Ксенотрансплантация из стволовых клеток человека в куриный эмбрион

Резюме

В этой статье мы представляем метод пересадки стволовых клеток человека в различных регионах центральной нервной системы куриного эмбриона. Это обеспечивает В естественных условиях Модель для оценки пролиферации и дифференцировки различных типов стволовых клеток человека в эмбриональном средах тканей.

Аннотация

Куриный эмбрион классической модели животных для изучения нормального эмбрионального и развитие плода и для ксенотрансплантации эксперименты по изучению поведения клеток в стандартизированных

протокол

1. Выделение и культуры стволовых клеток человека и подготовки к инъекции в эмбрионы

1. Человека стволовые клетки используются в качестве примеров в данном протоколе (головного мозга, жировой, костный мозг) являются изолированными различными способами из различных тканей. Например, взрослые нервные стволовые клетки выделяют из тканей части собраны из желудочка стену мозга во время эндоскопической нейрохирургии, которые затем диссоциирован отдельных клеток, которые культивируются в лабораторных условиях. Нервные стволовые клетки самопроизвольно образуют нейросферы, которые плавают в культуральной среде, в то время как другие типы клеток придерживаться дно тарелки ^7. Жировая полученные мезенхимальные стволовые клетки получают из липосакции материал, который является ферментативно переваривается и напряженным для удаления фиброзной ткани, а затем центрифугировали для удаления зрелые адипоциты. В результате клетки ресуспендируют в культуральной среде с сывороткой дополнен способствовать пролиферации стволовых клеток по сравнению с другими типами клеток ⁸ гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток может быть изолирован от аспирата костного мозга положительного отбора с использованием специфических антител, конъюгированных с магнитными частицами (Myltenyi Biotec, Германия или Dynal-Invitrogen, США) и магнитной сепарации клетки, и / или с помощью антител, конъюгированных с флуорофоров и флуоресценции активирован сортировки клеток (FACS) ^9.
2. Для облегчения последующей идентификации, этикетка стволовых клеток с флуоресцентным маркером до имплантации в куриных эмбрионах. Стволовые клетки могут быть помечены флуоресцентным липофильных красители, такие как DII (Invitrogen, США) или PKH26 (Sigma, США) с использованием рекомендованных поставщиком протоколов до незадолго до имплантации, или, для постоянного этикетке практически без опасности загрязняющих клетках-хозяевах, они могут быть трансдуцированных с геном флуоресцентного белка, как зеленый флуоресцентный белок, используя лентивирусов векторов, в то же время в культуре ^10.
3. Протоколы для культуры и распространения стволовых клеток человека меняться. Подробные протоколы можно найти в литературе. Короче говоря, сфера формирования стволовых клеток, как правило, выращивают в колбах, в то время как приверженец стволовые клетки, как правило, выращивают в чашках Петри (который облегчит растирание, когда расщепление, см. ниже), в соответствующей среде. Для расщепления или сбора, пеллет сфере клеток, образующих на 5 мин центрифугирования при 1200rpm и ресуспендируют в подогретого трипсин / ЭДТА решение для не более 5 минут при температуре 37 градусов по Цельсию. Для прилипшие клетки добавить трипсин / ЭДТА решение чашке Петри, и растирают в конце 5 минут. Завершить трипсинизации добавлением Са ^{2 +-среде,} содержащей, иногда дополняется с альбумином. Для удаления трипсин / ЭДТА, центрифуги клетки (5 мин при 1200rpm), удалите супернатант, ресуспендируют в холодной автомобиля инъекции (обычно среднего или фосфатно-солевом буфере), и центрифуга снова (5 мин при 1200rpm). Удалите большую часть этого супернатант и осторожно ресуспендируют клетки для создания высокой концентрации клеточной суспензии.
4. Держите подвески стволовых клеток человека в маленьком, увенчанный флакон или микроцентрифужную пробирку на льду в течение нескольких часов перед инъекцией. Выживание в этом состоянии может быть типа клеток-зависимыми. Инъекции транспортное средство должно быть оптимизированы в соответствии со свойствами клеток, в том числе их адгезии (например, низко-Са ^{2 +} транспортное средство может помочь предотвратить слипание) и устойчивость к гипоксии и изменения рН.

2. Инкубации яиц и приготовления

1. Магазин оплодотворенных яиц в холодильной камере (например: Termaks, Берген, Норвегия) в 14-15 ° C до инкубации. При этой температуре развитие арестован до инкубации начинается. Оплодотворенные яйца хранить в течение более 10 дней или при более низких температурах, имеют более низкий уровень последующего развития и выживания.
2. Чтобы возобновить развитие, место яйца в увлажненных, принудительной тягой инкубатора (например: Биндер, Нью-Йорк, США) при 38-39 ° С, и инкубировать до нужной стадии развития будет достигнут (для постановки, см. ссылку 11. ).
3. Перед открытием яйцо, создать воздушный карман над эмбрионом, вставляя 18 калибра иглу шприца через яичной скорлупы (не слишком глубоко, чтобы избежать пирсинг желток) и эвакуации 4 мл альбумина (рис.). Это создает перепад давления, что в течение нескольких минут выравнивается путем попадания воздуха через пористую оболочку. Как воздух попадает она собирает на самой высокой точке в пределах оболочки, отделяя эмбриона от внутренней поверхности оболочки.
4. Печать дыру, возникшую в шприц иглой с обычной пластиковой лентой.

3. Тяговая стеклянные микропипетки

1. Вытяните стекла микропипетки из боросиликатного стекла (например, 1,2 мм диаметр х 0,94 мм ID, Гарвардский аппарата, США) обычным съемником электрода (например, модель P-2000, Саттер Instruments, США). Отрегулируйте съемник настройки для получения микропипетки, которые имеют высокое входное сопротивление при использовании в качестве microelectrodes. Советы должны быть примерно 1-1,5 см длиной. Валы могут быть отмечены на 1 мм интервалов для расчета объемов выброса.
2. Перерыв микропипетки советов, реальные размеры, сгибая их с пинцета или толкать их от твердой поверхности при просмотре под микроскопом. Перерыв должен быть как можно ровнее по всему периметру стекла и результирующий внутренний диаметр на кончике должны учесть размеры клетки, которые будут использоваться без получения забиты. Обычно 20-30 микрон внутренний диаметр работает хорошо.

4. Подготовка Быстрый зеленый раствор красителя (контрастный реагент)

1. Подготовка 0,1% (м / о) решение Быстрый зеленый краситель (Sigma-Aldrich, США), растворяя в курином физиологическим раствором (137 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl _2, 1 мМ MgCl _2, 1 мМ Na- фосфат, 5 мМ HEPES, 11 мМ глюкозы, рН 7,4).
2. Фильтры Быстрый зеленый раствор через 0,22 мкм Millex GP фильтр (Millipore Ко, Бедфорд, США).

5. Открытие яйца и контрастные эмбриона

1. Положите два куска ленты на верхней части яйца, охватывающих размеров карманного воздуха. Хранение яйца ориентированы так, что выявляется области (и, следовательно, воздушный карман) является верхним, вырезать небольшое окно в границах выявляются области с помощью ножниц крепкий рассечение. Лента добавляет поддержку и помогает предотвратить фрагменты из яичной скорлупы, падающий на эмбрион. Пузырьки воздуха, связанное с воздуха карман может быть очищен использованием задней части пластмассовым наконечником пипетки или другого тупого зонда.
2. Нарисуйте несколько Быстрый зеленый раствор в 1 мл шприц с иглой 25. Удалите пузырьки воздуха в шприц и иглу. Согните иглу под углом 45 градусов, проникают в точке вне эмбриональные пластины (определенных кольцо кровеносные сосуды, которые ограничивают ее, пирсинг в течение эмбриональной смертности пластины увеличивается) и тщательно руководство острие иглы под эмбриона. Inject красителя до желаемой контраст достигаются. Эмбрион, который обычно прозрачная, теперь должны выделяться как беловатые призрак против темно-зеленый цвет (рис. B). Многие исследователи использовать тушь (разбавленной на 10% объем / объем), а не быстрое Грин. В этом случае важно использовать тушь, который не является токсичным, таких как Pelikan Ink Источником Индии.

6. Создание заднего мозга и спинного мозга нейронных повреждений трубки

1. Продукция заостренными иглами вольфрама пламенем травления короткие (2-3 см) штук 100 мкм, диаметр вольфрамового стержня (каталожный номер 719000, и R Systems, Сиэтл, Вашингтон), с ацетилен / кислород факел. Это делается путем вставки конец стержня очень кратко в факел пламени, пока искры видно, что представляет взрывных эрозии внешних слоев вольфрама, оставляя за собой острый кончик.
2. Использование заостренными вольфрамовой иглой, срез и отвлечь желточной оболочки, покрывающей область для микрохирургии.
3. Использование второго заостренными вольфрамовой иглы (кончик иглы первых, иногда оставляет после рассекая желточной оболочкой и не подходит для последующей микрохирургии), вырезать осторожно через эпителий вышележащих нервной трубки и устранить ее, а затем вырезать вокруг и под кусок нервной трубки должны быть удалены, используя короткие, быстрые удары вверх (рис. C). Создание поперечные разрезы, а потом продольными разрезами, как правило, наиболее успешными. Не режьте слишком глубоко или вы рискуете проникающее основных кровеносных сосудов, которое обычно приводит к летальному исходу.
4. Аккуратно переверните или перетащить резекции ткани кусок от поражения сайт с помощью вольфрамовой иглы. Если это окажется трудным, он также может быть удален через рот всасывания с помощью стеклянной микропипетки прилагается к гибкому шлангу.

7. Инъекции стволовых клеток человека

a. Инъекция в поражении нервной трубки

Нарисуйте небольшое количество клеток в кончике стеклянной микропипетки в рот всасывания использованием пластиковой трубки. Рабочая концентрация суспензии клеток должна быть оптимизирована для клеточного типа, который будет введен. Горы микропипетки на микроманипулятора и подключить его к microinjector насоса (например: PV830 пневматический PicoPump, WPI, Вашингтон, США). Под визуальным контролем использованием рассечение микроскоп, руководство микропипетки наконечник в поражении и тщательно изгнать клетки за счет увеличения давления воздуха (либо импульсами постоянного давления или постепенно наращивают давление) (рис. C). Когда нужное количество клеток на хранение в поражении сайта, тщательно снять микропипетки.

b. Инъекция в просвет нервной трубки

В некоторых случаях может быть желательно вводить клетки в развивающихся желудочки головного мозга, например, если клетки являются инвазивными достаточно, чтобы получить доступ к нервной ткани при отсутствии поражений. Введение клеток в просвете любой брайн регионе требует использования стадии развития, при котором просвет обеспечивает достаточно большой емкостью и легко доступен; HH этапах от 12 до 18 являются благоприятными в этом отношении. Поражение не является необходимым. Просто прокалывают стенку нервной трубки со стеклянной микропипетки перед инъекцией клеток. Ключевые элементы для успеха этого метода резкость микропипетки и резкостью проникновения; слишком медленным движением и наконечника микропипетки могут только ямочка нейронных стенки трубы, не проникая.

c. Системное введение

Системная инъекции могут быть сделаны через экстра-эмбрионального кровеносных сосудов (начиная с HH стадии 15, когда эти сосуды хорошо развиты). Это не редкость в сопровождении некоторых кровотечение и, поскольку Есть много мелких артерий и меньше больших венах, внутриартериального инъекции, как правило, безопаснее, когда речь идет о выживании эмбриона. С другой стороны, внутривенные инъекции обеспечивают более быстрый доступ в клетки сердца и поэтому, вероятно, более равномерное распределение клеток. Успешных инъекций требует резкого микропипетки с диаметром меньше, чем судно целенаправленными. Подход судна вдоль своей оси под небольшим углом в горизонтальной (около 30 градусов). Нажмите микропипетки против судна, пока судно начинает смыкаться. Затем нажмите далее в фирме, резким движением проникнуть. Уберите медленно, пока кровь видели привлечь под действием капиллярных сил на кончике микропипетки. Инъекции клеток должна быть выполнена с использованием постоянного давления, после чего микропипетки убирается с быстрым движением.

8. Уплотнительная яйцо

1. После инъекции, не говоря яйцо стоит на месте в течение нескольких минут, чтобы дать вводили клетки для проведения расчетов и придерживаться. Чтобы избежать обезвоживания (которые могут возникать быстро и может привести к фатальным последствиям), лежал кусок смоченной тканью или фильтровальной бумаги на окне в течение этого периода отдыха.
2. После нескольких минут, а клетки осели, сухая оболочка вокруг окна и уплотнения окна с обычными пластиковую ленту. Убедитесь, что эта печать является жесткой и, что ни альбумина может просочиться через отверстие или между корпусом и лентой (это часто оказывается фатальным в течение последующей инкубации).
3. Замените яйца принудительного проект инкубатора для дальнейшего развития. Наблюдение может быть сделано с интервалами, удаляя ленту окна.

9. Эмбрион рассечение

1. Как только зародыш достиг желаемого этапе вскрывать яйца в миску ледяную физиологический раствор или фосфатно-солевом буфере (ленту, закрывающую окна должны быть сокращены, чтобы первые две половинки скорлупы отделить). Ледяной солевой служит для обезболивания эмбриона гипотермии. Сердце должно быстро медленный и останавливаться в пределах нескольких минут.
2. Отдельные эмбриона от экстраэмбриональных мембран и стадии его с помощью ссылок. 11.
3. Обезглавьте эмбриона, перенести его на вскрытие блюдо, которое имеет пола силиконовой резины и содержит кислород физиологический раствор с глюкозой (137 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl _2, 1 мМ MgCl _2, 1 мМ Na-фосфат, 5 мМ HEPES, 11 мМ глюкозы, рН 7,4) и пин-код это быстро вентральной стороной вверх. Удалить брюшной и грудной внутренних органов. Использование угловыми ножницами, сделать продольные разрезы вдоль каждой вентролатеральной аспект позвоночника. В частности, на более поздних стадиях (после 6-й день развития), начальный разрез лучше всего сделать в пояснично-крестцовой области, где пространство между позвонками и спинного мозга является наибольшей. Удалить вентральной аспект позвоночника выявить спинного мозга. Убедитесь, что физиологический раствор остается кислородом путем пропускания примерно в 10-минутными интервалами с чистым медицинским кислородом.
4. Аккуратно вырежьте зарождающейся спинной и брюшной корни с обеих сторон, разреза спинного мозга на желаемом уровне, и осторожно выньте его из позвоночного канала. Спинной мозг выживет в течение многих часов в этом состоянии и могут быть подвергнуты анатомические и физиологические ^{12 13,14} экспериментов.

Рисунок 1.) Соответствующий подход для эвакуации альбумина. Обратите внимание на положение эмбриона и размещение иглы. Б) Контрастные эмбриона. Обратите внимание на проникновение точки иглой вне зародышевого диска. С) Схематическое изображение процедуру одностороннего поражения спинного нейронных трубки следуют клеточной трансплантации.

Обсуждение

Куриный эмбрион удобной и универсальной модели животных для ксенотрансплантации экспериментов. Отсутствие функциональной иммунной системы во время эмбрионального развития плода и позволяет выживание и развитие клеток от любого вида, что терпит температуры инкубации. Куриные эмбрионы были использованы для тестирования регенеративный потенциал различных типов стволовых клеток (см. обзор в работе. 15). Млекопитающих стволовые клетки могут интегрироваться в куриных эмбрионов тканей, включая центральную нервную систему, где они могут привести к нейронов, аксонального прогнозы, синаптические связи и электрофизиологические свойства могут быть оценены в контексте функциональных нейронных ^1,2 схем.

Потому что хирургические процедуры могут быть сравнительно легко, и инъекции делаются под визуальным вместо стереотаксической контроля, количество эмбрионов может быть легко увеличивать для размещения различных экспериментальных условиях в рамках одного эксперимента. Обычно клетки могут быть введены в 20-30 эмбрионов в течение 4-часового эксперимента. После инъекции смертности эмбрионов является основным ограничивающим фактором. Меры предосторожности должны быть приняты, чтобы избежать кровотечения и обезвоживание. Имейте в виду, что Есть некоторой критической стадии развития, на которой естественного прироста смертности. Дополнение эмбриона с несколькими мл теплой, стерилизовать куриные звонка после инъекции и за день до критической стадии развития, а также обеспечение того, чтобы окна в яйцо, хорошо запечатанных и ориентированы, чтобы избежать утечки, улучшает выживаемость. Если утечки через уплотнение ленты должно происходить, удалите ленту, сухой поверхности и вновь ленты. Некоторые исследователи используют воск и стеклянные или пластиковые покровные для герметизации окна. Смертность не должна существенно отличаться в вводили против ложнооперированных эмбрионов.

Хотя мы были сосредоточены здесь на инъекции стволовых клеток человека в зачаток головного и спинного мозга, стволовые клетки могут также быть введены в закладки других органов (см., например, ссылка 4). Каждый орган представляет свои собственные проблемы. Например, инъекции в сердце может оказаться непростой задачей из-за высокой механической устойчивостью к проникновению пипетки и из-за движения, с другой стороны может быть замедлен путем охлаждения эмбрионов до комнатной температуры перед инъекцией. Органы, что отсутствие просвета не может разместиться инъекции достаточных объемах и поэтому может потребоваться хирургическое поражения создать сосуд. По нашему опыту, после поражения регенерации тканей является преимуществом, поскольку она способствует интеграции человеческих стволовых клеток в тканях. Клетки могут также быть введены в эмбриональной мезенхимы, такие как диспергирующие somitic мезенхимы или нервного гребня мигрируют как способ добиться включения в мезенхимальных производных, в том числе нервного гребня полученных периферических ганглиев ^16,17.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent microscope	Microscope	Olympus Corporation
Stereo Investigator	Program	MBF Bioscience
MIP-GFP mice	Mice	Jackson Laboratory
Mathematica	Program	Wolfram
Image J	Program	National Institutes of Health
Slidebook	Program	Olympus Corporation