Xenotransplantation von menschlichen Stammzellen in die Hühnerembryo

Zusammenfassung

In diesem Papier stellen wir eine Methode für die Transplantation menschlicher Stammzellen in verschiedene Regionen des zentralen Nervensystems des Hühnerembryo. Dies bietet eine In vivo Modell zur Beurteilung der Proliferation und Differenzierung der verschiedenen Arten von menschlichen Stammzellen in embryonale Gewebe-Umgebungen.

Zusammenfassung

Der Hühnerembryo ist ein klassisches Tiermodell für die Untersuchung normalen embryonalen und fetalen Entwicklung und für die Xenotransplantation Experimente, um das Verhalten von Zellen in einer standardisierten Untersuchung

Protokoll

1. Isolierung und Kultivierung von humanen Stammzellen und die Vorbereitung für die Injektion in Embryonen

1. Menschliche Stammzellen als Beispiele in diesem Protokoll (Gehirn, Fettgewebe, Knochenmark) verwendet werden, in unterschiedlicher Weise von den verschiedenen Geweben isoliert. Zum Beispiel sind adulten neuralen Stammzellen aus Gewebe Stücke aus der Ventrikelwand des Gehirns bei der endoskopischen Neurochirurgie, die dann dissoziiert einzelnen Zellen, die in vitro kultiviert werden gesammelt isoliert. Die neuralen Stammzellen spontan Neurosphären, dass in dem Kulturmedium schwimmen, während andere Zelltypen auf den Boden der Schale ⁷ einhalten. Fettgewebe gewonnene mesenchymale Stammzellen werden aus Fettabsaugung Material, das enzymatisch verdaut und strengte sich an faserige Gewebe zu entfernen und anschließend zentrifugiert, um zu reifen Fettzellen zu entfernen. Die erhaltenen Zellen werden in Kulturmedium mit Serum ergänzt, um die Proliferation von Stammzellen zu fördern gegenüber anderen Zelle Typen ⁸ hämatopoetische Stamm-und Vorläuferzellen aus dem Knochenmark saugt durch positive Selektion mittels spezifischer Antikörper, konjugiert mit magnetischen Partikeln (Myltenyi Biotec, Deutschland isoliert werden resuspendiert oder Dynal-Invitrogen, USA) und magnetische Zellseparation, und / oder mit Hilfe von Antikörpern, konjugiert mit Fluorophore und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) ^9.
2. Um eine spätere Identifizierung, beschriften Sie die Stammzellen mit einem fluoreszierenden Marker vor der Implantation in Hühnerembryonen zu erleichtern. Stammzellen können mit fluoreszierenden lipophilen Farbstoffen wie DiI (Invitrogen, USA) oder PKH26 (Sigma, USA) mit Lieferanten empfohlenen Protokolle bis kurz vor der Implantation, oder für eine dauerhafte Beschriftung mit im Wesentlichen keine Gefahr der Kontamination Wirtszellen, gekennzeichnet sie können mit dem Gen für ein fluoreszierendes Protein wie Green Fluorescent Protein transduziert werden, mit lentiviralen Vektoren, während noch in der Kultur ^10.
3. Protokolle für die Kultur und Vermehrung von menschlichen Stammzellen unterscheiden. Detaillierte Protokolle können in der Literatur gefunden werden. Kurz gesagt, sind Kugel-bildenden Stammzellen in der Regel in Flaschen gezüchtet, während Anhänger Stammzellen in der Regel in Petrischalen kultiviert werden (was zu erleichtern Verreibung beim Aufteilen, siehe unten), in geeigneten Medium. Für die Spaltung oder Ernte-, Pellet-Kugel-bildenden Zellen durch 5 min Zentrifugation bei 1200rpm und resuspendieren in vorgewärmten Trypsin / EDTA-Lösung für nicht mehr als 5 min bei 37 Grad Celsius. Für adhärente Zellen fügen Sie die Trypsin / EDTA-Lösung auf die Petrischale, und verreiben am Ende der 5 Minuten. Beenden Sie die Trypsinierung durch Zugabe von Ca ^{2 +-haltigem} Medium, manchmal mit Albumin ergänzt. Zum Entfernen der Trypsin / EDTA, Zentrifuge die Zellen (5 min bei 1200rpm), entfernen Sie den Überstand resuspendieren in kalten Injektion Fahrzeug (in der Regel mittel-oder Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) und Zentrifuge wieder (5 min bei 1200rpm). Entfernen Sie die meisten dieser Überstand und sanft resuspendieren einer hochkonzentrierten Zellsuspension zu schaffen.
4. Halten Sie die Aussetzung des menschlichen Stammzellen in einem kleinen, verschlossenen Röhrchens oder Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis bis zu mehreren Stunden vor der Injektion. Überleben in diesem Zustand kann Zelltyp-abhängig. Die Injektion Fahrzeug muss nach den Eigenschaften der Zellen optimiert werden, einschließlich ihrer Haftfähigkeit (zB eine low-Ca ^{2 +} Fahrzeug kann helfen zu verhindern Verklumpung) und Resistenz gegenüber Hypoxie und pH-Änderungen.

2. Egg Inkubation und Vorbereitung

1. Shop befruchteten Eier in eine Kühlkammer (zum Beispiel: Termaks, Bergen, Norwegen) bei 14-15 ° C vor der Inkubation. Bei dieser Temperatur Entwicklung wird verhaftet, bis Inkubationszeit beginnt. Befruchteten Eier für mehr als 10 Tagen oder bei niedrigeren Temperaturen gelagert haben eine niedrigere Rate von späteren Entwicklung und das Überleben.
2. Um reinitiate Entwicklung, die Eier in einer befeuchteten, Gebläse Inkubator (zum Beispiel: Binder, New York, USA) bei 38-39 ° C, und inkubieren, bis die gewünschte Stufe der Entwicklung erreicht ist (für die Inszenierung, siehe Lit. 11. ).
3. Vor dem Öffnen der Eier, schaffen ein Luftpolster über der Embryo durch Einfügen einer 18-Gauge-Kanüle durch die Eierschale (nicht zu tief zu vermeiden piercing das Eigelb) und Evakuieren 4 ml Albumin (Abbildung A). Dadurch entsteht ein Druckabfall, der innerhalb von wenigen Minuten durch den Eintrag von Luft durch die poröse Schale ausgeglichen ist. Da die Luft gelangt es sammelt sich am höchsten Punkt in der Schale, also die Trennung der Embryo von der inneren Oberfläche der Schale.
4. Dichten Sie das Loch durch die Nadel der Spritze mit herkömmlichen Kunststoff-Band geschaffen.

3. Pulling Glasmikropipetten

1. Pull Glasmikropipetten aus Borosilikatglas (z. B. 1,2 mm OD x 0,94 mm ID, Harvard Apparatus, USA) auf einem herkömmlichen Elektrode Abzieher (z. B. Modell P-2000, Sutter Instruments, USA). Passen Sie puller Einstellungen Mikropipetten, dass hohen Eingangswiderstand haben, wenn sie als microel verwendet zu erhaltenectrodes. Tipps sollten ca. 1-1,5 cm lang. Die Wellen können bei 1 mm Abstand zur Berechnung Volumen ausgeworfen markiert werden.
2. Break the Mikropipettenspitzen eine praktikable Größe durch Biegen sie mit einer Pinzette oder schob sie gegen eine feste Oberfläche, während Sie unter dem Mikroskop. Die Pause sollte so gleichmäßig wie möglich sein um den Umfang des Glases und der daraus resultierenden inneren Durchmesser an der Spitze sollte die Größe der Zellen an, ohne sich verstopft werden unterzubringen. In der Regel eine 20-30 Mikrometer Innendurchmesser gut funktioniert.

4. Vorbereitung der Fast Green Farbstofflösung (Kontrast-Reagenz)

1. Bereiten Sie eine 0,1% (w / v) Lösung von Fast Green-Farbstoff (Sigma-Aldrich, USA) durch Auflösen in Huhn physiologischer Kochsalzlösung (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl _2, 1 mM MgCl _2, 1 mM Na- Phosphat, 5 mM HEPES, 11 mM Glucose, pH 7,4).
2. Filter der Fast Green-Lösung durch ein 0,22 um Millex GP-Filter (Millipore Co., Bedford, USA).

5. Das Öffnen der Eier und Kontrast des Embryos

1. Legen Sie zwei Klebestreifen an der Oberseite des Eies, für die Dimensionen der Luftblase. Keeping the egg so ausgerichtet, dass die aufgenommene Fläche (und damit die Luftblase) oberste ist, schneiden Sie ein kleines Fenster innerhalb der Grenzen der Naht mit einem stabilen Dissektion Schere. Die Band bietet Unterstützung und hilft zu verhindern, Eierschale Fragmente fallen auf den Embryo. Luftblasen mit dem Luftpolster verbunden sind, können knallte mit dem hinteren Ende eines Kunststoff-Pipettenspitze oder einem anderen stumpfen Sonde werden.
2. Zeichnen Sie einige Fast Green-Lösung in einer 1 ml Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel. Entfernen Sie alle Luftblasen in der Spritze und der Nadel. Biegen Sie die Nadel in einem 45-Grad-Winkel, an einem Punkt außerhalb der embryonalen Platte (erkennbar durch den Ring von Blutgefässen, die es zu umschreiben; Piercing in der embryonalen Platte erhöht Sterblichkeit) eindringen und sorgfältig führen die Nadelspitze unter der Embryo. Inject der Farbstoff, bis der gewünschte Kontrast erreicht ist. Der Embryo, der normalerweise transparent, sollte jetzt stehen als eine weißliche Geist gegen die dunkelgrüne Farbe (Abbildung B). Viele Forscher verwenden Tusche (verdünnt auf 10% v / v) anstelle von Fast Green. In diesem Fall ist es wichtig, Tusche, die ungiftig ist, wie Pelikan Fount Tusche zu verwenden.

6. Machen Hinterhirn und Rückenmark Neuralrohr Läsionen

1. Produce geschärft Wolfram Nadeln durch Flamm-Radierung in kurzen (2-3 cm) Stücke von 100 Mikrometer Durchmesser Wolframstab (Katalog-Nummer 719000, A & R Systems, Seattle, Washington), mit einer Acetylen / Sauerstoff-Brenner. Dies wird durch Einstecken des Endes des Stabes sehr kurz in die Brennerflamme, bis ein Funke zu sehen ist, der die explosive Erosion der äußeren Schichten von Wolfram stellt, hinterlässt eine scharfe Spitze getan.
2. Mit einem geschärften Wolframnadel, Schnitt durch und lenken die Dotterhaut mit der Fläche für die Mikrochirurgie.
3. Mit einem zweiten geschärft Wolfram-Nadel (die Spitze der ersten Nadel wird oft nach dem Schneiden durch die Dotterhaut beschädigt und nicht für nachfolgende Mikrochirurgie fit), schneiden vorsichtig durch das Epithel über dem Neuralrohr und lenken es dann rund geschnitten und unter das Stück des Neuralrohrs entfernt werden, mit kurzen, schnellen Aufwärtsbewegungen (Abbildung C). Making the Querschnitten und dann die Längsschnitte ist in der Regel am erfolgreichsten. Schneiden Sie nicht zu tief oder Sie riskieren Eindringen zugrunde liegende Blutgefäße, die in der Regel tödlich.
4. Vorsichtig drehen oder ziehen Sie die Resektates Stück weg von der Läsion mit dem Wolfram-Nadel. Erweist sich dies als schwierig, es kann auch durch den Mund mit einem Saug-Glasmikropipette an flexiblen Schlauch entfernt werden.

7. Die Injektion von menschlichen Stammzellen

a. Injektion in eine Läsion des Neuralrohrs

Zeichnen Sie eine kleine Menge an Zellen in der Spitze eines Glasmikropipette durch den Mund Absaugen mit einem Kunststoffrohr. Die Arbeitsgruppe Konzentration der Zellsuspension muss für den Zelltyp, die injiziert werden optimiert werden. Montieren Sie die Mikropipette auf einem Mikromanipulator und verbinden Sie es zu einem Mikroinjektor Pumpe (zum Beispiel: PV830 Pneumatische PicoPump, WPI, Washington, USA). Unter visueller Kontrolle mit einem Dissektionsmikroskop, Führer der Mikropipette Spitze in der Läsion und sorgfältig vertreiben die Zellen durch Erhöhung des Luftdrucks (entweder durch Impulse konstanter Druck oder durch eine schrittweise Hochfahren der Druck) (Abbildung C). Wenn die gewünschte Menge an Zellen innerhalb der Läsion abgeschieden wird, ziehen Sie vorsichtig die Mikropipette.

b. Injection in das Lumen des Neuralrohrs

In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, Zellen in das sich entwickelnde Gehirn Ventrikel injiziert, zum Beispiel, wenn die Zellen invasive genug, um den Zugriff auf das Nervengewebe in Abwesenheit von Läsionen zu gewinnen sind. Die Injektion von Zellen in das Lumen eines brain Region erfordert mit einem Entwicklungsstadium, bei dem das Lumen bietet eine ausreichend große Behälter und ist leicht zugänglich; HH Stufen 12 bis 18 sind in dieser Hinsicht günstig. Eine Läsion ist nicht erforderlich. Einfach durchbohren die Wand des Neuralrohrs mit dem Glasmikropipette vor der Injektion von Zellen. Die Schlüsselelemente für den Erfolg dieser Methode sind die Schärfe der Mikropipette und der Plötzlichkeit des Durchbruchs, eine zu langsame Bewegung und der Mikropipette Spitze kann nur Grübchen das Neuralrohr Wand ohne einzudringen.

c. Systemische Injektion

Systemische Injektionen können über die extra-embryonalen Blutgefäßen (ab HH Stufe 15, wenn diese Schiffe gut entwickelt sind) vorgenommen werden. Dies ist nicht selten von einigen Blutungen begleitet und da es viele kleine Arterien und weniger größeren Adern sind, sind intra-arterielle Injektion in der Regel sicherer, wenn es um den Embryo das Überleben geht. Auf der anderen Seite bieten intravenöse Injektionen schnelleren Zugriff der Zellen des Herzens und damit vermutlich eine gleichmäßigere Verteilung der Zellen. Eine erfolgreiche Injektion erfordert einen scharfen Mikropipette mit einem Durchmesser kleiner als das Schiff gezielt. Nähern Sie sich dem Schiff entlang ihrer Achse in einem kleinen Winkel aus der Horizontalen (ca. 30 Grad). Drücken Sie die Mikropipette gegen das Schiff, bis das Schiff beginnt zu verschließen. Dann weiter voranzutreiben in einen festen, abrupte Bewegung zu durchdringen. Einfahren langsam, bis das Blut gesehen, durch die Kapillarwirkung in die Spitze der Mikropipette zu ziehen. Die Injektion von Zellen sollten dann unter Verwendung konstanter Druck, nach denen die Mikropipette mit einer schnellen Bewegung zurückgezogen wird.

8. Sealing das Ei

1. Nach der Injektion, lassen das Ei stehen noch für ein paar Minuten, damit sich die injizierten Zellen, sich niederzulassen und zu halten. Zur Vermeidung von Dehydrierung (die können schnell auftreten und tödlich), lag ein Stück angefeuchteten Tuch oder Filterpapier über dem Fenster während dieser Ruhezeit.
2. Nach ein paar Minuten, und die Zellen angesiedelt haben, trocknen Sie die Schale um das Fenster und Abdichtung der Fenster mit herkömmlichen Kunststoff-Band. Achten Sie darauf, dieses Siegel ist eng und dass kein Albumin durch die Öffnung oder zwischen der Schale und dem Band (dies erweist sich oft als während der anschließenden Inkubation tödlich) auslaufen.
3. Ersetzen Sie die Eier auf die Zwangs-Entwurf Inkubator für die weitere Entwicklung. Die Beobachtung kann in Abständen durch das Entfernen des Bandes über die Fenster erfolgen.

9. Embryo Dissektion

1. Sobald der Embryo die gewünschte Stufe erreicht, knacken das Ei in eine Schüssel mit eiskalter physiologischer Kochsalzlösung oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (das Band für den Fenster sollten zuerst geschnitten werden, um die beiden Hälften der Eierschale zu trennen lassen). Das eiskalte Kochsalzlösung dient dazu, den Embryo durch Unterkühlung zu betäuben. Das Herz sollte schnell verlangsamen und zu stoppen innerhalb von ein paar Minuten.
2. Separate der Embryo aus der extraembryonalen Membranen und Stadium mit ref. 11.
3. Enthaupten des Embryos, die Übertragung auf einen Dissektion Gericht, dass eine Silikon-Kautschuk Boden hat und enthält Sauerstoff physiologischer Kochsalzlösung mit Glucose (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl _2, 1 mM MgCl _2, 1 mM Na-Phosphat, 5 ergänzt mM HEPES, 11 mM Glucose, pH 7,4) und stecken Sie es schnell Bauchseite auf. Entfernen Sie die Bauch-und Brustorgane. Mit einer abgewinkelten Schere, machen Längsschnitten entlang jeder ventrolateralen Aspekt der Wirbelsäule. Besonders in späteren Phasen (nach Tag 6 der Entwicklung), ist der erste Schnitt am besten in der lumbosakralen Region, wo der Raum zwischen den Wirbeln und das Rückenmark am größten ist gemacht. Entfernen Sie die ventral der Wirbelsäule mit dem Rückenmark zu offenbaren. Stellen Sie sicher, dass die physiologische Kochsalzlösung Sauerstoff durch Einblasen von etwa 10-minütigen Intervallen mit reinem medizinischen Sauerstoff bleibt.
4. Schneiden Sie vorsichtig die entstehende dorsalen und ventralen Wurzeln auf beiden Seiten, Transekt das Rückenmark an das gewünschte Niveau, und heben Sie sie vorsichtig aus dem Wirbelkanal. Das Rückenmark wird für viele Stunden in diesem Zustand überleben und können anatomische ¹² und physiologischen ^13,14 Experimenten unterzogen werden.

Abbildung 1. A) Der geeignetste Ansatz für die Evakuierung von Albumin. Beachten Sie die Position des Embryos und die Platzierung der Nadel. B) Gegenüberstellung des Embryos. Beachten Sie das Eindringen der Nadel außerhalb der Keimscheibe. C) Schematische Darstellung des Verfahrens zur einseitigen Rückenmark Neuralrohr Läsion durch Stammzelltransplantation gefolgt.

Diskussion

Der Hühnerembryo ist eine praktische und vielseitige Tiermodell für die Xenotransplantation Experimente. Das Fehlen eines funktionierenden Immunsystems während der embryonalen und fetalen Entwicklung ermöglicht das Überleben und die Entwicklung von Zellen aus jeder Art, die Inkubationstemperatur toleriert. Hühnerembryonen wurden verwendet, um das regenerative Potenzial von verschiedenen Arten von Stammzellen (in Lit.. 15) zu testen. Mammalian Stammzellen können in Hühnerembryo Geweben, einschließlich des zentralen Nervensystems, wo sie entstehen Neuronen, deren Axone Prognosen geben kann integrieren, kann synaptischen Konnektivität und elektrophysiologischen Eigenschaften in Zusammenhang mit der funktionellen neuronalen Schaltkreisen ^1,2 beurteilt werden.

Da die chirurgische Verfahren relativ einfach sind, und Injektionen sind unter visueller gemacht anstatt stereotaktischen Kontrolle, kann die Anzahl der Embryonen leicht erhöhte sich auf verschiedenen experimentellen Bedingungen in einem einzigen Experiment unterzubringen. Typischerweise Zellen lassen sich in 20-30 Embryonen innerhalb eines 4-Stunden-Experiment injiziert werden. Die Nacheinspritzung Sterblichkeit der Embryonen ist der wichtigste limitierende Faktor. Es müssen Vorkehrungen getroffen, um die Blutung und Austrocknung zu vermeiden. Seien Sie sich bewusst, dass es bestimmte kritische Entwicklungsstadien, bei dem die natürliche Sterblichkeitsrate erhöht. Ergänzend zu den Embryo mit ein paar ml warmes, sterilisiert Huhn ringer nach der Injektion und am Tag vor kritischen Entwicklungsphasen, sowie die Gewährleistung, dass das Fenster in das Ei gut verschlossen und ausgerichtet ist, um ein Auslaufen zu vermeiden, verbessert das Überleben. Wenn das Leck durch das Band Dichtung auftreten, entfernen Sie das Klebeband, trockenen Oberflächen und re-Band. Einige Forscher verwenden Wachs und Glas oder Kunststoff Deckgläser, um das Fenster zu versiegeln. Die Sterblichkeit ist nicht wesentlich anders injiziert gegenüber scheinoperierten Embryonen.

Obwohl wir hier auf der Injektion von menschlichen Stammzellen in die Anlage des Gehirns und des Rückenmarks konzentriert haben, können Stammzellen auch in der Anlage des anderen Organen (siehe zum Beispiel ref. 4) injiziert werden. Jedes Organ stellt seine eigenen Herausforderungen. Zum Beispiel kann die Injektion in das Herz wegen der hohen mechanischen Widerstand gegen das Eindringen Pipette und wegen der Bewegungen, die auf der anderen Seite durch Abkühlen der Embryonen auf Raumtemperatur vor der Injektion verlangsamt werden kann eine Herausforderung sein. Organe, die ein Lumen Mangel kann nicht unterbringen die Injektion von ausreichenden Mengen und können daher eine chirurgische Läsion zu einer Aufnahme zu erstellen. In unserer Erfahrung ist post-Läsion Geweberegeneration ein Vorteil, weil sie die Integration der menschlichen Stammzellen fördert in das Gewebe. Es können auch Zellen in embryonale Mesenchym wie die Dispergierung somitic Mesenchym oder die Migration Neuralleiste als eine Möglichkeit zur Einbindung in mesenchymale Derivate, einschließlich Neuralleiste stammenden peripheren Ganglien ^16,17 erreichen injiziert werden.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent microscope	Microscope	Olympus Corporation
Stereo Investigator	Program	MBF Bioscience
MIP-GFP mice	Mice	Jackson Laboratory
Mathematica	Program	Wolfram
Image J	Program	National Institutes of Health
Slidebook	Program	Olympus Corporation