一个96孔微孔板为基础的方法监测的形成和抗真菌的药敏试验白色念珠菌生物膜

摘要

我们描述了一个简单，快速和可靠的方法形成白色念珠菌生物膜在细胞内生物膜的抗真菌药敏试验使用96孔板和它的效用。

摘要

白色念珠菌仍然是在一个不断增长的人口对受损的病人和念珠菌的真菌感染最常见的原因，现在是第三大最常见的感染在美国的医院。与生物膜的形成，对宿主组织和/或医疗设备（如导尿管），不同的表现形式的念珠菌。生物膜形成负面的临床意义，生物膜内的细胞是从宿主的免疫反应，保护和抗真菌药物的行动。我们已经开发为C 的形成简单，快速和可靠的体外模型白色念珠菌生物膜使用96孔酶标板，也可用于生物膜抗真菌药物药敏试验。的基础上减少代谢活性真菌生物膜细胞的XTT法（四唑盐）比色法，这个实验的读数。一个典型的实验中生物膜的形成大约需要24小时，与其他抗真菌药物药敏试验的24 h。由于其简单和常用的实验材料和设备的使用，这种技术民主化生物膜研究和代表对真菌生物膜的抗真菌药敏试验标准化的重要一步。

研究方案

1。 C语言的制备白色念珠菌

白色念珠菌是一种风险集团1/BSL1微生物。一定要记住使用工作良好的无菌/灭菌技术，微生物和生物危害材料的妥善处置的后续机构的程序。

1. 准备C.培养过夜C.单菌落接种的YPD（酵母蛋白胨葡萄糖）液体培养基中的白色念珠菌到25 mL YPD 中的白色念珠菌。
2. 在轨道摇床（约180转）在30 ° C过夜孵育文化。大多数C。白色念珠菌菌株酵母细胞将成长为在这些情况下。
3. 离心过夜培养（约3000转，5-10分钟），洗涤细胞两次用无菌PBS，并最终沉淀重悬在约20-25毫升的RPMI 1640与165毫米morpholinepropanesulfonic酸pH值7.0和预热的缓冲介质在37 ° C（从现在开始，这一媒介称为简单“的RPMI 1640”）。
4. 使用hemacytometer计数细胞。点票后，准备在1.0 × 10 ⁶细胞/毫升的RPMI 1640的最终密度的细胞悬液。
   注意：由于细胞有聚集的倾向，这是重要的旋涡之间的洗涤和前吹打大力。

2。为形成生物膜的96孔微孔板

1. 使用多道移液器加100μL的C.白色念珠菌悬浮到96孔微孔板（- S）选 ​​定井。不要添加单元格列12口井，因为这些将作为阴性对照。
2. 覆盖整个微孔板，其原有的盖子，用封口膜密封，24小时内的孵化器和孵化，在37 ° C。孵化的长度可适应特定的实验设计。例如，它是可能的研究超过24期的动力学形成生物膜 - 播种多个板块，并在不同时间点（即2，4，8，12，24和48 h）处理每盘48小时
3. 形成生物膜后，使用多道移液器吸仔细触摸和破坏，在每个井形成生物膜的媒介。
4. 使用多道移液器洗板在无菌PBS（每孔200μL）的三倍。另外，使用自动酶标洗板机。洗之间，特别是最后一次洗涤后，漏印迹用纸巾，以消除任何残留的PBS在一个倒置的位置板。此时生物膜形成井底部应明确，甚至肉眼可见的，也可以可视化使用倒置显微镜（图1）。生物膜现在已经准备好，抗真菌药敏试验分析处理。
   （如果该实验的主要目的是评估生物膜形成的程度，板块已经准备好要处理的使用比色法XTT /甲萘醌试剂（见下面的步骤3）对于这一点，可以增加和由此产生的颜色阅读使用酶标仪）。

3。生物膜的抗真菌药物敏感性测试

1. 从股票的解决方案或粉末，准备在RPMI 1640培养每个要测试的抗真菌的培养基中的一个可行的解决方案。典型的高浓度的1024微克/毫升氟康唑，两性霉素B和卡泊芬净的16微克/毫升。其他浓度，可用于不同的代理。
2. 使用多道移液器，加200μL抗真菌药物浓度高的工作，每个酶标板含有真菌生物膜1栏相应的井。
3. 在2至10列，每孔加入100μL的RPMI 1640。
4. 加入100μL的RPMI 1640在第11栏的井。
5. 取出100μL从列1井的抗真菌剂，并添加到第2列的相邻井（已包含100μL中等）。
6. 移液器向上和向下执行串行一倍稀释拌匀的内容，并删除的提示。
7. 直到10列的井，被丢弃后，最终从第10列的井100μL的体积混合后重复移动。通过这种方式，已经创建了一系列的一倍稀释你的代理人的利益（- S）;最集中在第一列的水井，至少在10列井集中。为所欲为生物膜在第11栏，将作为阳性对照，并在第12列的空井，将作为阴性对照。
8. 盖上盖子，密封封口膜，并培育为24 -48 h板块在37 ° C。
9. 潜伏期后洗前（3 x PBS）板块在步骤2.4。
10. 使用多道移液器加100μLXTT /甲萘醌溶液为背景x测量阴性对照井，每口井以及包含预洗生物膜TT -比色法水平。
    1. XTT法是准备在0.5克/无菌乳酸林格氏液，PBS或生理盐水，这需要使用0.22微米孔径过滤器过滤消毒大号的饱和溶液。 XTT解决方案，对光敏感，因此在制备过程中，应该用铝箔覆盖。一旦准备和过滤消毒，分装成10毫升的工作卷，并存储在-70 ° C。用铝箔保护管。尽可能多管，只为一个特定的实验，在使用前需要解冻。
    2. 甲萘醌准备为10毫米，在100％丙酮原液分装成小卷（约50微升），并保存于-70 ° C。准备XTT /甲萘醌的解决方案，只是在使用前，加入1μL甲萘醌的原液含有10毫升的解冻XTT方案一管。
11. 覆盖铝箔，并在2小时黑暗的孵化板块在37 ° C。
12. 揭示板块。使用多道移液器删除到一个新的微孔板相应的井每口井和转让的彩色上清80μL。
13. 阅读在酶标仪在490 nm处的板（- S）。
14. 计算的无柄的最低抑菌浓度SMIC50和SMIC80，这是在比色读数的50％或80％的跌幅是在控制生物膜在抗真菌药物的情况下形成的比较（第11列的值，在这种情况下检测到的抗真菌浓度，还记得减去12列只含有XTT井值阴性对照）。中芯国际的结果可以作为一个表（即多个菌株对多种抗真菌药物），另外，每一个人对每个抗真菌药物真菌分离结果可以作为图，绘制％，与抗真菌药物浓度抑制。

例如：减去阴性对照值后，在第11列形成的控制生物膜的平均外径为1.32。 SMIC50是最低的抗真菌药物浓度> 50％，比色读数减少，在这种情况下小于1.32 x 50/100 = 0.66。同样，SMIC80是最低的抗真菌药物浓度> 80％，比色读数减少，在这种情况下小于1.32 x 20/100 = 0.264。

4。代表性的成果

图1显示了一个C。显微使用倒置显微镜拍摄在96孔酶标板，白色念珠菌生物膜形成了良好的底部。图2显示了为每个11 A C.生物膜XTT比色法读数（外径₄₉₀值） 白色念珠菌野生型菌株形成，在相同的96孔微孔板的8个不同的行。图3显示了两性霉素B对C.不同浓度的活动白色念珠菌生物膜;箭头指示SMIC50和SMIC80值。

图1（A）A组显示一个A C.倒置显微镜摄像头使用的显微白色念珠菌生物膜形成井底的RPMI培养基，并随后用PBS洗涤后的愿望。 （B）显微镜的一个典型的C。白色念珠菌生物膜的可视化，利用扫描电子显微镜。酒吧面板A和B分别为100微米和10微米。

图2。形成多个相当于C。白色念珠菌生物膜 （外径₄₉₀值）A C.形成生物膜XTT减少检测的色度​​读数在96孔板 。 白色念珠菌野生型微孔板井。值是为8个不同的行相同的96孔微孔板，每年形成11个独立的生物膜。不同的行单向方差分析和使用巴特利特的同质性的差异和Bonferroni多重比较试验后的测试结果进行了比较。指出的相互性（P> 0.05）进行比较时，对所有行，无显着差异。

图3。对C.抗真菌药敏试验的典型结果白念珠菌生物膜图描绘不同的两性霉素B浓度的功效对A C.生物膜的典型结果。 白念珠菌野生型菌株。值表示为平均为百分之X​​TT法相比，控制井减少检测比色读数。 SMIC50和SMIC80值是用箭头表示。

讨论

在这里，我们描述了一个简单，快速，经济和高度重现96再加上一个比色法措施内使用XTT法的生物膜细胞的代谢活动的念珠菌生物膜的形成以及酶标板模型。这96孔酶标板模型生物膜的形成最初的 C 白色念珠菌 ，但可用于其他念珠菌 。和轻松地适用于其他真菌生物。该方法可用于检查多个参数和生物膜形成的影响因素，并估计多个真菌分离和/或突变株生物膜形成能力。...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sabouraud-dextrose agar	BD Biosciences	211584	To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates
YPD: Yeast peptone dextrose	US Biological	Y2076	Medium for propagation of overnight liquid cultures
RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine	Cellgro	50-020-PB	Liquid medium for biofilm formation
Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS)	Fisher Scientific	BP308	To buffer RPMI 1640
Phosphate buffered saline, PBS	Sigma-Aldrich	P4417	Buffer for washes
XTT sodium salt	Sigma-Aldrich	X4251	See above for preparation instructions
Ringer’s lactate	Hospira Inc.	NDC0409-7953-09	For preparation of XTT solution
Menadione	Sigma-Aldrich	M5625	Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-12
15 ml conical centrifuge tubes	Corning	430790
50 ml conical centrifuge tubes	Corning	430828
96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated	Corning	3595
Multichannel pipette and tips	Eppendorf
Incubator	Any Supplier
Microtiter plate reader	Any Supplier