose als primäre Substrat zugeführt. Obwohl ³¹ P NMR nicht zur Verfügung stellt direkte Maßnahmen der ATP oder PCR wird die Fläche der Peaks proportional zur Menge der Phosphor-enthaltenden Verbindungen in der Probe. Die Werte für diese Signale können durch die Verwendung anderer Methoden geschätzt werden. Zum Beispiel können direkte Messungen der ATP durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) in einer Kohorte von Herzen ergeben eine durchschnittliche Konzentration. Dieser Wert kann dann verwendet werden, um die durchschnittliche ATP Bereiche in den Spektren zu kalibrieren. Die PCR-Konzentration kann auf Basis der PCR-Bereich in Bezug auf die ATP-Bereich berechnet werden. Es ist auch möglich, pH-Wert durch die Analyse der relativen chemischen Verschiebung des anorganischem Phosphat (Pi) Signal an die PCR-Signal zu schätzen. ¹ Mit verschiedenen Radio-Pulssequenzen, die Kreatin-Kinase Reaktionsgeschwindigkeit oder die ATP-Synthese Reaktionsgeschwindigkeit kann auch gemessen werden. Be ²

Tabelle 1. Baseline Herzfunktion aus isoliert perfundierten Herzen. LVDevP: linksventrikulären entwickelten Druck; LVEDP: linksventrikulären enddiastolischen Druck, HR: Herzfrequenz; RPP: rate pressure product; + dP / dt: erste Ableitung LV Druck positiv; -dP/dt: erste Ableitung LV Druck negativ; PP : Perfusionsdruck; CF: Koronarfluss.

Abbildung 1. Representative LV Druckwellen aus LabChart Pro Software.

Abbildung 2. Representative Starling-Kurven von der Steuerung (durchgezogene Linie) und Aorten-gebändert (gepunktete Linie) Mäusen. A) Der systolische Funktion als durch LVDevP über zunehmende LV Volumina dargestellt als durch das Volumen des LV Ballon bestimmt. B) Der diastolische Funktion als von EDV über zunehmende LV Volumina dargestellt als Volumen des LV Ballon bestimmt. LVDevP: linksventrikulären entwickelten Druck (systolischer minus diastolischer pressure); EDV: enddiastolischen Druck.

Abbildung 3. Representative ³¹ P NMR-Spektren der isolierten perfundierten Maus Herzen. Beachten Sie die relativ kleine Pi Höhepunkt. In einem aerob perfundierten Herzen mit Pyruvat oder Fettsäuren zusätzlich zu Glukose versorgt, sollte diese Spitze minimal sein. Während der Dauer der Ischämie, diese Spitze erhöht, während die PCr Spitze ab. Beachten Sie die Schulter an der rechten Seite der α-ATP Höhepunkt. Dies ist der Beitrag der NAD-Moleküle. Pi: anorganischem Phosphat; PCr: Phosphokreatin, ATP: Adenosintriphosphat.

Diskussion

³¹ P-NMR-Spektroskopie in der Langendorff-perfundierten isolierten Maus Herz bietet eine zuverlässige und reproduzierbare Daten. ^{3, 4} Allerdings ist es unerlässlich, dass Kanülierung der Aorta und der Einführung des LV Ballon fertig sind richtig wie eine stabile Herzfunktion zu ermöglichen, während im Inneren der NMR Rohr. Darüber hinaus ist Temperaturregulierung, um einen ordnungsgemäßen Baseline-Funktion zu erreichen im Vordergrund. Ein wichtiger Faktor bei der Beschaffung von guten, auswertbare NMR-Spektren ist die Erhöhung der Signal-Rausch-Verhältnis. Dies kann durch eine optimale "Tuning" und "Shim" auf die Probe erreicht werden. Wie im Protokoll Text erwähnt, kann die Verwendung eines Standard-Probe vor dem Einsetzen des Herzens dies erleichtern. Es ist auch hilfreich, um eine ausreichende Größe "Probe" zu haben. Herzen mit einem Gewicht von weniger als 100 mg bieten in der Regel niedrigere PCr und ATP-Signale so erhöht sich bei der Aufnahmezeit wird notwendig sein, um gute Phosphor-Spektren zu erhalten.

Es gibt mehrere Möglichkeiten, die bestehenden Protokoll zu ändern, um zusätzliche Informationen über die Herzfunktion und Energetik zu sammeln. In unserem Labor haben wir Herzen mit gemischten Substrat Puffer, die das Vorhandensein von verschiedenen Kombinationen von Fettsäuren (in niedrigen und hohen Konzentrationen), Laktat, Ketone und Insulin enthalten kann perfundiert. Mit dem Einsatz von stabilen Isotopen in der Perfusionspuffer (dh ¹³ C markierten Substraten), wir die Möglichkeit, Substrat-Verwertung durch den relativen Beitrag von markiertem Acetyl-CoA zu den TCA-Zyklus Schätzung besitzen. ^5-7 Für diese Anwendung führen wir Isotopomer Analyse von ¹³ C3-und ¹³ C4-Glutamat mit ¹³ C-NMR-Spektroskopie. Dies erfordert freeze-Spannen des Herzens am Ende der Perfusion-Protokoll und die Durchführung einer Extraktion des gefrorenen Gewebe. Dies wird ein weiterer Versuch der Analyse der Verwendung einer anderen Sonde mit separatem Setup-Parameter erfordert. Andere Anwendungen umfassen die Substitution von Glucose mit Desoxyglucose in der Puffer während der Überwachung des zeitabhängigen Akkumulation von 2-Desoxyglucose Phosphat im Herzen mit ³¹ P-NMR-Spektroskopie. Diese Methode ermöglicht die Messung der myokardialen Glukoseaufnahme. ^{7, 8} Darüber hinaus hat unser Labor Herzfunktion und Energetik in Perfusion Protokolle aus der Ischämie / Reperfusion und hohe Arbeitsbelastung Herausforderung analysiert. ^{6, 8-10}

Zusammenfassend ist ³¹ P-NMR-Spektroskopie in isolierten Mäuseherzen eine technisch anspruchsvolle Verfahren erfordern den Einsatz von hoch entwickelten Geräten. Allerdings werden die Daten, dass es Erträge von unschätzbarem Wert für den Forscher, der die Funktion und Energetik von biotechnologisch Mausmodellen analysieren will. Für unser Labor wurden diese Techniken in unser Verständnis der Konsequenzen aus einer Vielzahl von Stressoren auf die Herzfunktion, die Energetik und Stoffwechsel von entscheidender Bedeutung. ^{1, 11, 12}

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Magnesium Sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	M7506
EDTA	Reagent	Sigma-Aldrich	E1644
Potassium chloride	Reagent	Sigma-Aldrich	P4505
Sodium bicarbonate	Reagent	Sigma-Aldrich	S6297
Sodium chloride	Reagent	Sigma-Aldrich	S7653
Calcium chloride dihydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	C5080
D-Glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	G7528
Sodium Pyruvate	Reagent	Sigma-Aldrich	P2256
Bruker Ultrashield 600WB Plus	Equipment	Bruker Corporation
PowerLab 4/30	Equipment	ADInstruments	ML866/P
LabChart 6 Pro	Equipment	ADInstruments	MLS260/6
Quad Bridge Amp	Equipment	ADInstruments	ML224
STH Pump Controller	Equipment	ADInstruments	ML175
Minipuls 3 Peristaltic Pump	Equipment	ADInstruments	ML172
Disposable BP Transducer	Equipment	ADInstruments	MLT0699
10mm NMR Sample Tube	Equipment	Wilmad LabGlass	513-7PP-7
Polyethylene tubing PE10	Equipment	BD Biosciences	427401
Physiological Pressure Transducer	Equipment	ADInstruments	MLT844
Polyethylene tubing PE50	Equipment	BD Biosciences	427411
Micrometer syringe	Equipment	Gilmont Instruments	GS-1101
McPherson Forceps	Equipment	Miltex Inc.	18-949
Castraviejo microscissors	Equipment	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5650
Neoptix Signal Conditioner	Equipment	Neoptix, Inc.	Reflex - 1