زرع الأعضاء من الخلايا الجذعية البشرية إلى الأجنة الدجاج

Summary

في هذه الورقة نقدم طريقة لزرع الخلايا الجذعية البشرية في مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي للجنين الدجاج. هذا يوفر في الجسم الحي نموذج لتقييم انتشار والتفريق بين أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية البشرية في بيئات الأنسجة الجنينية.

Abstract

الجنين الدجاج هو نموذج حيواني الكلاسيكية لدراسة التطور الجنيني الطبيعي والجنين واجراء تجارب زرع الأعضاء لدراسة سلوك الخلايا في موحد

Protocol

1. العزلة وثقافة من الخلايا الجذعية البشرية والإعداد للحقن في الأجنة

1. يتم عزل الخلايا الجذعية البشرية المستخدمة كأمثلة في هذا البروتوكول (الدماغ والنخاع العظمي الدهنية ،) بطرق مختلفة من الأنسجة المختلفة. على سبيل المثال ، يتم عزل الخلايا الجذعية العصبية الكبار من قطع النسيج التي تم جمعها من جدار البطين من الدماغ أثناء جراحة الأعصاب بالمنظار ، والتي فصلها بعد ذلك إلى الخلايا الفردية التي يتم تربيتها في المختبر. الخلايا الجذعية العصبية شكل تلقائي neurospheres التي تطفو في مستنبت أنواع الخلايا الأخرى في حين تلتزم أسفل الطبق ^7. ويتم الحصول على الدهنية المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة من المواد التي يتم شفط الدهون وهضمها إنزيمي المتوترة لإزالة النسيج الليفي ثم طرد لإزالة الخلايا الشحمية ناضجة. ومعلق الخلايا الناتجة في مستنبت تستكمل مع المصل لتعزيز انتشار الخلايا الجذعية أكثر أنواع الخلايا الأخرى يمكن أن تكون معزولة ⁸ الجذعية المكونة للدم والخلايا الاصلية من aspirates نخاع العظم عن طريق الانتقاء الإيجابي باستخدام الاجسام المضادة المحددة لجزيئات مترافق المغناطيسي (Myltenyi بيوتيك ، ألمانيا أو Dynal - Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، والفصل المغناطيسي الخلية ، و / أو استخدام الأجسام المضادة لمترافق fluorophores الفرز ومضان تنشيط الخلايا (FACS) ^9.
2. لتسهيل التعرف في وقت لاحق ، تسمية الخلايا الجذعية مع علامة فلوري قبل زرع الأجنة في الدجاج. ويمكن تسمية الخلايا الجذعية مع الأصباغ الفلورية محبة للدهون مثل الجاذبة (Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية) أو PKH26 (سيغما ، الولايات المتحدة) باستخدام المورد أوصت البروتوكولات حتى قبل وقت قصير من الزرع ، أو لتسمية دائم مع الخطر ليس أساسا من الخلايا المضيفة تلويث ، ويمكن أن transduced مع الجين لبروتين فلوري مثل البروتين الفلوري الأخضر ، وذلك باستخدام ناقلات lentiviral ، في حين لا يزال ¹⁰ في الثقافة.
3. بروتوكولات للثقافة وانتشار الخلايا الجذعية البشرية تختلف. ويمكن الاطلاع على بروتوكولات وإجراءات تفصيلية في الأدب. لفترة وجيزة ، عادة يتم استزراع خلايا جذعية في المجال لتشكيل القوارير ، في حين يتم استزراع خلايا جذعية في العادة ملتصقة في أطباق بتري (التي تسهل سحن عند تقسيم ، أنظر أدناه) ، في المتوسط ​​المناسبة. لتقسيم أو الحصاد ، بيليه المجال لتشكيل الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 5 دقائق و1200rpm resuspend في محلول التربسين / EDTA قبل استعد لمدة لا تتجاوز 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. لخلايا ملتصقة إضافة الحل التربسين / EDTA إلى صحن بتري ، ويسحن في نهاية مدة 5 دقائق. إنهاء trypsinization بإضافة كا ^{2 +} المحتوية على المتوسط ​​، واستكمالها في بعض الأحيان مع الزلال. لإزالة التربسين / EDTA ، الطرد المركزي الخلايا (5 دقائق في 1200rpm) ، إزالة طاف ، resuspend الحقن في السيارة الباردة (عادة أو متوسطة الفوسفات مخزنة المالحة) ، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى (5 دقائق في 1200rpm). إزالة معظم هذه طاف وresuspend بلطف خلايا لإنشاء تعليق خلية مركزة للغاية.
4. الحفاظ على تعليق من الخلايا الجذعية البشرية في قارورة صغيرة ، أو أنبوب توج microfuge على الجليد لمدة تصل إلى عدة ساعات قبل الحقن. قد البقاء على قيد الحياة في هذه الحالة تكون الخلية التي تعتمد على نوع. يجب أن يكون الأمثل للسيارة الحقن وفقا لخصائص الخلايا ، بما في ذلك adhesivity منها (على سبيل المثال سيارة منخفضة الكالسيوم ^{+ 2} قد تساعد على منع تكتل) والمقاومة لتغيرات درجة الحموضة ونقص الأكسجين.

2. حضانة البيض وإعداد

1. تخزين البيض المخصب في غرفة التبريد (على سبيل المثال : Termaks ، بيرغن ، النرويج) في 14-15 درجة مئوية قبل الحضانة. درجة الحرارة في هذا التطور يتم القبض حتى تبدأ الحضانة. البويضات المخصبة تخزينها لأكثر من حوالي 10 أيام أو أقل في درجات الحرارة وانخفاض معدل التنمية اللاحقة والبقاء على قيد الحياة.
2. لمعاودة التنمية ، ووضع البيض في ترطيب ، مشروع حاضنة القسري (على سبيل المثال : بيندر ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية) في 38-39 درجة مئوية ، واحتضان حتى يتم الوصول إلى المرحلة المطلوبة للتنمية (على التدريج ، انظر المرجع 11. ).
3. قبل فتح البيض ، وخلق جيب الهواء فوق الجنين عن طريق إدخال حقنة قياس 18 إبرة من خلال قشرة البيضة (وليس عميق جدا لتجنب اختراق صفار) ، واخلاء 4 مل من الألبومين (الشكل A). هذا يخلق انخفاض الضغط داخل تلك عدة دقائق من هدف التعادل قبل دخول الهواء من خلال قذيفة يسهل اختراقها. كما يدخل الهواء تجمعها في أعلى نقطة في قذيفة ، مما يفصل الجنين من السطح الداخلي للصدفة.
4. ختم ثقب الإبرة التي أنشأتها المحاقن مع الشريط البلاستيك التقليدية.

3. سحب micropipettes الزجاج

1. سحب micropipettes الزجاج من الزجاج البورسليكات (على سبيل المثال ، 1.2mm OD X 0،94 ملم معرف ، جهاز هارفارد ، الولايات المتحدة الأمريكية) على مجتذب القطب التقليدية (على سبيل المثال ، الموديل P - 2000 ، سوتر الآلات ، الولايات المتحدة). ضبط الإعدادات للحصول على مجتذب micropipettes عالية المقاومة التي تستخدم عند مدخل microelectrodes. نصائح يجب أن تكون حوالي 1-1،5 سم طويلة. يمكن أن تكون علامة على اعمدة في 1 ملم فترات لحساب كميات إخراجه.
2. كسر نصائح micropipette إلى حجم عملي عن طريق الانحناء لهم ملقط أو دفعهم على سطح صلب أثناء عرض تحت المجهر. ينبغي أن يكون حتى كسر ممكن حول محيط الزجاج والقطر الداخلي الناتجة في الطرف ينبغي أن تستوعب حجم الخلايا لاستخدامه دون الحصول على المسدودة. عادة ما يكون قطرها ميكرون 20-30 الداخلية تعمل بشكل جيد.

4. إعداد سريع محلول الصبغة الخضراء (كاشف المتناقضة)

1. يعد حل 0.1 ٪ (ث / ت) من الصبغة الخضراء السريع (سيغما الدريخ ، الولايات المتحدة) عن طريق إذابة الدجاجة المالحة في الفسيولوجية (137 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 5 ملي بوكل ، CaCl 2 مم ₂ ، 1 ملم MgCl ₂ ، 1 ملم نا الفوسفات ، HEPES 5 مم و 11 مم الجلوكوز ، ودرجة الحموضة 7.4).
2. تصفية حل سريع الخضراء من خلال تصفية 0.22 ميكرون GP Millex (ميليبور شركة بيدفورد ، الولايات المتحدة).

5. فتح البيض والمتناقضة الجنين

1. مكان قطعتين من الشريط على الجزء العلوي من البيض ، والتي تغطي أبعاد جيب هوائي. حفظ البويضة المنحى بحيث سجلت منطقة (وبالتالي جيب الهواء) وتحتل مركز الصدارة ، وقطع نافذة صغيرة داخل حدود المنطقة مسجلة باستخدام مقص تشريح قوي. ويضيف الشريط الدعم ويساعد على منع شظايا قشر البيض من السقوط على الجنين. يمكن انتشرت فقاعات الهواء المرتبطة جيب الهواء باستخدام نهاية الخلفي من طرف ماصة بلاستيكية أو التحقيق الفظة الأخرى.
2. استخلاص بعض الحلول السريعة الخضراء في حقنة 1 مل مع إبرة قياس 25. إزالة أي فقاعات هواء في الحقنة والإبرة. ينحني الإبرة إلى زاوية 45 درجة ، في اختراق نقطة خارج لوحة الجنينية (التي تم تحديدها من قبل عصابة من الأوعية الدموية التي تحد له ؛ ثقب داخل الصفيحة يزيد معدل وفيات الأجنة) ، والتطريز دليل بعناية تحت الجنين. حقن الصبغة حتى يتحقق العكس المطلوب. وينبغي أن الجنين ، الذي هو عادة شفافة ، والوقوف إلى الآن كشبح بيضاء ضد خضراء داكنة اللون ، الشكل (B). العديد من المحققين استخدام الحبر الهند (مخفف إلى 10 ٪ V / V) بدلا من الأخضر السريع. في هذه الحالة من المهم استخدام الحبر أن الهند غير سامة ، مثل الهند PELIKAN الحبر الينبوع.

6. مما يجعل الدماغ المؤخر والحبل الشوكي آفات الأنبوب العصبي

1. إنتاج الإبر التنغستن شحذ بواسطة اللهب النقش القصير (2-3 سم) قطعة قطرها 100 ميكرون التنغستن قضبان (719000 رقم الكتالوج ، A & R نظم ، سياتل ، واشنطن) ، مع الشعلة الأسيتيلين / الأوكسجين. يتم ذلك عن طريق إدراج نهاية قضيب لفترة وجيزة جدا في لهب الشعلة حتى يعتبر شرارة ، وهو ما يمثل تآكل المتفجرات من الطبقات الخارجية من التنغستن ، تاركا وراءه طرف حاد.
2. باستخدام إبرة التنغستن شحذ ، وشريحة من خلال تحويل الغشاء المحي تغطي المنطقة لالمجهرية.
3. باستخدام إبرة ثانية التنغستن شحذ (معطوب في كثير من الأحيان رأس الإبرة الأولى بعد تشريح عبر الغشاء المحي وغير صالحة للالمجهرية اللاحقة) ، وقطع بعناية من خلال ظهارة تغمر الأنبوب العصبي ويصرف عليه ، ثم قص حول وتحت قطعة من الأنبوب العصبي إلى إزالتها ، وذلك باستخدام وسريعة قصيرة السكتات الدماغية التصاعدي (الشكل جيم). جعل التخفيضات عرضية أولا ثم قطع طولية عادة ما يكون الأكثر نجاحا. لا قطع عميق جدا أو هل خطر اختراق الأوعية الدموية الأساسية ، وهو عادة قاتلة.
4. الوجه بلطف أو سحب قطعة نسيج مقطوعة بعيدا عن موقع الآفة باستخدام إبرة التنغستن. إذا كان هذا أمر صعب ، فإنه يمكن أيضا يمكن إزالتها عن طريق شفط الفم باستخدام الزجاج micropipette المرفقة أنابيب مرنة.

7. حقن الخلايا الجذعية البشرية

أ. الحقن في آفة من الأنبوب العصبي

استخلاص كمية صغيرة من الخلايا في غيض من الزجاج micropipette الفم عن طريق الشفط باستخدام أنبوب من البلاستيك. يجب أن يكون الأمثل للتركيز العمل في تعليق خلية لنوع من الخلايا ليتم حقنه. تحميل micropipette على micromanipulator وتوصيله إلى مضخة microinjector (على سبيل المثال : PV830 PicoPump الهوائية ، WPI ، واشنطن ، الولايات المتحدة). تحت المراقبة البصرية باستخدام مجهر تشريح ، دليل غيض micropipette في الآفة وطرد بعناية الخلايا عن طريق زيادة ضغط الهواء (إما عن طريق الضغط المستمر من البقول أو من خلال زيادة الضغط تدريجيا) (الشكل جيم). عندما يتم إيداع المبلغ المطلوب من الخلايا داخل الموقع الآفة ، وسحب micropipette بعناية.

ب. الحقن في تجويف الأنبوب العصبي

في بعض الحالات قد يكون من المرغوب فيه لحقن الخلايا في المخ البطينين النامية ، على سبيل المثال إذا كانت الخلايا الغازية بما فيه الكفاية للوصول إلى الأنسجة العصبية في غياب الآفات. حقن الخلايا في تجويف أي رعين المنطقة يتطلب استخدام المرحلة التنموية التي توفر لمعة وعاء كبير بما فيه الكفاية ويتم الوصول إليها بسهولة ؛ مراحل سمو 12-18 مواتية في هذا الصدد. والآفة ليست ضرورية. ببساطة اختراق جدار الأنبوب العصبي مع micropipette الزجاج قبل أن حقن الخلايا. العناصر الرئيسية لنجاح هذه الطريقة هي من الحدة micropipette وفجائية للاختراق ؛ بطيئة للغاية وحركة رأس micropipette قد رصعة سوى جدار الأنبوب العصبي دون اختراق.

ج. حقن النظامية

ويمكن إجراء عمليات الحقن النظامية عبر الأوعية الدموية خارج الجنينية (بدءا من المرحلة سمو 15 ، عندما يتم تطوير هذه السفن بشكل جيد). ليس هذا مصحوبا بدرجة غير عادية من قبل بعض النزيف ولأن هناك العديد من الشرايين والأوردة الصغيرة أقل أكبر ، داخل الشرايين عادة ما تكون أكثر أمنا الحقن عندما يتعلق الأمر بقاء الجنين. من ناحية أخرى ، والحقن في الوريد توفير وصول أسرع من الخلايا في القلب ، وربما بالتالي إلى توزيع أكثر عدلا للخلايا. إن الحقن الناجح يتطلب micropipette حادة مع قطره أصغر من السفينة المستهدفة. نهج السفينة على طول محورها بزاوية صغيرة من الأفقي (حوالي 30 درجة). دفع micropipette ضد السفينة السفينة حتى يبدأ لتسد. ثم دفع إضافية في التنقل ، وشركة لاختراق مفاجئ. التراجع ببطء حتى ينظر الدم الى التعادل عن طريق العمل الشعري في غيض من micropipette. ثم ينبغي أن حقن الخلايا يمكن تنفيذها باستخدام الضغط المستمر ، وبعد ذلك هو تراجع عن micropipette مع حركة سريعة.

8. ختم البويضة

1. بعد الحقن ، والسماح للبيض لا تزال قائمة لبضع دقائق للسماح للخلايا حقن لتسوية والالتزام. لتجنب الجفاف (والتي يمكن أن تحدث بسرعة ويمكن أن تكون قاتلة) ، وضع قطعة من نسيج أو ورق مبلل تصفية أكثر من نافذة خلال هذه الفترة الباقية.
2. بعد بضع دقائق وخلايا استقروا وجافة القذيفة نحو النافذة وختم الشريط مع نافذة من البلاستيك التقليدية. تأكد من هذا الختم هو ضيق ، وأنه لا يمكن أن تسرب الزلال من خلال فتح أو بين القذيفة والشريط (وهذا غالبا ما يكون قاتلا خلال احتضان لاحقة).
3. استبدال البيض الى حاضنة مشروع القسري لمزيد من التطوير. ويمكن إجراء المراقبة على فترات من خلال إزالة الشريط عبر النافذة.

9. تشريح الجنين

1. مرة واحدة في جنين وصلت الى مرحلة المرجوة ، الكراك فتح البيض في وعاء من الثلج الباردة المالحة فيزيولوجية أو الفوسفات مخزنة المالحة. (يجب أن يكون قص الشريط الذي يغطي النافذة الأولى للسماح للشطر الثاني من قشر البيض لفصل) والمالحة الجليد الباردة يعمل على تخدير الجنين عن طريق انخفاض حرارة الجسم. ينبغي أن بطء القلب بسرعة ووقف في غضون بضع دقائق.
2. فصل الجنين من الأغشية خارج الجنين والمرحلة باستخدام المرجع. 11.
3. قطع رأس الجنين ، ونقل إلى طبق التشريح الذي يحتوي على الكلمة المطاطية سيليكون ويحتوي المالحة الفسيولوجية الاوكسيجين تستكمل مع الجلوكوز (137 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 5 ملي بوكل ، CaCl 2 مم ₂ ، 1 ملم MgCl ₂ ، 1 ملم فوسفات الصوديوم ، 5 HEPES ملي و 11 ملي الجلوكوز ، ودرجة الحموضة 7.4) ويعلقون عليه الجانب البطني بسرعة أعلى. إزالة أحشاء البطن والصدر. باستخدام مقص الزاوية ، وجعل شقوق طولية طول كل جانب من جوانب بطناني من العمود الفقري. ولا سيما في مراحل لاحقة (بعد 6 أيام من التنمية) ، يرصد أفضل شق الأولي في المنطقة القطنية العجزية حيث المساحة بين الفقرات والنخاع الشوكي هو أعظم. إزالة الجانب البطني من العمود الفقري للكشف عن الحبل الشوكي. تأكد من أن المياه المالحة الفسيولوجية التي لا يزال محتدما الاوكسيجين على فترات لمدة 10 دقائق تقريبا مع الأكسجين الطبي النقي.
4. قطع بعناية جذور الوليدة الظهرية والبطنية على جانبي ، والقطع في الحبل الشوكي في المستوى المطلوب ، ورفع بلطف من قناة العمود الفقري. والحبل الشوكي البقاء على قيد الحياة لعدة ساعات في هذه الحالة ، ويمكن أن تخضع لتجارب التشريحية والفسيولوجية ^{13،14 12.}

الشكل 1. A) والنهج المناسب لإخلاء الزلال. لاحظ موقف الجنين ووضع الإبرة. B) وبمقارنة الجنين. لاحظ نقطة اختراق الإبرة خارج القرص الجنينية. C) التمثيل التخطيطي لإجراءات من جانب واحد الشوكي الآفة الأنبوب العصبي تليها زرع الخلايا.

Discussion

الجنين الدجاج هو نموذج حيواني مريحة وتنوعا للتجارب زرع الأعضاء. عدم وجود نظام المناعة وظيفية أثناء التطور الجنيني والجنين يسمح للبقاء وتنمية الخلايا من أي نوع من الأنواع التي تتحمل درجة حرارة الحضانة. وقد استخدمت أجنة الدجاج لاختبار إمكانات التجدد لأنواع مختلفة من الخلايا الجذعية (إعادة النظر في المرجع 15). الخلايا الجذعية الثدييات يمكن أن تدمج في أنسجة الجنين الدجاج بما في ذلك النظام العصبي المركزي ، حيث يمكن أن تؤدي إلى الخلايا العصبية التي محواري التوقعات ، يمكن تقييم اتصال متشابك والخصائص الكهربية في سياق وظيفي ^1،2 الدارات العصبية.

لأن العمليات الجراحية سهلة نسبيا ، ويتم إجراء الحقن تحت البصرية بدلا من السيطرة التجسيمي ، يمكن بسهولة أن عدد الأجنة يمكن زيادة لاستيعاب ظروف تجريبية مختلفة في تجربة واحدة. يمكن عادة يتم حقن الخلايا في الأجنة 20-30 ضمن التجربة 4 ساعة. وفيات بعد حقن الأجنة هو العامل الرئيسي الحد. يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب النزف والجفاف. أن ندرك أن هناك بعض مراحل تطور حاسم في معدل وفيات الأطفال الذي يزيد الطبيعية. المكمل للجنين مع عدد قليل من مل الدافئة ، حقن معقمة الدجاج المسابقة التالية وقبل يوم واحد مراحل النمو الحرجة ، فضلا عن ضمان أن نافذة في البيض جيدا مختومة وموجهة لتفادي تسرب ، ويحسن البقاء على قيد الحياة. إذا كان التسرب من خلال ختم الشريط يجب أن تحدث ، وإزالة الشريط ، تجفيف الأسطح وإعادة الشريط. بعض المحققين استخدام الشمع والزجاج أو البلاستيك coverslips لاغلاق النافذة. يجب أن معدل وفيات لن تكون مختلفة كثيرا في حقن مقابل الشام التي تديرها الأجنة.

على الرغم من أننا قد ركزت هنا على حقن الخلايا الجذعية البشرية في بدأة من الدماغ والحبل الشوكي ، ويمكن أيضا أن حقن الخلايا الجذعية في بدأة الأجهزة الأخرى (انظر على سبيل المثال المرجع 4). كل جهاز يطرح تحديات خاصة بها. على سبيل المثال ، يمكن حقنها في القلب يمكن أن يكون تحديا بسبب مقاومة ميكانيكية عالية على الاختراق وماصة بسبب الحركات ، والتي من ناحية أخرى يمكن أن تباطأ عن طريق التبريد الأجنة في درجة حرارة الغرفة قبل الحقن. ويجوز للأجهزة التي تفتقر إلى التجويف لا تستوعب كميات كافية من الحقن ، ويمكن بالتالي تتطلب آفة الجراحية لخلق وعاء. في تجربتنا ، بعد تجديد أنسجة الآفة هي ميزة لأنها تشجع على التكامل من الخلايا الجذعية البشرية في الأنسجة. ويمكن أيضا أن تكون خلايا اللحمة المتوسطة حقنها الجنينية مثل اللحمة المتوسطة في somitic تفريق أو العرف المهاجرة العصبية باعتبارها وسيلة لتحقيق إدماج المشتقات الوسيطة ، بما في ذلك قمة العقد العصبية المشتقة المحيطية ^16،17.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent microscope	Microscope	Olympus Corporation
Stereo Investigator	Program	MBF Bioscience
MIP-GFP mice	Mice	Jackson Laboratory
Mathematica	Program	Wolfram
Image J	Program	National Institutes of Health
Slidebook	Program	Olympus Corporation