Xenotransplantation בתאי גזע אנושיים לתוך העובר עוף

Summary

במאמר זה אנו מציגים שיטה השתלת בתאי גזע האדם לאזורים שונים של מערכת העצבים המרכזית של העובר עוף. זה מספק In vivo מודל להערכת התפשטות והבחנה של סוגים שונים של בתאי גזע אנושיים בסביבות הרקמה העוברית.

Abstract

עובר התרנגולת הוא מודל חיה קלאסית לחקר ההתפתחות העוברית של העובר תקין לניסויים xenotransplantation ללמוד את התנהגותם של תאים סטנדרטית

Protocol

1. בידוד תרבות בתאי גזע אנושיים לקראת הזרקת לעוברי

1. בתאי גזע האדם לשמש דוגמאות בפרוטוקול זה (, המוח השומן, מח עצם) מבודדים בדרכים שונות מרקמות שונות. לדוגמה, בוגרים בתאי גזע עצביים הם מבודדים מפיסות רקמה שנאספו קיר חדרי המוח במהלך נוירוכירורגיה אנדוסקופי, אשר ניתק ואז תאים בודדים, כי הם מתורבתים במבחנה. בתאי גזע עצביים באופן ספונטני בצורה neurospheres כי לצוף בינוני התרבות בעוד סוגי תאים אחרים לדבוק התחתון של התבשיל ^7. השומן הנגזרות בתאי גזע mesenchymal מתקבלים חומר שאיבת שומן כי הוא מתעכל enzymatically והתאמץ להסיר רקמה סיבית ואז centrifuged להסיר adipocytes בוגרת. התאים המתקבלים resuspended במדיום תרבות בתוספת סרום על מנת לקדם את הפצת בתאי גזע על סוגי תאים אחרים ⁸ גזע hematopoietic ו ובתאים יכול להיות מבודד aspirates מח העצם על ידי בחירה חיובית באמצעות נוגדנים ספציפיים מצומדות כדי חלקיקים מגנטיים (Myltenyi BIOTEC, גרמניה או Dynal-Invitrogen, ארה"ב) והפרדה תא המגנטי, ו / או באמצעות נוגדנים מצומדות כדי fluorophores ותא הקרינה מיון מופעל (FACS) ^9.
2. כדי להקל על זיהוי מאוחר יותר, את התווית בתאי גזע עם סמן פלואורסצנטי לפני ההשתלה לתוך עוברי תרנגולת. בתאי גזע יכול להיות מתויג עם צבעי ניאון lipophilic כגון DiI (Invitrogen, ארה"ב) או PKH26 (Sigma, ארה"ב) באמצעות הספק המומלץ פרוטוקולים עד זמן קצר לפני ההשתלה, או, עבור תווית קבע עם סכנה במהותו של תאים לארח מזהם, הם יכולים להיות transduced עם הגן של חלבון פלואורסצנטי כמו חלבון פלואורסצנטי ירוק, באמצעות וקטורים lentiviral, בעודו תרבות ^10.
3. הפרוטוקולים של התרבות ריבוי בתאי גזע האדם להשתנות. פרוטוקולים מפורטים ניתן למצוא בספרות. בקצרה, בתחום להרכיב בתאי גזע בתרבית בדרך כלל צלוחיות, ואילו בתאי גזע חסיד הם תרבותי בדרך כלל בצלחות פטרי (המאפשרים טחינה דקה כאשר פיצול, ראה להלן), במדיום המתאים. עבור פיצול או קציר, כדור יוצרי גלולה תאים על ידי צנטריפוגה 5 דקות ב 1200rpm ו resuspend בפתרון טריפסין / EDTA מראש התחמם דקות לא יותר מאשר 5 על 37 מעלות צלזיוס. עבור תאים חסיד להוסיף את הפתרון טריפסין / EDTA כדי בצלחת פטרי, ו triturate בסוף 5 דקות. לסיים את trypsinization ידי הוספת Ca ^{2 +} המכילים בינוני, לעתים משלימים עם אלבומין. כדי להסיר את טריפסין / EDTA, צנטריפוגה התאים (5 דקות ב 1200rpm), להסיר את supernatant, resuspend ברכב הזרקה קר (בדרך כלל בינוני או פוספט שנאגרו מלוחים), וכן צנטריפוגה שוב (5 דקות ב 1200rpm). הסר ביותר לכך supernatant בעדינות resuspend התאים ליצור השעיה תא מרוכז מאוד.
4. שמור על השעיית בתאי גזע אנושיים בקבוקון קטן, כתרים או צינור microfuge על הקרח עד כמה שעות לפני הזריקה. הישרדות במצב זה עשוי להיות תלוי בסוג התא. הרכב הזרקה חייב להיות מותאם לפי המאפיינים של התאים, כולל adhesivity שלהם (למשל, רכב נמוך Ca ^{2 +} עשוי לסייע במניעת clumping) והתנגדות לשינויים היפוקסיה ו - pH.

2. ביצת הדגירה והכנת

1. חנות ביצים מופרות בתא הקירור (לדוגמה: Termaks, ברגן, נורווגיה) בשעה 14-15 מעלות צלזיוס לפני הדגירה. בשלב התפתחות זו הטמפרטורה נעצר עד הדגירה מתחילה. ביציות מופרות מאוחסן במשך יותר מ 10 ימים או בטמפרטורות נמוכות יש שיעור נמוך יותר של התפתחות הישרדות עתידיים.
2. כדי reinitiate פיתוח, במקום ביצים humidified, נאלץ טיוטה חממה (לדוגמה: בינדר, ניו יורק, ארה"ב) בשעה 38-39 ° C, ו לדגור עד השלב הרצויה של פיתוח הוא הגיע (עבור הבימוי, ראה נ"צ 11. ).
3. לפני פתיחת הביצה, ליצור כיס אוויר מעל העובר על ידי החדרת מחט מזרק 18 מד דרך מעטפת הביצית (לא עמוק מדי, כדי למנוע פירסינג החלמון) ופינוי 4 מ"ל של אלבומין (איור). זה יוצר ירידה בלחץ כי בתוך מספר דקות הוא השווה של כניסת האוויר דרך הקליפה נקבובי. כאשר האוויר נכנס שהוא אוסף בנקודה הגבוהה ביותר בתוך הקליפה, ובכך להפריד את העובר מן המשטח הפנימי של הקליפה.
4. חותם את החור שנוצר על ידי מחט המזרק עם הקלטת פלסטיק קונבנציונאלי.

3. משיכת micropipettes זכוכית

1. משוך micropipettes זכוכית מן הכוס בורוסיליקט (למשל, OD 1.2 מ"מ x 0.94 מ"מ מזהה, Apparatus הרווארד, ארה"ב) על חולץ אלקטרודה קונבנציונאלי (לדוגמה, דגם P-2000, סאטר מכשירים, ארה"ב). התאם את הגדרות חולץ להשיג micropipettes כי יש התנגדות קלט גבוהה כאשר שימש microelectrodes. טיפים צריך להיות כ 1-1.5 ס"מ. פירים יכול להיות מסומן ב 1 מ"מ במרווחים לחישוב כרכים נפלט.
2. שוברים את עצות micropipette לגודל עביד ידי כיפוף אותם עם מלקחיים או דוחפים אותן על משטח יציב תוך צפייה במיקרוסקופ. הפסקה צריכה להיות כמו אף ככל האפשר מסביב הזכוכית ואת קוטר פנימי שנוצר בקצה צריך להתאים את גודל התאים לשמש בלי סתומים. בדרך כלל בקוטר 20-30 מיקרון הפנימי עובד היטב.

4. הכנת פתרון מהיר צבע ירוק (מגיב מנוגדים)

1. הכן פתרון 0.1% (w / v) של Fast צבען הירוק (סיגמא אולדריץ, ארה"ב) על ידי המסת ב עוף מלח פיזיולוגית (137 mM NaCl, KCl 5 mM, 2 מ"מ CaCl _2, 1 mM MgCl _2, 1 mM Na- פוספט, HEPES 5 מ"מ, 11 גלוקוז מ"מ, pH 7.4).
2. סנן הפתרון הירוק מהיר באמצעות 0.22 מיקרומטר Millex GP המסנן (Millipore ושות', בדפורד, ארה"ב).

5. פתיחת ביצים נוגד את העובר

1. מקום שני חלקים של סרט על החלק העליון של הביצה, מכסה את הממדים של כיס האוויר. שמירה על הביצה אוריינטציה כך את האזור המודבק (ובכך את כיס האוויר) הוא עליון, לחתוך חלון קטן בתוך גבולות האזור מוקלטות באמצעות מספריים לנתיחה חסון. הקלטת מוסיפה תמיכה ומסייע במניעת שברי קליפת ליפול על העובר. בועות האוויר הקשורות כיס האוויר יכול להיות צץ משתמש הקצה האחורי של קצה פיפטה פלסטיק או בדיקה בוטה אחרים.
2. צייר כמה הפתרון הירוק מהיר לתוך מזרק 1 מ"ל עם מחט מד 25. הסר את כל בועות אוויר בתוך המזרק ואת המחט. כופף את המחט לזווית של 45 מעלות, לחדור בנקודה מחוץ לצלחת עובריים (מזוהה על ידי טבעת של כלי הדם להותיר אותה; פירסינג בתוך צלחת מגביר תמותה עוברית) ובזהירות להנחות את הרקמה תחת העובר. להזריק את הצבע עד בניגוד הרצויה. העובר, שבדרך כלל שקופה, צריך עכשיו עומדים בתור רוח רפאים לבנבן נגד צבע ירוק כהה (איור ב '). חוקרים רבים משתמשים דיו הודו (10% בדילול מלא v / v) במקום ירוק מהיר. במקרה זה חשוב להשתמש דיו הודו כי אינו רעיל, כגון דיו פליקן הודו מעיין.

6. ביצוע למוח האחורי ואת חוט השדרה עצביים נגעים צינור

1. תוצרת מחטים טונגסטן חידד על ידי להבה תחריט קצר (2-3 ס"מ) חתיכות של 100 מוט טונגסטן בקוטר מיקרומטר (מספר קטלוג 719000, A & R מערכות, סיאטל, וושינגטון), עם פנס אצטילן / חמצן. הדבר נעשה על ידי החדרת בקצה המוט לזמן קצר מאוד לתוך הלהבה בלפיד עד ניצוץ נתפסת, אשר מייצג את השחיקה נפץ של השכבות החיצוניות של טונגסטן, והותיר אחריו קצה חד.
2. באמצעות מחט חידד טונגסטן, פרוסה דרך להסיט את vitelline קרום המכסה את שטח microsurgery.
3. באמצעות המחט השנייה חידדה טונגסטן (קצה המחט הראשונה ניזוק לעתים קרובות לאחר חיתוך דרך הממברנה vitelline ולא מתאים microsurgery שלאחר מכן), לחתוך בזהירות דרך האפיתל שמעל בצינור העצבי ואת להדוף אותו, ואז לחתוך מסביב ומתחת היצירה של הצינור העצבי להסירו, תוך שימוש בתנועות קצרות, מעלה מהירה (איור ג'). ביצוע הקיצוץ הרוחבי הראשון ולאחר מכן את הקיצוצים האורך הוא בדרך כלל מוצלח ביותר. לא לחתוך עמוק מדי או שאתה חודר סיכון כלי הדם הבסיסי, אשר בדרך כלל היא קטלנית.
4. בעדינות להעיף או לגרור את פיסת רקמה resected מהמקום את הנגע באמצעות מחט טונגסטן. אם זה מוכיח קשה, זה יכול גם להסיר על ידי יניקה הפה באמצעות micropipette זכוכית מחוברת בצינור גמיש.

7. הזרקה של בתאי גזע אנושיים

א הזרקה לתוך הנגע של הצינור העצבי

צייר כמות קטנה של תאים לתוך קצה micropipette כוס ידי יניקה הפה באמצעות צינורית פלסטיק. ריכוז העבודה של השעיה התא חייב להיות מותאם לסוג התא להיות מוזרק. הר micropipette על micromanipulator ולחבר אותו משאבה microinjector (לדוגמה: PV830 PicoPump פניאומטיים, WPI, וושינגטון, ארה"ב). תחת שליטה ויזואלית באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה, מדריך קצה micropipette לתוך הפצע ובזהירות לגרש את התאים על ידי הגדלת לחץ האוויר (או על ידי פולסים של לחץ קבוע או על ידי ramping בהדרגה את הלחץ) (איור ג'). כאשר כמות רצויה של תאים מופקד בתוך האתר הנגע, בזהירות למשוך את micropipette.

ב הזרקה לתוך לומן של הצינור העצבי

במקרים מסוימים זה עשוי להיות רצוי להזריק תאים לתוך החדרים במוח המתפתח, למשל אם התאים פולשניים מספיק כדי לקבל גישה הרקמה העצבית בהעדר נגעים. הזרקה של תאים לתוך לומן של כל brעין האזור מחייבת שימוש השלב ההתפתחותי בו לומן מספק כלי קיבול מספיק גדול הוא לגשת בקלות; בשלבים HH 12-18 הם נוחים בעניין זה. הנגע אינו הכרחי. פשוט לחדור את החומה של הצינור העצבי עם micropipette הזכוכית לפני הזרקה של תאים. המרכיבים העיקריים להצלחה של שיטה זו הם חדות micropipette ואת הפתאומיות של החדירה, גם תנועה איטית ועל קצה micropipette יכול רק גומה בקיר בצינור העצבי ללא חדירה.

ג מערכתית הזרקה

זריקות מערכתית יכול להתבצע באמצעות חוץ עובריים כלי הדם (החל משלב HH 15, כאשר אלה כלי מפותחים היטב). זו אינה יוצאת דופן מלווה על ידי דימום כמה ומאז ישנם עורקים וורידים קטנים רבים יותר ופחות, תוך עורקי זריקות הן בדרך כלל בטוחות יותר כשמדובר ההישרדות של העובר. מצד שני, זריקות תוך ורידי לספק גישה מהירה יותר של התאים ללב ובכך כנראה חלוקה עוד יותר של התאים. זריקה מוצלחת דורשת micropipette חדה עם קוטר קטן יותר מאשר כלי ממוקד. גישת כלי לאורך צירו בזווית קטנה מ האופקי (כ 30 מעלות). לחצו על micropipette נגד כלי השיט עד הספינה מתחיל לחסום. ואז לדחוף עוד בתנועה איתנה, פתאומי לחדור. לסגת באיטיות עד דם נתפסת לצייר על ידי פעולה נימי אל קצה micropipette. הזרקה של תאים ואז צריך להתבצע באמצעות לחץ מתמיד, שלאחריו הוא חזר בו micropipette בתנועה מהירה.

8. איטום הביצה

1. לאחר הזריקה, בואו הביצה לעמוד דום במשך כמה דקות על מנת לאפשר את התאים מוזרקים להתיישב ולפעול. כדי למנוע התייבשות (שיכולה להתרחש במהירות יכול להוכיח קטלנית), להניח פיסת רקמה לח או נייר סינון מעל החלון בתקופה זו לנוח.
2. אחרי כמה דקות והתאים התיישבו, לייבש את מעטפת סביב החלון ולאטום את החלון עם הקלטת פלסטיק קונבנציונאלי. ודא חותם זה חזק כי אלבומין לא יכול לדלוף דרך הפתח או בין הקליפה ואת קלטת (לעתים קרובות זה מוכיח קטלנית במהלך הדגירה לאחר מכן).
3. החלף את הביצים באינקובטור אילצו-טיוטת להמשך פיתוח. תצפית יכול להתבצע במרווחי ידי הסרת סרט על החלון.

9. העובר לנתיחה

1. לאחר העובר הגיע לשלב הרצוי, לפצח את הביצה לתוך קערה של תמיסת מלח פיזיולוגית קר כקרח או פוספט שנאגרו מלוחים (את הסרט מכסה את החלון צריך להיות החתך הראשון כדי לאפשר את שני חצאי קליפת כדי להפריד). מלח קרים כקרח משמש להרדים את העובר על ידי היפותרמיה. הלב צריך במהירות איטית להפסיק בתוך כמה דקות.
2. הפרד את העובר מן הקרומים extraembryonic שלב זה באמצעות נ"צ. 11.
3. לערוף את העובר, ולהעביר אותו אל צלחת לנתיחה בעל רצפת גומי סיליקון והוא מכיל תמיסת מלח פיזיולוגית מחומצן בתוספת גלוקוז (137 mM NaCl, KCl 5 mM, 2 מ"מ CaCl _2, 1 mM MgCl _2, 1 mM Na-פוספט, 5 mM HEPES, גלוקוז 11 מ"מ, ה-pH 7.4) ומהדקת אותו בצד הגחון מהר למעלה. הסר את הקרביים של הבטן החזה. בעזרת מספריים זווית, לעשות חתכים אורכיים לאורך כל היבט ventrolateral של עמוד השדרה. במיוחד בשלבים מאוחרים יותר (אחרי יום 6 של פיתוח), החתך הראשוני הוא עשה הכי טוב באזור lumbosacral שבו חלל בין החוליות וחוט השדרה הוא הגדול ביותר. הסר את ההיבט הגחון של עמוד השדרה כדי לחשוף את חוט השדרה. ודא מלח פיזיולוגיים נותר מחומצן ידי מבעבע על כ 10 דקות במרווחים עם חמצן רפואי טהור.
4. בזהירות לחתוך את השורשים ואת הגב הגחון המתהווה משני הצדדים, transect חוט השדרה ברמה הרצויה, להרים אותו בעדינות מתוך תעלת השדרה. חוט השדרה ישרוד במשך שעות רבות במצב זה יכולה להיות נתונה אנטומי ^13,14 ניסויים ¹² ופיזיולוגיות.

איור 1.) הגישה המתאימה פינוי אלבומין. הערה המיקום של העובר ואת המיקום של המחט. ב) מנוגדים של העובר. הערה נקודת החדירה של המחט מחוץ לדיסק עובריים. ג) ייצוג סכמטי של הליך פגיעה בצינור העצבי השדרה חד ואחריו השתלת תאים.

Discussion

עובר התרנגולת הוא מודל חיה נוח ומגוון ניסויים xenotransplantation. העדר מערכת חיסונית תפקודית במהלך ההתפתחות העוברית ואת העובר מאפשר הישרדות התפתחותם של תאים ממינים כל כך סובל את טמפרטורת הדגירה. עוברי עוף שימשו כדי לבדוק את פוטנציאל ההתחדשות של סוגים שונים של בתאי גזע (הנסקרת נ"צ. 15). בתאי גזע היונקים יכולים להשתלב ברקמות העובר עוף כולל מערכת העצבים המרכזית, שם הם יכולים להצמיח נוירונים אשר התחזיות axonal, קישוריות הסינפטי ומאפיינים אלקטרו ניתן להעריך בהקשר של ^1,2 מעגלים עצביים פונקציונלי.

מכיוון ניתוחים קלים יחסית, מבוצעים תחת זריקות חזותי במקום לשלוט stereotaxic, מספר העוברים יכול בקלות להיות מוגברת כדי להכיל תנאים ניסויים שונים בתוך ניסוי יחיד. בדרך כלל התאים יהיה ניתן להזריק לתוך 20-30 עוברים בתוך הניסוי 4 שעות. תמותה לאחר הזרקה של עוברים הוא הגורם המגביל העיקרי. אמצעי זהירות יש לנקוט כדי למנוע דימום והתייבשות. שימו לב כי ישנם מסוימים בשלבי התפתחות קריטית שבה שיעור התמותה עולה טבעי. להשלים את העובר עם מ"ל כמה הזרקה חם, עיקור עוף הצלצול הבא יום לפני שלבי התפתחות קריטיים, כמו גם להבטיח את החלון הביצה היטב אטום מכוונת כדי למנוע דליפה, משפר הישרדות. אם יש דליפה דרך אטם את הקלטת אמורה להתרחש, להסיר את הסרט, לייבש את המשטחים מחדש הקלטת. חוקרים אחדים להשתמש שעווה זכוכית או פלסטיק coverslips לאטום את החלון. התמותה לא צריך להיות שונה באופן משמעותי לעומת הזריק דמה המופעלים עוברים.

למרות שאנו מתמקדים כאן על זריקה של בתאי גזע אנושיים לתוך anlage של המוח וחוט השדרה, בתאי גזע יכול גם להיות מוזרק anlage של איברים אחרים (ראו נ"צ למשל. 4). כל איבר מציבה אתגרים משלה. לדוגמה, הזרקה לתוך הלב יכול להיות מאתגר בגלל התנגדות מכנית גבוהה פיפטה חדירה ובגלל התנועות, אשר מצד שני יכול להיות האטה על ידי קירור עוברים לטמפרטורת החדר לפני ההזרקה. איברים כי חוסר לומן לא יכול להכיל את הזרקת כמויות מספיקות ולכן עשויים לחייב פגיעה כירורגית כדי ליצור כלי קיבול. מניסיוננו, לאחר הנגע התחדשות רקמות יתרון משום שהוא מקדם את שילובם של בתאי גזע אנושיים לתוך הרקמה. תאים יכולים גם להיות מוזרק mesenchyme עובריים כגון mesenchyme somitic פיזור או הרכס העצבי נודדים כדרך להשיג הכללתו נגזרים mesenchymal, כולל הגרעינים לפסגה הנגזרות עצביים היקפיים ^16,17.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent microscope	Microscope	Olympus Corporation
Stereo Investigator	Program	MBF Bioscience
MIP-GFP mice	Mice	Jackson Laboratory
Mathematica	Program	Wolfram
Image J	Program	National Institutes of Health
Slidebook	Program	Olympus Corporation