96 ألف لوحة حسنا Microtiter القائم على أسلوب تشكيل لمراقبة واختبار قابلية مضاد المبيضات البيض الأغشية الحيوية

Summary

نحن تصف طريقة بسيطة وسريعة وقوية لتشكيل المبيضات البيض الأغشية الحيوية باستخدام 96 لوحات microtiter جيدا وفائدتها في اختبار قابلية مضاد للخلايا داخل الأغشية الحيوية.

Abstract

المبيضات البيض يظل السبب الأكثر شيوعا للالتهابات فطرية في زيادة عدد السكان من المرضى للخطر والمبيضات الآن هو الثالث الأكثر شيوعا العدوى في المستشفيات في الولايات المتحدة. وترتبط مظاهر مختلفة من المبيضات مع تشكيل بيوفيلم ، سواء على أنسجة المضيف و / أو الأجهزة الطبية (القسطرة أي). تشكيل بيوفيلم دلالات سلبية السريرية ، ومحمية داخل خلايا الأغشية الحيوية من الاستجابات المناعية والمضيف من عمل مضادات الفطريات. وقد طورنا نموذجا بسيطا وسريعا وقويا في المختبر لتشكيل C. الأغشية الحيوية albicans به جيدا microtiter 96 لوحات ، والتي يمكن أن تستخدم أيضا لاختبار قابلية بيوفيلم مضاد. قراءات من هذا الاختبار هو اللونية ، على أساس الحد من XTT (أ tetrazolium الملح) بواسطة عملية الأيض نشطة بيوفيلم الخلايا الفطرية. تجربة نموذجية تأخذ ما يقرب من 24 ساعة لتشكيل بيوفيلم ، مع 24 ساعة إضافية لاختبار الحساسية المضادة للفطريات. بسبب بساطتها واستخدام المواد المتوفرة عادة المختبرات والمعدات ، وهذه التقنية نظاما ديمقراطيا البحوث بيوفيلم ويمثل خطوة مهمة نحو توحيد اختبار الحساسية من الفطريات الأغشية الفطرية.

Protocol

1. إعداد C. albicans

C. albicans هو مجموعة الكائنات الحية الدقيقة 1/BSL1 المخاطر. تذكر دائما أن حسن استخدام تقنيات العقيم / معقمة للعمل مع هذه الكائنات الدقيقة ومتابعة الإجراءات المؤسسية في مجال التخلص السليم من المواد بيولوجية.

1. تعد الثقافة بين عشية وضحاها من C. albicans في المتوسط ​​(الخميرة ببتون سكر العنب) YPD السائل ، فحقن مستعمرة واحدة من C. albicans الى 25 مل من YPD.
2. الثقافة في احتضان شاكر المداري (حوالي 180 دورة في الدقيقة) عند 30 درجة مئوية خلال الليل. معظم جيم سوف albicans سلالات خلايا الخميرة تنمو في ظل هذه الظروف.
3. الطرد المركزي الثقافات بين عشية وضحاها (حوالي 3000 دورة في الدقيقة ، 5-10 دقائق) ، وغسل خلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني العقيمة ، وresuspend الكرية النهائي في حوالي 20-25 مل من المتوسط ​​1640 RPMI مخزنة مع 165 ملم إلى 7.0 morpholinepropanesulfonic حامض درجة الحموضة وقبل تحسنت - في 37 (ويشار من الآن فصاعدا هذه الوسيلة لأنها "RPMI 1640" ببساطة) درجة مئوية.
4. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. بعد الفرز ، وإعداد تعليق من الخلايا في مناطق ذات كثافة النهائي من 1.0 × 10 ⁶ خلية / مل RPMI في عام 1640.
   ملاحظة : نظرا لأن الخلايا لديهم ميل إلى تجميع ، فمن المهم أن دوامة بقوة بين الغسيل وقبل pipetting.

2. إعداد اللوحة 96 - جيدا Microtiter لتشكيل بيوفيلم

1. باستخدام ماصة الأقنية إضافة 100 ميكرولتر من C. albicans تعليق في آبار مختارة من 96 لوحة microtiter جيدا (ليالي). لا تضيف إلى الخلايا في العمود 12 بئرا ، وهذه ستكون بمثابة الضوابط سلبية.
2. تغطية لوحة microtiter كامل مع غطاء الأصلي ، مع ختم parafilm ، مكان داخل الحاضنة واحتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. ويمكن تكييف طول حضانة لتصميم التجريبية المحددة. على سبيل المثال ، فمن الممكن لدراسة حركية تشكيل بيوفيلم خلال الفترة من 24 -- 48 ساعة من قبل البذر لوحات متعددة وتجهيز كل لوحة في نقاط زمنية مختلفة (أي 2 ، 4 ، 8 ، 12 ، 24 و 48 ساعة)
3. بعد تشكيل بيوفيلم ، وذلك باستخدام ماصة الأقنية نضح المتوسط ​​بعناية حتى لا تلمس وتعطيل الأغشية الحيوية التي شكلت في كل من الآبار.
4. استخدام لوحات متعددة ماصة يغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني العقيمة (200 ميكرولتر لكل بئر). بدلا من ذلك ، استخدم لوحة microtiter غسالة آلية. بين يغسل ، وخصوصا بعد غسل الماضي ، واستنزاف لوحات في وضع مقلوب بواسطة النشاف مع المناشف الورقية لإزالة أي برنامج تلفزيوني المتبقية. في هذه النقطة يجب أن الأغشية الحيوية التي شكلت في الجزء السفلي من الآبار تكون مرئية بوضوح حتى بالعين المجردة ، ويمكن أيضا تصور باستخدام مجهر مقلوب (الشكل 1). الأغشية الحيوية هي الآن على استعداد لمعالجتها للفطريات المقايسات اختبار الحساسية.
   (إذا كان الغرض الرئيسي من هذه التجربة هو تقييم مدى تشكيل بيوفيلم ، لوحات مستعدون لتتم معالجتها باستخدام الأسلوب اللونية ، ولهذا ، يمكن إضافة كاشف XTT / ميناديون (انظر الخطوة 3 أدناه) ، واللون الناتج قراءة باستخدام قارئ لوحة microtiter).

3. اختبار مضاد للحساسية الأغشية الحيوية

1. من الحلول أو مسحوق الأوراق المالية ، وإعداد العاملين في حل المتوسط ​​1640 RPMI كل مضاد لفحصها. تركيزات عالية النموذجية هي 1024 ميكروغرام / مل لفلوكونازول ، و 16 ميكروغرام / مل لالأمفوتريسين B على حد سواء وcaspofungin. ويمكن استخدام تركيزات مختلفة أخرى عن وكلاء.
2. باستخدام ماصة متعددة ، إضافة 200 ميكرولتر من ارتفاع تركيز عمل مضاد للآبار المناظرة في العمود 1 من كل لوحة تحتوي على microtiter الأغشية الفطرية.
3. إضافة 100 ميكرولتر من 1640 إلى RPMI كل بئر في العمودين 2 إلى 10.
4. إضافة 100 ميكرولتر من RPMI 1640 إلى الآبار في العمود 11.
5. إزالة 100 ميكرولتر من عامل مضاد للفطريات من الآبار من العمود (1) وإضافة إلى الآبار المجاورة في العمود 2 (يحتوي بالفعل 100 ميكرولتر من المتوسط).
6. مزيج جيد من قبل محتويات pipetting صعودا وهبوطا لإجراء التخفيف مضاعفة المسلسل ، وإزالة النصائح.
7. كرر تحريك لليمين حتى آبار العمود 10 ، وبعد ذلك يتم تجاهل حجم النهائي 100 ميكرولتر من الآبار العمود 10 بعد الاختلاط. في هذا السبيل ، تم إنشاء سلسلة من التخفيفات مضاعفة من وكيلك (ليالي) في المصالح ؛ من معظم الآبار تتركز في العمود 1 إلى الأقل تتركز في العمود 10 من الآبار. والأغشية الحيوية دون منازع في العمود 11 بمثابة الضوابط الإيجابية ، والآبار الفارغة في العمود 12 ستكون بمثابة الضوابط سلبية.
8. تغطي لوحات ذات الأغطية لهم ، وختم مع parafilm واحتضان لح -48 24 إلى 37 درجة مئوية.
9. بعد فترة حضانة تغسل الصحون كما في الخطوة قبل 2.4 (PBS × 3).
10. باستخدام ماصة الأقنية إضافة 100 ميكرولتر من XTT / ميناديون حل لتحتوي كل منها على بئر بيوفيلم قبل غسلها وكذلك آبار المراقبة السلبية لقياس X الخلفيةTT - اللونية المستويات.
    1. مستعدة XTT كحل المشبعة بنسبة 0.5 غرام / لتر في اكتات رينغر العقيمة ، وبرنامج تلفزيوني أو المالحة ، الذي يحتاج الى تعقيم فلتر تصفية باستخدام 0.22 ميكرون ، حجم المسام. الحل هو ضوء XTT الحساسة ، ولذلك يجب تغطيتها بورق الألمنيوم أثناء التحضير. أعدت مرة واحدة وتعقيم فلتر ، قسامة في أحجام 10 مل العمل ، وتخزينها في -70 درجة مئوية. حماية الأنابيب من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم. ذوبان الجليد فقط على العديد من الأنابيب اللازمة لإجراء تجربة معينة فقط قبل استخدامه.
    2. مستعدة ميناديون كحل ملي الأسهم 10 في الاسيتون 100 ٪ ، إلى أصغر حجم aliquoted (حوالي 50 ميكرولتر) وتخزينها في -70 درجة مئوية. إعداد الحل XTT / ميناديون فقط قبل استخدامه ، وذلك بإضافة 1 ميكرولتر من محلول المخزون من ميناديون لأنبوب تحتوي على 10 مل من محلول XTT المذوبة.
11. تغطي لوحات في رقائق الألومنيوم واحتضان في الظلام لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
12. تكشف لوحات. باستخدام ماصة الأقنية إزالة 80 ميكرولتر من طاف الملونة الناتجة من كل بئر ونقل في المقابل من الآبار لوحة microtiter جديدة.
13. قراءة لوحة (ليالي) في لوحة microtiter قارئ في 490 نانومتر.
14. حساب الحد الأدنى لاطئة تركيزات المثبطة SMIC50 وSMIC80 ، والتي هي تجمعات الفطريات التي يتم فيها الكشف عن انخفاض بنسبة 50 ٪ أو 80 ٪ في قراءات في المقارنة اللونية لسيطرة الأغشية الحيوية التي شكلت في غياب الدواء مضاد للفطريات (في هذه الحالة قيم العمود 11 ، وتذكر أيضا أن طرح القيم السلبية من الضوابط من الآبار التي تحتوي على 12 في العمود XTT فقط). ويمكن عرض النتائج SMIC كجدول (عزلة متعددة ضد أي مضادات الفطريات متعددة) أو بدلا من ذلك ، يمكن تقديم النتائج لكل فرد الفطرية عزل ضد بعضها مضاد للفطريات مثل رسم بياني عن طريق تثبيط بالتآمر في المئة مقابل تركيز الفطريات.

مثلا : بعد طرح القيم السلبية في السيطرة ، والتطوير التنظيمي متوسط ​​الأغشية الحيوية التي تشكلت في السيطرة العمود 11 هو 1.32. وSMIC50 هو أدنى تركيز الفطريات التي تؤدي إلى الحد من> 50 ٪ في القراءات اللونية ، في هذه الحالة أقل من 1.32 X 50 / 100 = 0.66. وبالمثل ، فإن SMIC80 هو أدنى تركيز الفطريات التي تؤدي إلى الحد من> 80 ٪ في القراءات اللونية ، في هذه الحالة أقل من 1.32 X 0.264 = 20/100.

4. ممثل النتائج

الشكل 1 يبين microphotograph لجيم شكلت albicans بيوفيلم على الجزء السفلي من بئر في لوحة 96 microtiter كذلك اتخذت باستخدام مجهر مقلوب. ويبين الشكل 2 - XTT اللونية قراءات (OD ₄₉₀ القيم) لكل واحد من 11 من الأغشية الحيوية C. albicans نوع السلالة البرية التي تشكلت في كل من الصفوف 8 مختلفة من نفس لوحة 96 microtiter جيدا. الشكل 3 يبين نشاط الأمفوتريسين B بتركيزات مختلفة ضد C. albicans الأغشية الحيوية ؛ تشير الأسهم SMIC50 SMIC80 والقيم.

الشكل 1 (أ) لوحة ويظهر microphotograph التي يتم التقاطها باستخدام كاميرا مثبتة على مجهر مقلوب لجيم albicans بيوفيلم تشكلت على قاع البئر بعد تطلع RPMI المتوسطة وغسيل لاحقة مع برنامج تلفزيوني. (ب) صورة مجهرية لجيم نموذجية تصور albicans بيوفيلم باستخدام المجهر الإلكتروني. الحانات هي 100 ميكرون وميكرون (10) لوحات A و B على التوالي.

الشكل 2. تشكيل جيم يعادل متعددة albicans الأغشية الحيوية في 96 - جيدا لوحات microtiter. اللونية قراءات (OD ₄₉₀ القيم) من XTT الحد من الأغشية الحيوية المقايسات التي شكلتها C. albicans النوع البري في الآبار لوحات microtiter. القيم هي لمدة 11 الأغشية الحيوية المستقلة التي تشكلت في كل من 8 صفوف مختلفة من نفس لوحة 96 microtiter جيدا. وتمت مقارنة النتائج للصفوف مختلفة في اتجاه واحد ، وتحليل التباين باستخدام اختبار بارتليت للتجانس الفروق والمقارنة وBonferroni المتعددة في مرحلة ما بعد الاختبار. ولم يلاحظ وجود فروق ذات دلالة إحصائية عند المقارنة بين كل زوج من الصفوف لبعضها البعض (P> 0.05).

الشكل 3. نموذجي نتائج اختبارات الحساسية ضد الفطريات C. albicans الأغشية الحيوية. رسم بياني يصور النتائج النموذجية لفعالية تركيزات مختلفة من الأغشية الحيوية ضد الأمفوتريسين B لجيم albicans نوع السلالة البرية. كما يتم التعبير عن القيم اللونية قراءات في المئة في المتوسط ​​للحد من المقايسات XTT مقارنة للسيطرة على الآبار. ويشار إلى SMIC50 SMIC80 القيم السهام.

Discussion

نحن هنا وصف بسيط وسريع والاقتصادية واستنساخه غاية 96 لوحة microtiter نموذج جيد لتشكيل الأغشية الحيوية المبيضات مقرونا اللونية الأسلوب الذي يقيس النشاطات الأيضية من الخلايا داخل بيوفيلم XTT به. وقد تم تطوير هذا الأصل 96 لوحة microtiter كذلك نموذجا لتشكيل بيوفيلم لجيم وي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sabouraud-dextrose agar	BD Biosciences	211584	To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates
YPD: Yeast peptone dextrose	US Biological	Y2076	Medium for propagation of overnight liquid cultures
RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine	Cellgro	50-020-PB	Liquid medium for biofilm formation
Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS)	Fisher Scientific	BP308	To buffer RPMI 1640
Phosphate buffered saline, PBS	Sigma-Aldrich	P4417	Buffer for washes
XTT sodium salt	Sigma-Aldrich	X4251	See above for preparation instructions
Ringer’s lactate	Hospira Inc.	NDC0409-7953-09	For preparation of XTT solution
Menadione	Sigma-Aldrich	M5625	Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-12
15 ml conical centrifuge tubes	Corning	430790
50 ml conical centrifuge tubes	Corning	430828
96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated	Corning	3595
Multichannel pipette and tips	Eppendorf
Incubator	Any Supplier
Microtiter plate reader	Any Supplier