Xenotransplante de células-tronco humanas no embrião de galinha

Resumo

Neste artigo apresentamos um método de transplante de células-tronco humanas em várias regiões do sistema nervoso central do embrião de galinha. Isto proporciona uma In vivo Modelo de avaliação da proliferação e diferenciação dos vários tipos de células-tronco humanas em ambientes tecido embrionário.

Resumo

O embrião de galinha é um modelo animal clássica para estudar o desenvolvimento embrionário e fetal normal e para xenotransplante experimentos para estudar o comportamento de células em um padrão

Protocolo

1. Isolamento e cultura de células estaminais humanas e preparação para injeção em embriões

1. Células-tronco humanas utilizadas como exemplos neste protocolo (cérebro, medula óssea, tecido adiposo), são isolados de diferentes maneiras a partir de tecidos diferentes. Por exemplo, células-tronco adultas neurais são isolados a partir de pedaços de tecidos coletados a partir da parede do ventrículo do cérebro durante a neurocirurgia endoscópica, que são então dissociados para as células individuais que são cultivadas in vitro. As células-tronco neurais formam espontaneamente neurospheres que flutuam no meio de cultura, enquanto outros tipos de células aderem ao fundo do prato ^7. Derivadas de tecido adiposo células-tronco mesenquimais são obtidos a partir lipoaspiração material que é enzimaticamente digerido e tensas para remover o tecido fibroso e, em seguida, centrifugado para remover adipócitos maduros. As células resultantes são ressuspenso em meio de cultura suplementado com soro para promover a proliferação de células-tronco em outros tipos de células-tronco hematopoéticas e ⁸ células progenitoras pode ser isolada de aspirados de medula óssea por seleção positiva usando anticorpos específicos conjugados a partículas magnéticas (Myltenyi Biotec, Alemanha ou Dynal-Invitrogen, EUA) e separação de células magnéticas e / ou através de anticorpos conjugados com fluoróforos e separação de células ativadas por fluorescência (FACS) ^9.
2. Para facilitar a posterior identificação, rótulo as células-tronco com um marcador fluorescente antes da implantação em embriões de galinha. Células-tronco podem ser rotulados com corantes fluorescentes lipofílicos, como DII (Invitrogen, EUA) ou PKH26 (Sigma, EUA), utilizando-fornecedor recomendado protocolos até pouco antes da implantação, ou, por uma etiqueta permanente com essencialmente nenhum perigo de contaminar células hospedeiras, eles podem ser transduzidas com o gene de uma proteína fluorescente, como proteína verde fluorescente, usando lentivirais, ainda em cultura ^10.
3. Protocolos para a cultura e propagação de células estaminais humanas variar. Protocolos detalhada pode ser encontrada na literatura. Resumidamente, as células-tronco formadoras de esfera são normalmente cultivadas em frascos, enquanto as células-tronco aderentes são normalmente cultivadas em placas de Petri (que facilitam a trituração quando a divisão, veja abaixo), em meio apropriado. Para a divisão ou a colheita, pellet esfera células formadoras de centrifugação por 5 min a 1200rpm e ressuspender em pré-aquecido solução de tripsina / EDTA por não mais de 5 min a 37 graus Celsius. Para células aderentes adicionar a solução de tripsina / EDTA para a placa de Petri, e triturar no final de 5 minutos. Rescindir o tripsinização adicionando Ca ^{2 +} meio contendo, às vezes complementada com a albumina. Para remover a tripsina / EDTA, centrifugar as células (5 min a 1200rpm), remover o sobrenadante, ressuspender em veículos de injeção fria (tipicamente médio ou tampão fosfato), e centrifugar novamente (5 minutos a 1200rpm). Remover a maior parte deste sobrenadante e ressuspender delicadamente as células para criar uma suspensão de células altamente concentrado.
4. Manter a suspensão de células estaminais humanas em um frasco pequeno, tampado ou tubo de microcentrífuga em gelo por várias horas antes da injeção. Sobrevivência no estado pode ser dependente do tipo de célula. O veículo de injecção deve ser otimizada de acordo com as propriedades das células, incluindo a sua adesividade (por exemplo, um baixo-Ca ^{2 +} veículo pode ajudar a prevenir a aglutinação) e resistência a mudanças hipóxia e pH.

2. Incubação dos ovos e preparação

1. Armazenar ovos fertilizados em uma câmara de resfriamento (por exemplo: Termaks, Bergen, Noruega) a 14-15 ° C antes da incubação. Neste desenvolvimento de temperatura de incubação é preso até que se inicia. Ovos fertilizados armazenados por mais de 10 dias ou em temperaturas mais baixas têm uma menor taxa de subseqüente desenvolvimento e sobrevivência.
2. Para reiniciar o desenvolvimento, coloque os ovos em um umidificado, forçado projecto incubadora (por exemplo: Binder, New York, EUA) em 38-39 ° C, e incubar até o estágio de desenvolvimento desejado seja alcançado (para o estadiamento, ver ref 11. ).
3. Antes de abrir o ovo, criar um bolsão de ar acima do embrião através da inserção de uma agulha 18 gauge seringa através da casca do ovo (não muito profundamente para evitar perfurar a gema) e evacuar 4 ml de albumina (Figura A). Isso cria uma queda de pressão que, dentro de alguns minutos é equalizada com a entrada de ar através da casca porosa. Como o ar entra ele coleta no ponto mais alto dentro da casca, separando assim o embrião da superfície interna da casca.
4. Sele o orifício criado pela agulha da seringa com fita plástica convencional.

3. Puxando micropipetas de vidro

1. Puxe micropipetas de vidro de vidro de borosilicato (por exemplo, 1,2 milímetros OD x 0,94 mm de diâmetro, Harvard Apparatus, EUA) em um extrator eletrodo convencional (por exemplo, modelo P-2000, Sutter Instruments, EUA). Ajustar as configurações do extrator para obter micropipetas que têm resistência de entrada elevada quando usado como microelectrodes. Dicas deve ser de aproximadamente 1-1,5 cm de comprimento. Os eixos podem ser marcadas em intervalos de 1 mm para calcular volumes ejetados.
2. Quebrar a micropipeta dicas para uma dimensão funcional, dobrando-as com uma pinça ou empurrá-los contra uma superfície sólida durante a visualização ao microscópio. A quebra deve ser o mais uniforme possível em todo o perímetro do vidro e do diâmetro resultante interior na ponta deve acomodar o tamanho das células para serem usadas sem ficar obstruídos. Normalmente, um mícron de diâmetro 20-30 interior funciona bem.

4. Preparação da solução corante Fast Green (reagente contrastantes)

1. Preparar uma solução 0,1% (w / v) de Fast Green corante (Sigma-Aldrich, EUA) pela dissolução em solução salina fisiológica de frango (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl _2, 1 mM MgCl _2, 1 mM Na- fosfato, 5 mM HEPES, 11 mM glicose, pH 7,4).
2. Filtrar a solução através de um Fast Green 0,22 mM Millex GP filtro (Millipore Co., Bedford, EUA).

5. Abrindo os ovos e contrastando o embrião

1. Coloque dois pedaços de fita adesiva na parte superior do ovo, cobrindo as dimensões do bolsão de ar. Mantendo o ovo orientada para que a área gravada (e, portanto, a bolsa de ar) é mais alta, corte uma pequena janela dentro das fronteiras da área gravada usando uma tesoura de dissecção resistente. A fita adiciona suporte e ajuda a prevenir fragmentos de casca de ovo de cair sobre o embrião. Bolhas de ar associada à bolsa de ar pode ser estalado usando o back-end de uma ponteira de plástico ou sonda blunt outros.
2. Desenhar uma solução Fast Green em uma seringa de 1 ml com uma agulha de calibre 25. Remover quaisquer bolhas de ar na seringa e da agulha. Dobrar a agulha a um ângulo de 45 graus, penetrar em um ponto fora da placa embrionária (identificado pelo anel de vasos sanguíneos que circunscrevê-la; perfuração dentro do embrionárias mortalidade aumenta placa) e guiar cuidadosamente o needlepoint sob o embrião. Injetar o corante até que o contraste desejado seja alcançado. O embrião, que é normalmente transparente, agora deve se destacar como um fantasma esbranquiçada contra a cor verde escuro (Figura B). Muitos investigadores usam Índia Ink (diluído a 10% v / v) em vez de verde Fast. Neste caso, é importante o uso de tinta que a Índia não é tóxico, como tinta Pelikan India Fonte.

6. Fazendo rombencéfalo e lesões da medula espinhal do tubo neural

1. Produzir agulhas de tungstênio afiadas por chama-ataque de curta duração (2-3 cm) peças de 100 haste de tungstênio M diâmetro (número de catálogo 719000, A & R Systems, Seattle, Washington), com uma tocha de acetileno / oxigênio. Isso é feito inserindo a ponta da vara muito brevemente na chama da tocha até que uma faísca é visto, o que representa a erosão explosiva das camadas exteriores de tungstênio, deixando para trás uma ponta afiada.
2. Usando uma agulha afiada de tungstênio fatia, através de e desviar a membrana vitelina que cobre a área de microcirurgia.
3. Usando uma agulha de tungstênio segundo afiada (a ponta da agulha primeira é frequentemente danificada após o corte através da membrana vitelina e não apto para microcirurgia subseqüente), corte com cuidado através do epitélio do tubo neural e desviá-lo, em seguida, corte em torno e sob a peça do tubo neural a ser removido, utilizando-se curtos, rápidos movimentos ascendentes (Figura C). Fazer os cortes transversais em primeiro lugar e, em seguida, os cortes longitudinal é geralmente mais bem sucedidos. Não corte muito profundo sob o risco de penetrar vasos sanguíneos subjacentes, que normalmente é fatal.
4. Suavemente flip ou arrastar a peça de tecido ressecado longe do local da lesão utilizando a agulha de tungstênio. Se isso for difícil, ele também pode ser retirado por sucção da boca usando uma micropipeta de vidro ligado a tubos flexíveis.

7. Injeção de células-tronco humanas

a. Injeção em uma lesão do tubo neural

Desenhe uma pequena quantidade de células para a ponta de uma micropipeta de vidro por sucção da boca usando um tubo de plástico. A concentração de trabalho da suspensão de células deve ser otimizado para o tipo de célula a ser injetado. Monte a micropipeta em um micromanipulador e conectá-lo a uma bomba de microinjetor (por exemplo: PV830 PicoPump Pneumático, WPI, Washington, EUA). Sob controle visual usando um microscópio de dissecação, guia a ponta micropipeta na lesão e cuidadosamente expelir as células, aumentando a pressão do ar (ou por pulsos de pressão constante ou por gradualmente aumentando a pressão) (Figura C). Quando a quantidade desejada de células é depositada no local da lesão, cuidadosamente retirar a micropipeta.

b. Injeção para o lúmen do tubo neural

Em alguns casos pode ser desejável para injetar células nos ventrículos do cérebro em desenvolvimento, por exemplo, se as células são invasivos suficiente para ter acesso ao tecido neural, na ausência de lesões. Injeção de células para o lúmen de qualquer brain região requer o uso de um estágio de desenvolvimento em que a luz proporciona um recipiente grande o suficiente e é de fácil acesso; estágios HH 12-18 são favoráveis ​​a este respeito. A lesão não é necessário. Basta furar a parede do tubo neural com a micropipeta de vidro antes da injeção das células. Os elementos-chave para o sucesso deste método são a nitidez da micropipeta e ao carácter abrupto da penetração; muito lento e um movimento na ponta micropipeta só pode dimple a parede do tubo neural sem penetrar.

c. Injeção sistêmica

Injeções sistêmicas podem ser feitas através dos vasos extra-embrionárias do sangue (a partir de HH estágio 15, quando esses navios são bem desenvolvidos). Isso não é raro acompanhada por algum sangramento e, desde há muitas pequenas artérias e veias menos maiores, intra-arterial injeções são geralmente mais seguros quando se trata de sobrevivência do embrião. Por outro lado, injeções intravenosas fornecer um acesso mais rápido das células do coração e, assim, provavelmente, uma distribuição mais uniforme das células. A injeção de sucesso requer uma micropipeta afiada com um diâmetro menor do que o navio-alvo. Abordagem da embarcação ao longo de seu eixo em um ângulo pequeno em relação à horizontal (cerca de 30 graus). Empurre a micropipeta contra o navio até o navio começa a oclusão. Em seguida, empurre ainda mais em uma empresa de movimento abrupto de penetrar. Retrair lentamente até que o sangue é visto como desenhar por ação capilar para a ponta da micropipeta. Injeção de células deve então ser realizada utilizando a pressão constante, após o qual a micropipeta é recolhido com um movimento rápido.

8. Vedação do ovo

1. Após a injeção, deixe o ovo ficar parado por alguns minutos para permitir que as células injetadas para se estabelecer e aderir. Para evitar a desidratação (que pode ocorrer rapidamente e pode ser fatal), coloque um pedaço de tecido umedecido ou filtro de papel sobre a janela durante este período de descanso.
2. Depois de alguns minutos e as células se instalaram, seca a casca ao redor da janela e feche a janela com fita plástica convencional. Certifique-se que este selo está apertado e que nenhum de albumina pode vazar através da abertura ou entre o reservatório ea fita (essa prova frequentemente fatal durante a incubação subsequentes).
3. Substituir os ovos para a incubadora forçada projecto de desenvolvimento. Observação pode ser feita em intervalos removendo a fita sobre a janela.

9. Dissecção embrião

1. Uma vez que o embrião tenha alcançado o estágio desejado, crack abrir o ovo em uma tigela de gelado soro fisiológico ou tampão fosfato (a fita que cobre a janela deve ser cortada primeiro a permitir que as duas metades da casca do ovo para separar). O soro fisiológico gelado serve para anestesiar o embrião por hipotermia. O coração deve lenta e rapidamente parar dentro de um par de minutos.
2. Separar o embrião das membranas extra-embrionário e fase, usando ref. 11.
3. Decapitar o embrião, transferi-lo para um prato de dissecção que tem um piso de borracha de silicone e contém oxigenados soro fisiológico suplementado com glicose (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl _2, 1 mM MgCl _2, 1 mM Na-fosfato, 5 HEPES mM, 11 mM glicose, pH 7,4) e pin-lo lado ventral para cima rápido. Retire as vísceras abdominais e torácicas. Usando uma tesoura em ângulo, fazer incisões longitudinal ao longo de cada aspecto ventrolateral da coluna vertebral. Particularmente em fases posteriores (após o dia 6 de desenvolvimento), a incisão inicial de melhor se faz na região lombo-sacra, onde o espaço entre as vértebras ea medula espinhal é maior. Remover a face ventral da coluna vertebral para revelar a medula espinhal. Certifique-se que o soro fisiológico permanece oxigenado por borbulhamento em cerca de 10 minutos com oxigênio medicinal puro.
4. Corte cuidadosamente as raízes nascente dorsal e ventral de cada lado, transecto da medula espinhal nos níveis desejados, e gentilmente levantá-lo para fora do canal vertebral. A medula espinhal vai sobreviver por muitas horas nesse estado e pode ser submetido a ¹² anatômicas e fisiológicas ^13,14 experimentos.

Figura 1. A) A abordagem adequada para a evacuação de albumina. Observe a posição do embrião e da colocação da agulha. B) Em contraste do embrião. Observe o ponto de penetração da agulha fora do disco embrionário. C) Representação esquemática do procedimento para a lesão do tubo neural unilateral espinhal seguido de transplante de células.

Discussão

O embrião de galinha é um modelo animal prático e versátil para experimentos xenotransplante. A falta de um sistema imune funcional durante o desenvolvimento embrionário e fetal permite a sobrevivência eo desenvolvimento de células de qualquer espécie que tolera a temperatura de incubação. Embriões de galinha têm sido usados ​​para testar o potencial regenerativo de vários tipos de células-tronco (revisado na ref. 15). Células-tronco de mamíferos pode integrar em tecidos de frango embrião, incluindo o sistema nervoso central, onde podem dar origem a neurônios cujos axônios projeções, conectividade sináptica e propriedades eletrofisiológicas pode ser avaliada no contexto de ^1,2 funcional circuitos neurais.

Porque os procedimentos cirúrgicos são relativamente fáceis, e as injeções são feitas com visuais em vez de controle estereotáxico, o número de embriões pode ser facilmente aumentado para acomodar diferentes condições experimentais dentro de um único experimento. Normalmente as células podem ser injetadas em embriões de 2-30 dentro de um experimento de 4 horas. A mortalidade pós-injeção dos embriões é o principal fator limitante. Devem ser tomadas precauções para evitar a hemorragia e desidratação. Estar ciente de que há certos críticos estágios de desenvolvimento em que os aumentos da taxa de mortalidade naturais. Completa o embrião com alguns mililitros de injeção quente campainha, esterilizados frango seguinte e no dia anterior decisivas fases de desenvolvimento, bem como assegurar que a janela em que o ovo é bem fechados e orientada para evitar vazamento, melhora a sobrevivência. Se o vazamento através do selo de fita deve ocorrer, remova a fita, seque as superfícies e re-fita. Alguns investigadores usam cera e de vidro ou de plástico lamelas para selar a janela. A mortalidade não deve ser substancialmente diferentes em injetada contra sham-operado embriões.

Embora tenhamos focado aqui na injeção de células-tronco humanas no primórdio do cérebro e da medula espinhal, as células-tronco também podem ser injetados no primórdio de outros órgãos (ver, por exemplo ref. 4). Cada órgão apresenta seus próprios desafios. Por exemplo, a injeção para o coração pode ser um desafio por causa da alta resistência mecânica à penetração da pipeta e por causa de movimentos, que, por outro lado pode ser retardado por resfriamento dos embriões a temperatura ambiente antes da injeção. Órgãos que não possuem uma luz pode não acomodar a injeção de volumes suficientes e podem, portanto, necessitam de lesão cirúrgica para criar um receptáculo. Em nossa experiência, pós-lesão regeneração de tecidos é uma vantagem, pois promove a integração das células-tronco humanas para o tecido. Células também pode ser injetado em mesênquima embrionário, como o mesênquima dispersar somítica ou da crista neural migram como uma maneira de conseguir incorporação derivados mesenquimais, incluindo os gânglios derivadas da crista neural periférica ^16,17.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent microscope	Microscope	Olympus Corporation
Stereo Investigator	Program	MBF Bioscience
MIP-GFP mice	Mice	Jackson Laboratory
Mathematica	Program	Wolfram
Image J	Program	National Institutes of Health
Slidebook	Program	Olympus Corporation