Avaliação da função cardíaca e Energetics em Corações Isolados rato Usando 31 P NMR Spectroscopy

Resumo

Langendorff modo de perfusão do coração isolado, em conjunto com ³¹ P espectroscopia de RMN, combina os campos da bioquímica e fisiologia em um experimento. O protocolo permite a medição dinâmica de conteúdo de alta energia de fosfato e volume de negócios no coração ao mesmo tempo em monitorização da função fisiológica. Quando realizada corretamente, esta é uma técnica valiosa na avaliação da energética cardíaca.

Resumo

Modelos de ratos bioengenharia tornaram-se ferramentas de pesquisa poderosa para determinar relações causais entre as alterações moleculares e modelos de doença cardiovascular. Embora a biologia molecular é necessário na identificação das alterações-chave na via de sinalização, não é um substituto para o significado funcional. Enquanto fisiologia pode fornecer respostas para a questão da função, fisiologia combinando com a avaliação bioquímica dos metabólitos na intacto, coração batendo permite uma visão completa da função cardíaca e energética. Durante anos, nosso laboratório tem utilizado perfusões coração isolado combinada com espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) para realizar essa tarefa. Função ventricular esquerda é avaliado por Langendorff modo perfusões coração isolado enquanto energética cardíaca é medida através da realização de

Protocolo

1. Para estes experimentos, dois sistemas separados são utilizados simultaneamente. Para aquisição de ³¹ espectros de P, um ímã Bruker 14T é a interface com o III Avance console e um computador equipado com software TopSpin V2.1. Para avaliação da função cardíaca, um sistema de perfusão personalizado construído coração está conectado com o PowerLab 30/04 aquisição de dados, equipada com os 6 LabChartPro software para análise de dados.
2. No dia do experimento, 1 litro de Krebs-Henseleit tampão é preparado da seguinte forma: 0,5 mM EDTA, 5,3 mm KCl, 1,2 mm MgSO _4, 118mm NaCl e 25mM NaHCO _3. A mistura é então borbulhado com 5% de CO ₂ / O ₂ 95% por 10-15 minutos antes da adição de 2mM CaCl _2. Finalmente, substratos, na forma de glicose 10 mM e 0,5 mM de piruvato, são adicionados.
3. Regulação da temperatura durante a experiência é fundamental. Circuladores aquecida são usados ​​para manter a temperatura entre 37,0-37,5 ° C, enquanto o coração está dentro do ímã. A temperatura é monitorada para a duração do experimento usando uma sonda de temperatura de fibra óptica.
4. Pressão de perfusão ea pressão ventricular esquerda são monitorados através de transdutores de pressão ligados a um sistema de aquisição de dados e exibidos utilizando o software incluído. Estes são calibrados com um esfigmomanômetro padrão antes do experimento. Além disso, linhas de pressão são liberadas de forma adequada, a fim de remover todas as bolhas de ar.
5. A amostra padrão de 150 mM fosfato de sódio (que é equivalente à força iônica do tampão KH) é usado para "calibrar" a sonda antes da inserção do coração. Isso facilita o sinal e diminui o tempo necessário para começar o período de aquisição uma vez que o coração está posicionado dentro da sonda.
6. Para reduzir a coagulação, o mouse é injetado com 200 unidades de heparina IP Depois de 5 minutos, sódio IP (175 mg / kg) pentobarbital é dado.
7. O coração é rapidamente retirado (com os pulmões eo timo intacta) e preso no gelo frio KH buffer.
8. Enquanto mantidos em gelo, os pulmões são rapidamente removidas. Os lobos do timo são identificados e delicadamente descascadas volta para expor a aorta. O timo é removido. A aorta é então isolado pela remoção cuidadosa de qualquer tecido circundante.
9. Forceps Micro sutura são usados ​​para segurar delicadamente ambas as paredes da aorta para expor o lúmen. A aorta é cuidadosamente colocada sobre a cânula feita de tubo de polietileno 0,965 mm de diâmetro externo (PE50). A aorta é mantida no lugar com uma braçadeira navio micro, enquanto as suturas são rapidamente amarrado ao redor da aorta. O clipe é removido e as pinças são usadas para verificar cuidadosamente que a cânula está acima da raiz da aorta. Vínculos adicionais são adicionados como necessário para manter o coração no lugar.
10. Qualquer tecido extra é removida com fórceps e microtesoura. Uma pequena incisão é feita na aurícula esquerda. A tubulação de polietileno de 0,61 milímetros OD (PI10) é cuidadosamente inserido através do átrio esquerdo, cavidade do VE, e para fora através do ápice, enquanto delicadamente segurando o coração. A tubulação em excesso é aparado.
11. A deflacionado balão cheio de água é introduzido através do átrio para o LV e é mantida no lugar usando fita adesiva ou suturas. A velocidade da bomba peristáltica é gradualmente aumentada para fornecer fluxo suficiente para o coração. Até que o coração é lugar para a sonda de RMN, o coração vai continuar a ser perfundidos com fluxo constante equivalente a aproximadamente 2 ml / min. O balão é inflado LV com um pequeno volume, utilizando uma seringa micrométrica para verificar se o transdutor de pressão LV está funcionando.
12. O coração é cuidadosamente inserido em um tubo de RMN 10 mm. Uma ampla furo "giratório" é usado para ajudar a orientar o tubo na posição adequada dentro da sonda. Todo o aparato é, então, firmemente ligado ao "cordão umbilical" com fita adesiva.
13. O cordão umbilical é lentamente abaixado no furo superior do ímã até o tubo de coração / NMR está dentro da bobina da sonda 10 milímetros de RMN.
14. Uma vez que o coração está na posição adequada dentro da sonda, a vazão da bomba peristáltica é ajustado de forma a atingir uma pressão de perfusão de 80mmHg. (Lembre-se que até este ponto, o coração foi perfundido com um fluxo constante de aproximadamente 2 ml / min). A pressão de perfusão é então mantida, permitindo que o "hold" mecanismo no controlador de bomba. O coração é então permitido um período de equilíbrio 15-20 minutos. Durante esse tempo, o volume do balão LV é ajustada para atingir uma pressão final diastólica de 8-10 mmHg.
15. Durante o período de equilíbrio, é necessário otimizar os parâmetros espectrômetro a fim de obter o sinal de fósforo melhor possível. Isto é conseguido através da criação do pulso de rádio na frequência a qual o núcleo de fósforo ressoa ("tuning") e fazendo o campo magnético homogêneo ("calços").
16. Após o período de equilíbrio, vários espectros de RMN ³¹ P pode ser obtida. O período de aquisição de cada espectro é dependente de tele força do campo do ímã, do tamanho da amostra, ea relação sinal-ruído requerida para um experimento específico. Espectros são obtidos utilizando um ímã 14 Telsa pela média do sinal obtido a partir de 256 pulsos de rádio freqüência de 20 mS com um ângulo de 60 graus flip e atrasos de 2,0 segundos. Esta experiência vai exigir cerca de 10 min.

Resultados representante

Do hardware de aquisição de dados eo software LabChart, vários parâmetros da função cardíaca pode ser medido ao longo do protocolo experimental. A medida típica da função cardíaca, a pressão ventricular esquerda desenvolvidos (LVDevP), é obtida pela subtração da pressão diastólica final (EDP) a partir da pressão sistólica (Figura 1). Esta medida pode variar dependendo da estirpe do mouse ea condição do coração (ou seja, a sobrecarga de pressão). No entanto, em um normal LVDevP coração C57BL6 mouse é normalmente entre 100-110 mmHg na pressão diastólica final fixo de 10/08 mmHg. Além disso, o programa permite LabChart para a medição da freqüência cardíaca baseada nas medidas cíclica das ondas de pressão do VE. Novamente, esta medida pode variar, mas valores típicos são 350-400 bpm quando os corações estão autorizados a bater a taxas intrínsecas. No entanto, o coração pode ser padronizado utilizando um sistema de estimulação onde a freqüência cardíaca é mantida a 420 bpm. Além disso, medidas de contratilidade (+ dP / dt) e relaxamento (-dP/dt) pode ser estimada utilizando a primeira derivada da onda de pressão do VE. Durante o protocolo experimental é fácil avaliar o mecanismo de Starling, incorporando uma relação pressão-volume. Isto é conseguido através de aumentos graduais no balão LV e observando o LVDevP, bem como a EDP. Estes valores podem ser representados como mostrado na Figura 2. Enquanto a curva de Starling é o ideal, observando o volume necessário para atingir uma EDP de 8-10 mmHg pode dar uma idéia indireta de LV dimensão câmara. Isto pode ser usado em modelos de bandagem aórtica como corações hipertrofiados normalmente exigirá um volume menor balão enquanto corações dilatados requerem um volume maior quando comparados aos controles. A Tabela 1 apresenta dados representativos função cardíaca como adquiridos durante o protocolo de perfusão.

O espectrômetro de RMN ³¹ P irá fornecer sinais de fosfocreatina (PCr) e os três fosfatos do ATP (ATP-γ, α-ATP, e β-ATP), bem como fosfato inorgânico (Pi), conforme mostrado na Figura 2. Análise de cada um desses picos fornece um valor para a área sob a curva. A quantidade de ATP é estimada pela média das γ-ATP e β-ATP áreas. (O α-ATP não é utilizada porque as moléculas de NAD contribuir para uma parte desconhecida do sinal total). O status energético do coração é determinado pelo quociente da PCr e áreas ATP (PCr: relação ATP). Esse valor é normalmente 1,5-1,7 em um coração de rato fornecido com a glicose como substrato primário. Embora ³¹ P NMR não fornece medidas diretas de ATP ou PCr, a área dos picos é proporcional à quantidade de fósforo contendo compostos na amostra. Valores para esses sinais podem ser estimados por outros métodos. Por exemplo, medidas diretas de ATP por cromatografia líquida (HPLC) em uma coorte de coração pode produzir uma concentração média. Este valor pode então ser usada para calibrar o ATP áreas médias observadas nos espectros. A concentração de PCr pode ser calculada com base na área PCr relativa à área de ATP. Também é possível estimar pH, analisando o deslocamento químico relativa do fosfato inorgânico (Pi) de sinal para o sinal de PCr. ¹ Usando seqüências de pulsos de rádio diferentes, a velocidade de reação da creatina quinase ATP ou a velocidade de reação de síntese também pode ser medido. ²

Tabela de funções da linha de base 1. Cardíaca de corações isolados perfundidos. LVDevP: pressão ventricular esquerda desenvolvidos; PDFVE: final do ventrículo esquerdo pressão diastólica; FC: freqüência cardíaca; RPP: produto pressão taxa; + dP / dt: primeiro LV pressão derivada positiva; -dP/dt: primeiro LV pressão derivada negativa; PP : pressão de perfusão; CF: fluxo coronariano.

Figura 1. Representante LV ondas de pressão de LabChart software Pro.

Figura 2. Curvas de Starling Representante do controle (linha sólida) e em faixas aórtica (linha pontilhada) camundongos. A) função sistólica, representado por mais de LVDevP volumes crescentes LV, conforme determinado pelo volume do balão LV. B) A função diastólica como representado pela EDP sobre volumes crescentes LV, conforme determinado pelo volume do balão LV. LVDevP: pressão do ventrículo esquerdo desenvolveu (sistólica menos p diastólicaressure); EDP: pressão diastólica final.

Figura 3. Representante ³¹ P espectros de RMN de coração de rato isolado perfundido. Observe o relativamente pequeno pico Pi. Em um coração aerobicamente perfundidos fornecido com ácidos graxos ou piruvato, além de glicose, o pico deve ser mínima. Durante os períodos de isquemia, o que aumenta de pico, enquanto o pico PCr diminui. Observe o ombro para a direita do pico de α-ATP. Esta é a contribuição de moléculas de NAD. Pi: fosfato inorgânico; PCr: fosfocreatina; ATP: adenosina trifosfato.

Discussão

³¹ P espectroscopia de RMN no coração do mouse Langendorff-perfundidos isolados fornece dados confiáveis ​​e reprodutíveis. ^{3, 4} No entanto, é imperativo que a canulação da aorta ea inserção do balão LV são feitas adequadamente tais para permitir o desempenho cardíaco estável, enquanto no interior do NMR tubo. Além disso, a regulação da temperatura é fundamental para alcançar a função de referência apropriada. Um fator importante na obtenção de bons, espectros de RMN analisável é o aumento da relação sinal-ruído. Isto pode ser conseguido através da garantia "tuning" ótimo e "calços" na amostra. Como mencionado no texto do protocolo, o uso de uma amostra padrão antes da inserção do coração pode facilitar este processo. Também é útil ter uma adequada "amostra" de tamanho. Corações com peso inferior a 100 mg normalmente fornecem PCr mais baixos e sinais de ATP para aumento do tempo de aquisição será necessário para obter espectros de fósforo bom.

Existem várias maneiras de modificar o protocolo existente para angariar informações adicionais sobre a função cardíaca e energética. Em nosso laboratório, temos perfundidos corações com buffers substrato misto, que pode incluir a presença de diferentes combinações de ácidos graxos (em concentrações baixa e alta), lactato, cetonas e insulina. Com o uso de isótopos estáveis ​​no buffer de perfusão (ou seja, ¹³ C rotulados substratos), possuímos a capacidade de estimar utilização do substrato pela contribuição relativa da rotulados acetil CoA para o ciclo TCA. ^5-7 Para esta aplicação, realizamos isotopomer análise de ¹³ e ^{13 de} C3-C4-glutamato com ¹³ C espectroscopia de RMN. Isso exige congelamento de aperto no coração no final do protocolo de perfusão e realizar uma extração do tecido congelado. Este será um experimento adicional como a análise requer o uso de uma sonda com diferentes parâmetros de configuração separado. Outras aplicações incluem a substituição de glicose com deoxiglicose no buffer enquanto monitora a acumulação dependente do tempo de 2-fosfato deoxiglicose no coração usando espectroscopia de RMN ³¹ P. Este método permite a medição da absorção de glicose do miocárdio. ^{7, 8} Além disso, nosso laboratório analisou a função cardíaca e energética em protocolos de perfusão consiste de isquemia / reperfusão e desafio alta carga de trabalho. ^{6, 80-10}

Em resumo, ³¹ P espectroscopia de RMN no coração de rato isolado é um procedimento tecnicamente desafiador exigindo o uso de equipamentos sofisticados. No entanto, os dados que ele produz é inestimável para o pesquisador que pretende analisar a função e energética dos modelos do rato de bioengenharia. Para o nosso laboratório, estas técnicas têm sido vitais em nossa compreensão das conseqüências de uma variedade de fatores de estresse sobre a função cardíaca, energética e metabolismo. ^{1, 11, 12}

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Magnesium Sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	M7506
EDTA	Reagent	Sigma-Aldrich	E1644
Potassium chloride	Reagent	Sigma-Aldrich	P4505
Sodium bicarbonate	Reagent	Sigma-Aldrich	S6297
Sodium chloride	Reagent	Sigma-Aldrich	S7653
Calcium chloride dihydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	C5080
D-Glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	G7528
Sodium Pyruvate	Reagent	Sigma-Aldrich	P2256
Bruker Ultrashield 600WB Plus	Equipment	Bruker Corporation
PowerLab 4/30	Equipment	ADInstruments	ML866/P
LabChart 6 Pro	Equipment	ADInstruments	MLS260/6
Quad Bridge Amp	Equipment	ADInstruments	ML224
STH Pump Controller	Equipment	ADInstruments	ML175
Minipuls 3 Peristaltic Pump	Equipment	ADInstruments	ML172
Disposable BP Transducer	Equipment	ADInstruments	MLT0699
10mm NMR Sample Tube	Equipment	Wilmad LabGlass	513-7PP-7
Polyethylene tubing PE10	Equipment	BD Biosciences	427401
Physiological Pressure Transducer	Equipment	ADInstruments	MLT844
Polyethylene tubing PE50	Equipment	BD Biosciences	427411
Micrometer syringe	Equipment	Gilmont Instruments	GS-1101
McPherson Forceps	Equipment	Miltex Inc.	18-949
Castraviejo microscissors	Equipment	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5650
Neoptix Signal Conditioner	Equipment	Neoptix, Inc.	Reflex - 1